Refine
Has Fulltext
- yes (6)
Is part of the Bibliography
- yes (6)
Year of publication
- 2006 (6) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (6)
Keywords
- G-Protein (2)
- G-protein (2)
- Acetylcysteinderivate (1)
- Activation (1)
- Adrenerger Rezeptor (1)
- Adrenergic Receptor (1)
- Aktivierung (1)
- Beta- adrenergic receptors (1)
- Beta-Receptor subtypes (1)
- Beta-Rezeptor Subtypen (1)
Institute
- Institut für Pharmakologie und Toxikologie (6) (remove)
Die karzinogene Aktivität von Östradiol wurde bereits in mehreren Studien nachgewiesen und scheint das Ergebnis einer Kombination von hormonellen und genotoxischen Mechanismen zu sein. In der vorliegenden Arbeit konnte ein weiterer Mechanismus der Induktion chromosomaler Schäden durch Östradiol festgestellt werden. Es kam in der östrogenrezeptorpositiven Zelllinie MCF-7 zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung der Zellproliferation und Mikrokernsteigerung, als Maß für die chromosomale Schädigung. In der östrogenrezeptornegativen Zelllinie MDA-MB231 konnte weder einer Steigerung der Zellproliferation, noch eine vermehrte Mikrokerninduktion nachgewiesen werden. Die Vermutung ist, dass die Zellen, durch den Proliferationsdruck den Zellteilungszyklus schneller durchlaufen und infolgedessen vermehrt Fehler im Replikationsablauf entstehen können. Zudem können wichtige Reparaturmechanismen oder Zellzykluskontrollpunkte nicht mehr adäquat agieren.
Conjugation of reactive intermediates of drugs with proteins or DNA may result in toxic effects such as hepatotoxicity, agranulocytosis, allergies, tumors, etc. From 1975 to 1999, 2.9% of drugs were withdrawn from the market due to such severe adverse drug reactions. Thus, formation of chemically reactive intermediates is a widely discussed problem in drug development processes. Early detection of potentially toxic compounds is required for drug discovery and drug development. Conjugation of such electrophilic compounds with glutathione (GSH) is one of the most important detoxifying reactions in vivo. Processing of these GSH-conjugates ultimately leads to the formation of renally cleared mercapturic acids, which may also be oxidized to sulfoxides. Thus, mercapturic acids may be generated and detected in vitro and non-invasively in vivo in urine to assess the reactivity of a compound in early stages of drug development processes. Therefore, the aim of this work was to develop and evaluate a HPLC-MS/MS screening method for simple and rapid detection and characterization of known and unknown mercapturic acids and application of the method to several different matrices. Based on the common constant neutral loss (CNL) of 129 Da of all mercapturic acids tested (in negative ion mode), a CNL survey scan was performed using a linear ion trap instrument and was combined with two enhanced product ion (EPI) scans with different collision energies to characterize the detected signals. The CNL resulted from the cleavage between the sulfur and the carbon atom in the N-acetyl-L-cysteine moiety. After optimization of the experimental parameters, the detection limits of the reference substances in rat urine ranged from 0.3 to 15.5 pmol on column (i.e. 20 ng/ml to 800 ng/ml). For in vitro evaluation of the method, the model compounds acetaminophen, diclofenac, bifonazole, clozapine, troglitazone, carbamazepine, and bisphenol A were screened for formation of reactive intermediates and, hence, detection of the corresponding mercapturic acids. To determine possible species- and tissue-specific toxicities, the model compounds were incubated with stimulated neutrophils and with liver microsomes from rats and humans. Species-specific differences were observed in incubations of acetaminophen and diclofenac with rat and human hepatic microsomes. Tissue-specific differences in biotransformation of the model compounds in incubations with human neutrophils and human liver microsomes were observed for diclofenac, carbamazepine, clozapine, and bifonazole. The developed HPLC-MS/MS method was also evaluated in vivo by analysis of rat and human urine. Drug-related mercapturic acids were detected in urine of rats orally treated with acetaminophen (20 mg/kg and 640 mg/kg b.w.) or diclofenac (10 mg/kg and 20 mg/kg b.w.). Human urine samples were analyzed before and after oral administration of a clinically used dose of 500 mg and 50 mg of acetaminophen. Besides detection of the mercapturic acid of N-acetylbenzoquinoneimine (AAP-MA), a second mercapturic acid with m/z 327 occurred dose-dependently in rat and human urine samples after administration of acetaminophen. Further investigations on identification of this metabolite using authentic compounds and comparing their MS/MS mass spectra demonstrated oxidation of AAP-MA to stereoisomeric sulfoxides in vivo. For diclofenac, a novel mercapturic acid with m/z 441 was detected in rat urine samples that was identical to a metabolite obtained in incubations with human neutrophils before. The in vivo formation of this diclofenac metabolite is described here for the first time. In addition, three endogenously formed mercapturic acids were detected and identified. In conclusion, the results of the in vitro and in vivo evaluation demonstrate the advantages of the rapid and generic HPLC-MS/MS screening method for the detection of mercapturic acids, that can be obtained with a minimum of sample preparation and a high throughput in diverse matrices.
Phosducin-like protein (PhLP) gehört zur Phosducinfamilie der G-Protein-betagamma-Regulatoren und kommt in zwei Spleißvarianten vor. Die lange Isoform PhLPlong und die kurze Isoform PhLPshort unterscheiden sich allein durch das Vorhandensein des 81 Aminosäuren langen N-Terminus von PhLPlong. In Versuchen mit gereinigten Proteinen erwies sich PhLPlong als der stärkere Gbetagamma-Inhibitor, während die Bedeutung von PhLPshort nicht bekannt war. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß in transfizierten HEK 293-Zellen PhLPshort die Gbetagamma-vermittelte Signalbildung 20mal stärker hemmt als PhLPlong. Da der zusätzliche N-Terminus von PhLPlong mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die konstitutiv aktive Caseinkinase 2 besitzt, wurde angenommen, daß die lange Spleißvariante in Zellen einer solchen Regulation unterliegt, was sich auf seine Funktion als Gbetagamma-Inhibitor auswirkt. Durch schrittweise Trunkierungen bzw. Serin-/Threonin-Alaninmutationen wurden die potentiellen Phosphorylierungsstellen entfernt, was zur Verbesserung der Gbetagamma-Hemmfähigkeit führte. Der N-terminale Aminosäurenabschnitt Ser-18/Thr-19/Ser-20 wurde dabei als die verantwortliche Stelle identifiziert. In unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, daß PhLPlong in HEK 293-Zellen im Gegensatz zu PhLPshort einer konstitutiven Phosphorylierung unterliegt und durch die Caseinkinase2 katalysiert wird. In dieser Arbeit werden die Phosphorylierung von PhLPlong durch die Caseinkinase2 anhand von rekombinanten Proteinen sowie ihre Kinetik dargestellt. Das Vorhandensein von mRNA der Caseinkinase2 in HEK 293-Zellen zeigt, daß sie in der Zelle exprimiert und somit aktiv ist, was ihre physiologische Bedeutung herausstellt. Eine direkte Gbetagamma-Bindung konnte durch Immunpräzipitation nur für PhLPlong nachgewiesen werden, weswegen für PhLPshort ein alternativer Mechanismus der Gbetagamma-Hemmung angenommen wurde, was in folgenden Arbeiten näher untersucht wurde.
Posttranslationale Modifikation von Phosducin durch den small ubiquitin-related modifier "SUMO"
(2006)
Die Rezeptor vermittelte Aktivierung heterotrimerer G-Proteine ist einer der bedeutendsten Signaltransduktionsmechanismen in vielen Organismen. Die Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren und Agonisten macht eine effektive Kontrolle des einzelnen Signals unumgänglich. Das zytosolische Protein Phosducin bindet beta-gamma-Untereinheiten aktivierter G-Proteine und hemmt damit sowohl Gbeta-gamma-vermittelte Effekte als auch Galpha-vermittelte Effekte. In der vorliegenden Arbeit wurde neben der bekannten 33 kDa Form von Phosducin eine weitere 47 kDa große Form in der Retina und im Herz identifiziert. Hierbei handelte es sich um Phosducin, welches mit dem small ubiquitin-related modifier, SUMO, modifiziert war. Weiterhin wurde sowohl in vitro als auch in zellulären Sytemen gezeigt, dass Phosducin mit einem Molekül SUMO an Lysin 33 modifiziert wird. Durch punktgerichtete Mutation dieser Modifikationsstelle wurde eine SUMOylierungs-defiziente Phosducin-Mutante generiert. Diese Mutante unterliegt einem gesteigerten Turnover im Vergleich zu Wildtyp-Phosducin, welcher auf die verstärke Ubiquitinierung und dem damit verbundenen proteasomalen Abbau der Mutante zurückzuführen war. Dies demonstriert, dass SUMOylierung von Phosducin protektive Wirkung auf dieses Protein hat. Darüberhinaus behindert die SUMOylierung von Phosducin dessen Bindung an Gbeta-gamma-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine. Diese Beobachtungen erlauben den Schluss, dass SUMOylierung neben der Phosphorylierung ein neuer und wichtiger Mechanismus ist, über den die Verfügbarkeit von Phosducin als G-Protein-Regulator kontrolliert wird.
Eine durch Aktivierung eines G-Protein gekoppelten Rezeptors induzierte Konfirmationsänderung resultiert in einer Signaltransduktion durch das G-Protein zu einem Effektorenzym wie der Adenylylcyclase. In dieser Arbeit konnten Aminosäuren in dem zur G-Protein gekoppelten Rezeptorfamilie zugehörigen beta1-adrenergen Rezeptor identifiziert werden, welche für dessen Aktivierung von Bedeutung sind. Der Analyse von beta1-adrenergen Rezeptormutanten lag die Erkenntnis zu Grunde, dass therapeutisch genutzte Liganden wie Terbutalin, oder das experimentell eingesetzte Broxaterol Agonisten am beta2- und beta3-adrenergen Rezeptor, jedoch Antagonisten am beta1-adrenergen Rezeptor sind. Dieses Verhalten wurde zum Anlass genommen spezifische Aminosäuren zu identifizieren, welche eine bedeutende Funktion in der Aktivierung von beta -Rezeptorsubtypen haben könnten. Nach einem Aminosäurevergleich innerhalb der Familie der beta-adrenergen Rezeptoren konnten Aminosäurepositionen identifiziert werden, die identisch im beta2- bzw. beta3-Rezeptor sind und sich von denen des beta1- Rezeptors unterscheiden und damit das Aktivierungsprofil von Broxaterol und Terbutalin widerspiegeln. Mit zielgerichteten Punktmutationen wurden nun insbesondere im Bereich der Transmembranregionen solche Aminosäuren im beta1-adrenergen Rezeptor durch die entsprechende des beta2- (beta3-) Rezeptors ersetzt. Obwohl keine der getesteten Mutanten Unterschiede im pharmakologischen Bindungsprofil zeigten, konnten vier Mutanten gefunden werden, welche partiell oder vollständig durch Broxaterol oder Terbutalin aktiviert wurden. Die beiden Mutanten I185L sowie D212N konnten mit Broxaterol und Terbutalin aktiviert werden, zwei Liganden, die Antagonisten am beta1- Wildtyprezeptor sind. Außerdem konnten zwei weitere Mutanten, V120L und K253R, durch Terbutalin aktiviert werden. Betrachtet man die Struktur von Terbutalin, so ist dieser Ligand den endogenen Katecholaminen ähnlicher als Broxaterol. Ein Rezeptormodell zeigt, dass die vier relevanten Aminosäuren außerhalb der Ligandenbindungsregion liegen und somit eine direkte Interaktion mit dem Liganden unwahrscheinlich erscheint. Diese These wird durch das im Vergleich zum Wildtyp nicht veränderte Bindungsprofil der beta1-Rezeptormutanten unterstützt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aminosäuren V120, I185, D212 und K253 in der ligandeninduzierten Konfirmationsänderung des beta1-Rezeptors von Bedeutung sind.
Seit langem werden auf das β-adrenerge System wirkende Pharmaka, v.a. β1-Antagonisten und β2-Agonisten, therapeutisch eingesetzt, allerdings sind die pharmakologischen Eigenschaften dieser Stoffe an den drei bekannten β-adrenergen Subtypen teilweise nur unzureichend untersucht. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, vergleichbare pharmakologische Daten für Agonisten (Adrenalin, Noradrenalin, Isoprenalin, Fenoterol, Salbutamol, Salmeterol, Terbutalin, Formoterol, Broxaterol) und Neutrale und Inverse Antagonisten (Propranolol, Alprenolol, Atenolol, Metoprolol, Bisoprolol, Carvedilol, Pindolol, BRL 37344, CGP 20712, SR 59230A, CGP 12177, ICI 118551) an allen drei Subtypen von adrenergen Rezeptoren in einem zellbiologisch identischen Hintergrund zu gewinnen. Dazu stellten wir stabil transfizierte CHO-Zelllinien her, die die einzelnen humanen β-adrenergen Subtypen in vergleichbarer Menge exprimierten. Nach der pharmakologischen Charakterisierung der einzelnen Rezeptorsubtypen erfolgte die Affinitätsmessung von klinisch häufig eingesetzten wie auch experimentell verwendeten Substanzen mit dem unselektiven β-adrenergen Antagonisten 125I-CYP als Radioligand. Darüber hinaus untersuchten wir die β-adrenerg vermittelte Stimulation der Adenylylcyclase in isolierten Membranen dieser Zelllinien. Alle untersuchten Substanzen zeigten charakteristische Bindungs- und funktionale Eigenschaften. Wir konnten nachweisen, dass einige β2- bzw. β3-Agonisten an den anderen Subtypen inversen Agonismus zeigen. Zusätzlich konnten β1-Antagonisten mit agonistischer Aktivität an β2- und β3-AR gefunden werden. Die gewonnenen Daten können somit helfen, klinisch beobachtete Effekte, wie z.B. die unerwünschten Wirkungen der entsprechenden Medikamente, besser zu verstehen. Insbesondere die Ergebnisse am β3-AR sind als Referenz und Ausgangspunkt weiterer Studien an diesem noch relativ wenig untersuchten Rezeptor wertvoll.