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Most of the studies in cell biology primarily focus on models from the opisthokont group of eukaryotes. However, opisthokonts do not encompass the full diversity of eukaryotes. Thus, it is necessary to broaden the research focus to other organisms to gain a comprehensive understanding of basic cellular processes shared across the tree of life. In this sense, Trypanosoma brucei, a unicellular eukaryote, emerges as a viable alternative. The collaborative efforts in genome sequencing and protein tagging over the past two decades have significantly expanded our knowledge on this organism and have provided valuable tools to facilitate a more detailed analysis of this parasite. Nevertheless, numerous questions still remain.
The survival of T. brucei within the mammalian host is intricately linked to the endo-lysosomal system, which plays a critical role in surface glycoprotein recycling, antibody clearance, and plasma membrane homeostasis. However, the dynamics of the duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation and its potential relationship with plasma membrane growth remain poorly understood. Thus, as the primary objective, this thesis explores the endo-lysosomal system of T. brucei in the context of the cell cycle, providing insights on cell surface growth, endosome duplication, and clathrin recruitment. In addition, the study revisits ferritin endocytosis to provide quantitative data on the involvement of TbRab proteins (TbRab5A, TbRab7, and TbRab11) and the different endosomal subpopulations (early, late, and recycling endosomes, respectively) in the transport of this fluid-phase marker. Notably, while these subpopulations function as distinct compartments, different TbRabs can be found within the same region or structure, suggesting a potential physical connection between the endosomal subpopulations. The potential physical connection of endosomes is further explored within the context of the cell cycle and, finally, the duplication and morphological plasticity of the lysosome are also investigated. Overall, these findings provide insights into the dynamics of plasma membrane growth and the coordinated duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation. The early duplication of endosomes suggests their potential involvement in plasma membrane growth, while the late duplication of the lysosome indicates a reduced role in this process. The recruitment of clathrin and TbRab GTPases to the site of endosome formation supports the assumption that the newly formed endosomal system is active during cell division and, consequently, indicates its potential role in plasma membrane homeostasis.
Furthermore, considering the vast diversity within the Trypanosoma genus, which includes ~500 described species, the macroevolution of the group was investigated using the combined information of the 18S rRNA gene sequence and structure. The sequence-structure analysis of T. brucei and other 42 trypanosome species was conducted in the context of the diversity of Trypanosomatida, the order in which trypanosomes are placed. An additional analysis focused on Trypanosoma highlighted key aspects of the group’s macroevolution. To explore these aspects further, additional trypanosome species were included, and the changes in the Trypanosoma tree topology were analyzed. The sequence-structure phylogeny confirmed the independent evolutionary history of the human pathogens T. brucei and Trypanosoma cruzi, while also providing insights into the evolution of the Aquatic clade, paraphyly of groups, and species classification into subgenera.
Es wurde die Wirkung von oxidiertem LDL, ein ausgeprägt atherogen wirkendes Lipoprotein, auf die Zellzyklusregulation von Endothelzellen untersucht. Eine Bestimmung der Proliferation von HUVEC zeigte einen dualer Effekt von OxLDL: Niedrige Konzentrationen (1-50μg/ml)OxLDL führten zu einem Anstieg der Proliferation im Vergleich zu Kontrollzellen,wohingegen es bei höheren Konzentrationen OxLDL (100 und 200μg/ml) zu einem Absterben der Zellen kam. Im Weiteren wurde der Einfluss von OxLDL auf den Zellzyklusinhibitor p27Kip1 mittels Western Blot-Analyse und Oligonukleotid-Transfektion bestimmt.
Tumore von Kopf und Hals gehen weiterhin mit einer schlechten Prognose einher. Im Rahmen einer operativen Therapie tritt Wundsekret (WS) aus, welches der Wundheilung dient. Dieses kann in Kontakt mit Tumorzellen bzw. Resttumor in der Wunde kommen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Frage nach dem Einfluss von Wundsekret auf Zellvermehrung, Chemoresistenzentwicklung, den Zellzyklus und die Induktion einer Epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) in Tumorzellen von Kopf und Hals gestellt.
Hierfür wurde das WS von Tag1 und das WS von Tag 2 im Dotblot auf seine Zytokinzusammensetzung analysiert. Zwei Tumorzelllinien von Kopf und Hals, FaDu und HlaC78, wurden mit WSTag1 und WSTag2 behandelt und untersucht, welche Effekte das WS auf die Zellen hat.
Verwendet wurden ein Proliferationsassay, eine Zellzyklusuntersuchung und Apoptosetestung mittels FACS, eine PCR, ein Spheroidmodell und die Lichtmikroskopie.
Im WS wurden erhöhte Konzentrationen verschiedener Zytokine, insbesondere von IL-6, nachgewiesen. Gezeigt werden konnte eine gesteigerte Proliferationsrate der Tumorzellen unter WS-Behandlung, jedoch keine veränderte Verteilung der Zellzyklusphasen. In HlaC78-Zellen konnte eine vermehrte Vitalität nach Cisplatinbehandlung nachgewiesen werden. In beiden Tumorzelllinien fand sich eine vermehrte Exprimierung von Snail 1, Snail 2 und Vimentin. E-Cadherin wurde vermindert exprimiert. Twist und N-Cadherin wiesen keine Veränderungen auf. Es zeigte sich eine vermehrte Migration der Tumorzellen in die Umgebung. Die Zellen wiesen nach Behandlung mit WS vermehrt mesenchymale Zeichen auf. Es konnte kein Unterschied der Auswirkungen einer Behandlung mit WSTag1 im Vergleich zu einer Behandlung mit WSTag2 festgestellt werden.
Insgesamt scheint WS in Tumorzellen von Kopf und Hals einen EMT-artigen Prozess in Gang zu setzen, also eine partial EMT (pEMT).
Als mögliche Auslöser dieser Veränderungen kommen die im WS nachgewiesenen Zytokine und v. a. IL-6 in Frage.
ZELLZYKLUSEFFEKTE VON MITOMYCIN C Im Rahmen dieser Arbeit sollten die durch Mitomycin C (MMC) exogen induzierten Zellzyklusstörungen mit den endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fanconi-Anämie in unterschiedlichen Zellsystemen (periphere Blutlymphozyten, lymphoblastoide Zellen und Fibroblasten) verglichen werden. Die Zellzyklusanalysen wurden mit der zweidimensionalen Durchflusszytometrie nach dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren durchgeführt. Mit diesem Verfahren ist es möglich zwischen proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen (Ellwart, Stunkel et al. 1981) zu unterscheiden und Verteilungen der Zellen in bis zu vier Zellzyklusphasen mit quantitativer Analyse der Populationen während der G0-G1-, G1-, S- und G2-Phasen zu erfassen (Kubbies 1989). Das Ausscheiden von Zellen aus dem Zellzyklus kann dabei über die Akkumulation in den entsprechenden Phasenanteilen des Zellzyklus erfasst werden. Die Induktion von Zellzyklusstörungen erfolgte mit dem bifunktionellen Alkylanz Mitomycin C. Die Applikation von Mitomycin C (MMC) führte dabei vor allem zu einer dosisabhängigen Zunahme der G2-Phasenanteile der Zellzyklen, was als Akkumulation von Zellen innerhalb dieses Kompartiments zu verstehen ist. Diese Akkumulation konnte bei den durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen mit der abgeleiteten Größe Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) proliferationsunabhängig erfasst werden. Die konzentrationsabhängige Zunahme der G2-Phasenakkumulation und die unterschiedliche Verteilung innerhalb der Zellzyklen wurden mit den beiden Parametern Increased S G2+G2`/GF und Increased S G2/GF festgehalten und ausgewertet. Die Untersuchungen mit peripheren Blutlymphozyten, lymphoblastoiden Zellen (B-LCL) und Fibroblasten von gesunden Kontrollpersonen zeigten, dass sich die durch Mitomycin C induzierten DNA-Schädigungen bei durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen vor allem als G2-Phasenakkumulation darstellen. Demgegenüber lagen die ermittelten Werte der S G2/GF von Fa-Individuen bereits bei Standardzellkulturen über denen der gesunden Versuchspersonen. Vor allem bei den Zellzyklusstudien mit peripheren Blutlymphozyten von Fanconi-Anämie Patienten zeigten sich bereits endogen eine massive Erhöhung der G2-Phasenanteile. Im Vergleich zu den untersuchten Kontrollen war die Mitomycin C induzierte Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen nicht beliebig steigerbar. Die untersuchten Zellsysteme zeigten verschiedene Proliferationsmuster und reagierten mit einer unterschiedlich starken Arretierung von Zellen in den G2-Phasen bei Zugabe von Mitomycin C. Als sensitivste Zellart reagierten subkutane menschliche Fibroblasten bei Applikation von Mitomycin C. Bei den durchgeführten Zellzyklusanalysen zeigte sich aber auch, dass bei hohen Konzentration von Mitomycin C (MMC) die zytoxischen Effekte von Mitomycin C überwiegen und es zu einem starken Rückgang des Zellwachstums kommt. Da die exogen induzierten Zellzyklusstörungen durch Mitomycin C bei gesunden Kontrollpersonen mit den typischen endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fa-Individuen vergleichbar waren, kann als mögliche Ursache für Fanconi-Anämie auf einen DNA-Reparaturdefekt geschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auch Zellen von obligat heterozygoten Fa-Individuen mit dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren untersucht. War bei Fa-homozygoten Patienten bereits endogen die Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen deutlich gegenüber den gesunden Kontrollpersonen erhöht, so konnte dies für Fa-heterozygote Individuen nicht gezeigt werden. Die ermittelten Werte der Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) lagen zwar dabei vor allem bei den untersuchten peripheren Blutlymphozyten und subkutanen Fibroblasten etwas über den Kontrollen. Mit den hier vorgelegten Daten aus den Zellzyklusanalysen war aber keine Unterscheidung zwischen den obligat heterozygoten Fa-Individuen und den gesunden Probanden möglich. Die Ergebnisse stehen dennoch im Einklang mit den zytogenetischen Untersuchungen auf erhöhte Chromosomenbruchraten bei Verdacht auf Fanconi-Anämie.
The DREAM complex plays an important role in regulation of gene expression during the cell cycle. It was previously shown that the DREAM subunits LIN9 and B-MYB are required for early embryonic development and for the maintenance of the inner cell mass in vitro. In this work the effect of LIN9 or B-MYB depletion on embryonic stem cells (ESC) was examined. It demonstrates that LIN9 and B-MYB knock down changes the cell cycle distribution of ESCs and results in an accumulation of cells in G2 and M and in an increase of polyploid cells. By using genome-wide expression studies it was revealed that the depletion of LIN9 leads to downregulation of mitotic genes and to upregulation of differentiation-specific genes. ChIP-on chip experiments determined that mitotic genes are direct targets of LIN9 while lineage specific markers are regulated indirectly. Importantly, depletion of LIN9 does not alter the expression of the pluripotency markers Sox2 and Oct4 and LIN9 depleted ESCs retain alkaline phosphatase activity. I conclude that LIN9 is essential for proliferation and genome stability of ESCs by activating genes with important functions in mitosis and cytokinesis. The exact molecular mechanisms behind this gene activation are still unclear as no DREAM subunit features a catalytically active domain. It is assumed that DREAM interacts with other proteins or co-factors for transcriptional activation. This study discovered potential binding proteins by combining in vivo isotope labeling of proteins with mass spectrometry
(MS) and further analysed the identified interaction of the tight junction protein ZO-2 with DREAM which is cell cycle dependent and strongest in S-phase. ZO-2 depletion results in reduced cell proliferation and decreased G1 gene expression. As no G2/M genes, typical DREAM targets, are affected upon ZO-2 knock down, it is unlikely that ZO-2 binding is needed for a functional DREAM complex. However, this work demonstrates that with (MS)-based quantitative proteomics, DREAM interacting proteins can be identified which might help to elucidate the mechanisms underlying DREAM mediated gene activation.
GAS2L3 was identified recently as a target gene of the DREAM complex (Reichert et al., 2010; Wolter et al., 2012). It was shown that GAS2L3 is expressed in a cell cycle specific manner and that depletion of the protein leads to defects in cytokinesis and genomic instability (Wolter et al., 2012).
Major aim of this thesis was, to further characterize the biochemical properties and physiological function of GAS2L3.
By in vitro co-sedimentation and bundling assays, GAS2L3 was identified as a cytoskeleton associated protein which bundles, binds and crosslinks F-actin and MTs. GST pulldown assays and co-immunoprecipitation experiments revealed that GAS2L3 interacts in vitro and in vivo with the chromosomal passenger complex (CPC), a very important regulator of mitosis and cytokinesis, and that the interaction is mediated by the GAR domain of GAS2L3 and the C-terminal part of Borealin and the N-terminal part of Survivin. Kinase assays showed that GAS2L3 is not a substrate of the CPC but is strongly phosphorylated by CDK1 in vitro. Depletion of GAS2L3 by shRNA influenced protein stability and activity of the CPC. However pharmacological studies showed that the decreased CPC activity is not responsible for the observed cytokinesis defects upon GAS2L3 depletion. Immunofluorescence experiments revealed that GAS2L3 is localized to the constriction zone by the CPC in a GAR dependent manner and that the GAR domain is important for proper protein function.
New interacting proteins of GAS2L3 were identified by stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC) in combination with tandem affinity purification and subsequent mass spectrometrical analysis. Co-immunoprecipitation experiments further confirmed the obtained mass spectrometrical data.
To address the physiological function of GAS2L3 in vivo, a conditional and a non-conditional knockout mouse strain was established. The non-conditional mouse strain showed a highly increased mortality rate before weaning age probably due to heart failure. The physiological function of GAS2L3 in vivo as well as the exact reason for the observed heart phenotype is not known at the moment.
Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes.
The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration.
Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration.
The RS1 protein (gene RSC1A1) participates in regulation of Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 and some other solute carriers. In subconfluent LLC-PK1 cells, RS1 inhibits release of SGLT1 from the trans-Golgi network and transcription of SGLT1. In subconfluent cells, RS1 is localized in the nucleus and the cytoplasm whereas confluent cells contain predominantly cytoplasmic RS1. In the present study, the mechanism and regulation of confluence-dependent nuclear location of RS1 was investigated. Confluence dependent nuclear location of RS1 was shown to be regulated by the cell cycle. A nuclear shuttling signal (NS) in pRS1 was identified that ensures confluence-dependent distribution of pRS1 and comprises nuclear localization signal (NLS) and nuclear export signal (NES). The NLS and NES of RS1 mediate translocation into and out of the nucleus via importin ß1 and CRM1, respectively, and the nuclear/cytoplasmic distribution of the RS1 protein is determined by the nuclear export activity. The adjacent protein kinase C (PKC) phosphorylation site at serine 370 of pRS1 was shown to control nuclear localization driven by NS and is necessary for the differential localization of RS1 in quiescent versus proliferating cells. Basing on the data of site-directed mutagenesis, PKC activation experiments and mass spectrometry analysis of RS1 phosphorylation, the following model of the regulation of RS1 nuclear location in LLC-PK1 cells was proposed. In subconfluent cells, RS1 is actively imported into the nucleus whereas nuclear export of RS1 is not active leading to accumulation of RS1 in the nucleus. After confluence, phosphorylation of serine 370 of pRS1 by PKC takes place leading to enhancement of RS1 nuclear export and predominantly cytoplasmic distribution of the protein in the confluent cells. The confluence-dependent regulation of RS1 localization may control SGLT1 expression during regeneration of enterocytes in small intestine and during regeneration of renal tubular cells after hypoxemic stress. Moreover, the gene expression profiling of mouse embryonic fibroblasts with RS1-/- genotype suggests that transcriptional regulation by RS1 might be important for the cell cycle and cell division. Since RS1 localization depends on the cell cycle, RS1 might play a role in the regulation of the solute carriers during specific phases of the cell cycle.
Elektromagnetische Felder (EMF) sind in der Umwelt des Menschen allgegenwärtig. Unter Verwendung unterschiedlicher Frequenzen bilden sie die Grundlage zahlreicher Technologien und begegnen uns im Alltag in einer Vielzahl von Anwendungen. Eine sehr wichtige Anwendung von EMF ist die mobile Kommunikation. Die hierfür verwendeten Frequenzen liegen im hochfrequenten Bereich und variieren mit dem Mobilfunkstandard. Weit verbreitet ist die GSM- und UMTS-Modulation der zweiten (2G) und dritten Generation (3G). Zum neuesten Mobilfunkstandard zählt LTE (4G).
Aus statistischen Daten geht hervor, dass derzeit weltweit mehr als sieben Milliarden Mobilfunk-Endgeräte existieren. Die weitverbreitete und stetig ansteigende Verwendung dieser Technologien verdeutlicht, dass viele Menschen, darunter auch zunehmend Kinder und Jugendliche, regelmäßig einer Exposition gegenüber EMF ausgesetzt sind. Die wichtigste Expositionsquelle stellt dabei das Mobiltelefon dar, da sich in diesem Szenario die Quelle sehr nah am menschlichen Körper befindet. In der Vergangenheit wurden zahlreiche in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen sowie epidemiologische Studien durchgeführt, um potentielle, nicht-thermische Effekte von Mobilfunkstrahlung auf biologische Systeme beurteilen zu können. Ein vollständiger Konsens konnte auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse jedoch nicht erzielt werden, sodass weiterhin Bedenken zum schädlichen Potential dieser nichtionisierenden Strahlung bestehen. Insbesondere wurden Fragestellungen zu Langzeiteffekten sowie zu Effekten, die speziell bei Kindern eine besondere Rolle spielen, bisher nicht ausreichend adressiert. Kinder können empfindlicher auf Umwelteinflüsse reagieren und sind im Vergleich zu Erwachsenen teilweise höher gegenüber EMF exponiert. Dies gilt vor allem für Kopfregionen, in denen sich das aktive, für die Hämatopoese verantwortliche Knochenmark befindet.
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, den Einfluss von Mobilfunkstrahlung auf das humane blutbildende System zu untersuchen. Im Fokus standen dabei humane hämatopoetische Stammzellen, die mit Frequenzen der Mobilfunkstandards GSM (900 MHz), UMTS (1.950 MHz) und LTE (2.535 MHz) jeweils über einen kurzen (4 h) und einen langen (20 h) Zeitraum und mit unterschiedlichen Intensitäten (0 W/kg, 0,5 W/kg, 1 W/kg, 2 W/kg und 4 W/kg) exponiert wurden. Vergleichende Experimente erfolgten mit Zellen der Promyelozyten-Zelllinie HL-60. Mögliche Effekte wurden mit den Endpunkten Apoptose, oxidativer Stress, Zellzyklus, DNA-Schaden und –Reparatur sowie Differenzierung und Epigenetik in Form von Histonacetylierung bewertet. In keinem der genannten Endpunkte konnten klare Effekte durch Mobilfunkstrahlung ausgemacht werden, weder für die hämatopoetischen Stammzellen, noch für die Zelllinie HL-60. Die einzige Veränderung wurde bei der Quantifizierung von DNA-Schäden beobachtet. Hier zeigte sich nach der Kurzzeitexposition der Stammzellen mit der Modulation GSM eine kleine, aber statistisch signifikante Abnahme der DNA-Schäden verglichen mit der Scheinexposition. Diese Beobachtung ließ sich in weiteren Replikaten jedoch nicht reproduzieren und wurde daher als nicht biologisch relevant eingestuft.
Insgesamt konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Mobilfunkstrahlung mit Frequenzen der verbreiteten Modulationen GSM, UMTS und LTE sowie SAR-Werten, die unterhalb und oberhalb des empfohlenen Sicherheitsstandards liegen und typischerweise bei Handytelefonaten auftreten, keine Effekte in Zellen des blutbildenden Systems unter den gegebenen Versuchsbedingungen induziert wurden. Ein besonderer Fokus lag hierbei auf der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Weiterhin wurden zum ersten Mal humane hämatopoetische Stammzellen für derartige Untersuchungen eingesetzt. Dies hat insofern eine besondere Bedeutung, als hämatopoetische Stammzellen aufgrund ihrer multipotenten Eigenschaften eine breitere Analyse mit Hinblick auf die Kanzerogenese und auf das Immunsystem ermöglichen.
Um über die Mobilfunk-Untersuchungen hinaus die hämatopoetischen Stammzellen besser charakterisieren zu können, sowie die Sensitivität von Blutzellen mit unterschiedlichem Differenzierungsstatus zu analysieren, wurden sie anderen Zellen des blutbildenden Systems (undifferenzierte und differenzierte HL-60-Zellen und TK6-Zellen) gegenübergestellt. Eine Behandlung der verschiedenen Zelltypen mit mutagenen Substanzen zeigte, dass sich die hämatopoetischen Stammzellen in den meisten der untersuchten Endpunkte von den Zelllinien unterschieden. Deutliche Abweichungen zeigten sich beim oxidativen Stress, der DNA-Reparatur und der Histonacetylierung; kein Unterschied konnte dagegen bei den DNA-Schäden beobachtet werden. Eine erste Interpretation der erhaltenen Ergebnisse ist auf der Grundlage der unterschiedlichen Eigenschaften von Zellen mit abweichendem Differenzierungsstatus möglich. Um jedoch eine eindeutige Aussage treffen zu können, müssten noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden.
The Myb-MuvB (MMB) complex plays an essential role in the time-dependent transcriptional activation of mitotic genes. Recently, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP, the transcriptional coactivator of the Hippo pathway, to coregulate a subset of mitotic genes (Pattschull et al., 2019). Several genetic studies have shown that the Hippo-YAP pathway is essential to drive cardiomyocyte proliferation during cardiac development (von Gise et al., 2012; Heallen et al., 2011; Xin et al., 2011). However, the exact mechanisms of how YAP activates proliferation of cardiomyocytes is not known. This doctoral thesis addresses the physiological role of the MMB-Hippo crosstalk within the heart and characterizes the YAP-B-MYB interaction with the overall aim to identify a potent inhibitor of YAP.
The results reported in this thesis indicate that complete loss of the MMB scaffold protein LIN9 in heart progenitor cells results in thinning of ventricular walls, reduced cardiomyocyte proliferation and early embryonic lethality. Moreover, genetic experiments using mice deficient in SAV1, a core component of the Hippo pathway, and LIN9-deficient mice revealed that the correct function of the MMB complex is critical for proliferation of cardiomyocytes due to Hippo-deficiency. Whole genome transcriptome profiling as well as genome wide binding studies identified a subset of Hippo-regulated cell cycle genes as direct targets of MMB. By proximity ligation assay (PLA), YAP and B-MYB were discovered to interact in embryonal cardiomyocytes. Biochemical approaches, such as co-immunoprecipitation assays, GST-pulldown assays, and µSPOT-based peptide arrays were employed to characterize the YAP-B-MYB interaction. Here, a PY motif within the N-terminus of B-MYB was found to directly interact with the YAP WW-domains. Consequently, the YAP WW-domains were important for the ability of YAP to drive proliferation in cardiomyocytes and to activate MMB target genes in differentiated C2C12 cells. The biochemical information obtained from the interaction studies was utilized to develop a novel competitive inhibitor of YAP called MY-COMP (Myb-YAP competition). In MY-COMP, the protein fragment of B-MYB containing the YAP binding domain is fused to a nuclear localization signal. Co-immunoprecipitation studies as well as PLA revealed that the YAP-B-MYB interaction is robustly blocked by expression of MY-COMP. Adenoviral overexpression of MY-COMP in embryonal cardiomyocytes suppressed entry into mitosis and blocked the pro-proliferative function of YAP. Strikingly, characterization of the cellular phenotype showed that ectopic expression of MY-COMP led to growth defects, nuclear abnormalities and polyploidization in HeLa cells.
Taken together, the results of this thesis reveal the mechanism of the crosstalk between the Hippo signaling pathway and the MMB complex in the heart and form the basis for interference with the oncogenic activity of the Hippo coactivator YAP.