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Asymptomatische Bakteriurie (ABU) stellt eine bakterielle Infektion der Harnblase über einen langen Zeitraum dar, die häufig von Escherichia coli hervorgerufen wird, ohne dass typische Symptome einer Harnwegsinfektion auftreten. Um die Charakteristika von ABU E. coli Isolaten genauer zu untersuchen, wurden die Geno- und Phänotypen von 11 ABU-Isolaten verglichen. Außerdem wurden in mehreren aufeinanderfolgenden in vivo-Reisolaten des Modell-ABU Stammes 83972 die Veränderungen im Transkriptom, Proteom und Genom während einer langfristigen Persistenz in der menschlichen Blase charakterisiert. Schließlich wurde der Effekt des menschlichen Wirtes auf die bakterielle Adaptation durch einen Vergleich von in vitro- mit in vivo-kultivierten Stämmen abgeschätzt. ABU-Isolate stellt eine heterogene Gruppe von Organismen dar. Diese können den vier phylogenetischen Hauptgruppen von E. coli sowie unterschiedlichen klonalen Gruppen zugeordnet werden. Dementsprechend unterscheiden sie sich erheblich bezüglich der Zusammensetzung des Genomes, der Genomgröße und auch der Ausstattung mit UPEC-typischen Virulenz-assoziierten Genen. Multi-Lokus-Sequenz-Typisierung legt nahe, dass bestimmte ABU Stämme sich durch Genomreduktion aus UPEC Stämmen entwickelt haben, die eine Harnwegsinfektion mit charakteristischen Symptomen auslösen konnten. Folglich erlaubt die hohe Genomplastizität von E. coli keine generalisierte Betrachtung einzelner Isolate eines Klons. Genomreduktion über Punktmutationen, Genom-Reorganisation und Deletionen resultierte in der Inaktivierung einiger Gene, die für einige UPEC Virulenz-Faktoren kodieren. Dies stützt die Vorstellung, dass eine verminderte bakterielle Aktivierung der Entzündung der Wirtsschleimhaut den Lebensstil von ABU (bei diesen E. coli-)Isolaten fördert. Genregulation und genetische Diversität sind Strategien, die es Bakterien ermöglichen unter sich fortlaufend ändernden Bedingungen zu leben bzw. zu überleben. Um die anpassungsbedingten Veränderungen bei einem langfristigen Wachstum in der Blase zu untersuchen, wurden aufeinanderfolgende Reisolate, denen eine langfristige in vivo-Kolonisierung im menschlichen Wirt beziehungsweise eine in vitro-Kultivierung vorausgegangen ist, im Hinblick auf Veränderungen Genexpression und Genomorganisation analysiert. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass E. coli in der Lage ist, seine metabolischen Netzwerke verschiedenen Wachstumsbedingungen anzupassen und individuelle bakterielle Kolonisierungsstrategien entwickeln kann. Transkriptom- und Proteom-Analysen zeigten verschiedene metabolische Strategien zur Nährstoffbeschaffung und Energieproduktion bei untersuchten in vivo-Reisolaten vom Stamm 83972, die es ihnen ermöglichen, den Wirt zu kolonisieren. Das Zurückgreifen auf D-Serin, Deoxy- und Ribonucleoside sowie die bidirektionale Umwandlung zwischen Pentose und Glucuronat waren hoch-regulierte Stoffwechselwege, die die in vivo-Reisolate mit zusätzlicher Energie für ein effizientes Wachstum in der Blase versorgen. Zudem wurden in dieser Studie die Netzwerke für eine Reaktion auf Abwehrmechanismen des Wirtes erforscht: Erstmals wurde hier die Rolle der Klasse-III-Alkoholdehydrogenase AdhC, bekannt durch ihre Bedeutung bei der Entgiftung von Stickstoffmonoxid, bei der Wirtsantwort während einer asymptomatischen Bakteriurie gezeigt. Aufeinanderfolgende in vivo- und in vitro-Reisolate vom Stamm 83972 wurden ebenfalls bezüglich ihrer Genomstruktur analysiert. Einige Veränderungen in der Genomstruktur der aufeinanderfolgenden Reisolate, die von einer humanen Kolonisierungsstudie stammen, implizieren die Bedeutung einer Interaktion der Bakterien mit dem Wirt bei der Mikroevolution der Bakterien. Dagegen war die Genomstruktur von Reisolaten eines langfristigen in vitro-Kultivierungsexperiments, bei dem sich der Stamm 83972 ohne Wirtskontakt vermehrt hat, nicht von Veränderungen betroffen. Das legt nahe, dass die Immunantwort eine Genomplastizität fördert und somit eine treibende Kraft für den ABU Lebensstil und die Evolution im Harnwegstrakt ist.
Erweiterte Diagnostik bei neuromuskulären Erkrankungen: vom Genpanel zum Whole Genome Sequencing
(2019)
Muskeln und Nerven bilden eine essentielle funktionelle Einheit für den Bewegungsapparat. Neuromuskuläre Erkrankungen lassen sich unterteilen in Krankheiten, denen ein muskuläres Problem zu Grunde liegt, wie zum Beispiel Muskeldystrophien (Muskeldystrophie Duchenne, DMD) und Myopathien (Myofibrilläre Myopathie, MFM), und in Erkrankungen aufgrund von Nervenschädigungen, wie zum Beispiel Neuropathien und spastische Paraplegien (SPG).
In den vier Teilen der vorliegenden Arbeit konnte sowohl das genetische wie auch das phänotypische Spektrum von neuromuskulären Krankheiten erweitert werden. Die dafür verwendeten Methoden reichen von der Sanger-Sequenzierung einzelner Gene über Next-Generation Sequencing (NGS)-Panel-Diagnostik, zu Whole Exome Sequencing (WES) und schließlich zu Whole Genome Sequencing (WGS). Zusätzlich wurde cDNA zur Detektion von Veränderungen im Transkriptom sequenziert.
Im ersten Teil wurde der klinische Phänotyp der Seipinopathien erweitert, der jetzt auch amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und multifokale motorische Neuropathie (MMN) beinhaltet. Dafür wurde eine Panel-Analyse durchgeführt, die eine bekannte Mutation in BSCL2 aufdeckte. Aufgrund des hiermit erweiterten Phänotyps der Seipinopathien sollten Mutationen in BSCL2 auch bei anderen Verdachtsdiagnosen, wie ALS oder MMN, berücksichtigt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass in der Diagnostik SPGs und Charcot-Marie-Tooth Erkrankungen (CMTs) eine Überlappung zeigen und bei der Diagnose von Verdachtsfällen Gene aus beiden Krankheitsbereichen berücksichtigt werden sollten. Die Suche mit Hilfe eines Phänotyp-Filters hat sich dabei als erfolgreich erwiesen. Ungelöste Fälle sollten aber in regelmäßigen Abständen neu analysiert werden, da immer neue Gene mit den Phänotypen assoziiert werden.
Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung von DMD-Patienten mit bisher ungeklärtem Genotyp. Durch eine RNA-Analyse des gesamten DMD-Transkripts wurden tief-intronische Mutationen aufgedeckt, die Einfluss auf das Spleißen haben. Durch diese Mutationen wurden intronische Sequenzen als Pseudoexons in die mRNA eingefügt. Diese Mutationsart scheint häufig unter ungeklärten DMD-Fällen zu sein, in unserer Kohorte von 5 DMD-Patienten wurden in zwei Fällen Pseudoexons entdeckt. Eine Besonderheit besteht darin, dass in der RNA-Analyse immer noch ein Rest Wildtyp-Transkript vorhanden war, wodurch die Patienten vermutlich einen milderen Becker-Phänotyp aufweisen. Ein weiterer ungeklärter DMD-Fall konnte durch die Sequenzierung der gesamten genomischen Sequenz aufgeklärt werden. Es wurde eine perizentrische Inversion entdeckt (46,Y,inv(X)(p21.1q13.3). Dies zeigt, dass WGS auch zur Detektion von großen Strukturvariationen geeignet ist.
Im dritten Teil wurden Spleißmutationen untersucht. Spleißmutationen wurden bisher nicht in TMEM5-assoziierter alpha-Dystroglykanopathie beschrieben und somit als neue Mutationsart für diese Erkrankung nachgewiesen. Dabei wurde auch die funktionelle Exostosin-Domäne in TMEM5 bestätigt. Eine RNA-Untersuchung verschiedener Spleißmutationen zeigte, dass Spleißmutationen häufig zu einem veränderten Transkript führen, auch wenn diese Mutationen weiter von der Konsensussequenz entfernt sind. Spleißmutation sollten daher häufiger in der Diagnostik berücksichtig und überprüft werden.
Im letzten Teil wurde eine strukturierte Diagnostik von MFM-Patienten beschrieben und neue Kandidaten-Gene für MFM vorgestellt. Es ist zu vermuten, dass auch Mutationen in Genen, die bisher für Kardiomyopathien, Kollagen Typ VI-Myopathien und Neuropathien beschrieben sind, einen MFM-Phänotyp verursachen können. Diese Ergebnisse erweitern das genetische Spektrum der MFM, was sich auf die Diagnostik dieser Erkrankungen auswirken sollte.
Im Laufe dieser Arbeit konnten damit die neuromuskulären Erkrankungen vieler Patienten genetisch geklärt werden. Neue Phänotypen und genetische Ursachen wurden beschrieben und es wurde gezeigt, dass sich WGS technisch für die Diagnostik, auch zur Detektion von großen Strukturvarianten, eignet.
Central Core Disease (CCD) ist eine neuromuskuläre Erkrankung aus dem Formenkreis der kongenitalen Myopathien. Die Symptomatik umfaßt eine verzögerte motorische Entwicklung, eine nicht bis schwach progrediente Schwäche der Extremitätenmuskulatur mit Betonung der distalen, unteren Gliedmaßen sowie Defekte des Skelettapparates wie Kyphoskoliosen, Kontrakturen und Fußanomalien. Die Zentralfibrillen-Myopathie, wie man die Erkrankung im Deutschen nennt, imponiert durch eine mehr oder minder regelmäßige Assoziation mit der Veranlagung zur Malignen Hyperthermie (MHS), die wiederum von Mutationen im Ryanodinrezeptorgen (RYR1), einem sarkoplasmatischen Calciumkanal, verursacht wird. In genetischen Familienanalysen wurde die CCD ebenfalls zum RYR1-Gen auf dem Humanchromosom 19q13.1 kartiert, womit dieses Gen zum Kandidatengen für CCD avancierte. Es wurden in einigen wenigen Familien Mutationen im RYR1-Gen gefunden, die man für ursächlich für die Ausprägung der CCD hält. Mittlerweile häuften sich aber Hinweise, daß die CCD, ebenso wie die MHS heterogene Ursachen haben kann und damit die Rolle des RYR1-Gens als Kandidat für das CCD-Gen zunehmend in Frage gestellt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Feinkartierung von CCD-Familien vorangetrieben, indem neue Familien gesammelt wurden und ein neuer, zusammengesetzter Mini-/ Mikrosatelliten-Marker charakterisiert wurde, der für die Feinkartierung an CCD-Familien eingesetzt werden konnte. Des weiteren wurden neuere Mikrosatelliten-Marker des Genethon-Konsortiums angewendet und die Koppelung der CCD-Familien zu Chromosom 19q13.1 konnte bestätigt werden, allerdings mit einigen Ausnahmen, so daß bei CCD ebenfalls heterogene Ursachen angenommen werden können. Ein weiteres Kandidatengen wurde mit dem MYH7-Gen für die beta-Kette des schweren Myosins auf Chromosom 14 vorgeschlagen, dies konnte aber weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Um die Rolle des RYR1-Gens für die CCD zu eruieren wurden die häufigsten bisher bei MHS-Familien gefundenen RYR1-Mutationen an CCD-Patienten untersucht. Lediglich in einer CCD/MHS-Familie konnte eine bereits bekannte Mutation bestätigt werden, das RYR1-Gen konnte nicht als verursachendes Gen der CCD bestätigt werden, allerdings konnte nicht das komplette Gen untersucht werden, aufgrund der großen Anzahl von Exons und der Größe des Gens. Ein zweiter Teil der Arbeit bestand in der Suche nach neuen Transkripten aus Muskelgewebe in der genomischen Region 19q13.1 mit dem Endziel der Erstellung einer Transkriptionskarte dieser Region. Hier kam die cDNA-Selektion zur Anwendung mit einer PCR-amplifizierten cDNA-Bibliothek aus Muskelgewebe sowie ein gut charakterisiertes Cosmid-Contig aus dem Bereich des RYR1-Gens. Es konnte lediglich ein kurzes Transkript isoliert werden, das auf den genomischen Ursprung zurückkartiert, aber es konnte nicht näher charakterisiert werden. Der dritte Teil der Arbeit stand im Zeichen der Kandidatengensuche im betreffenden Abschnitt q13.1 des Chromosoms 19. Anhand von genetischen Karten und Gendatenbanken sollten Gene gesucht werden, die in diesen Bereich kartieren und eine Expression im Skelettmuskel aufweisen und damit als Kandidat für die CCD in Frage kommen. Es wurden zwei Gene für nukleär codierte Untereinheiten der mitochondrialen Cytochrom c Oxidase untersucht. Von dem Gen, das die muskelspezifische Isoform von COX VIIa codiert, konnte die genomische Sequenz und die Exon-Intron Struktur ermittelt werden sowie eine Promotor-Analyse anhand einer Datenbanksuche durchgeführt werden. Der Vergleich mit der Sequenz des homologen Gen des Rindes ergab, daß es sich um ein evolutionär konserviertes Gen handelt mit dem typischen Eigenschaften eines Haushaltsgens. Ein weiteres Kandidatengen stellt das Gen für die kleine Untereinheit des Calpains dar, das möglicherweise direkt in die elektromechanische Koppelung zwischen Nerv und Muskel involviert ist und mit dem Ryanodinrezeptor interagiert. CCD-Patienten wurden mit der SSCP-Methode (Single-stranded conformation polymorphism) auf Mutationen in den Exons sowohl des COX7A1-Gens als auch des CANPS-Gens untersucht. In beiden Fällen konnten keine Mutationen gefunden werden. Die Suche nach dem CCD-Gen ist also nach wie vor offen.
Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is a genetically complex childhood onset neurodevelopmental disorder which is highly persistent into adulthood. Several chromo-somal regions associated with this disorder were identified previously in genome-wide linkage scans, association (GWA) and copy number variation (CNV) studies. In this work the results of case-control and family-based association studies using a can-didate gene approach are presented. For this purpose, possible candidate genes for ADHD have been finemapped using mass array-based SNP genotyping. The genes KCNIP4, CDH13 and DIRAS2 have been found to be associated with ADHD and, in addition, with cluster B and cluster C personality disorders (PD) which are known to be related to ADHD. Most of the associations found in this work would not withstand correction for multiple testing. However, a replication in several independent populations has been achieved and in conjunction with previous evidence from linkage, GWA and CNV studies, it is assumed that there are true associations between those genes and ADHD. Further investigation of DIRAS2 by quantitative real-time PCR (qPCR) revealed expression in the hippocampus, cerebral cortex and cerebellum of the human brain and a significant increase in Diras2 expression in the mouse brain during early development. In situ hybrid-izations on murine brain slices confirmed the results gained by qPCR in the human brain. Moreover, Diras2 is expressed in the basolateral amygdala, structures of the olfactory system and several other brain regions which have been implicated in the psychopatholo-gy of ADHD. In conclusion, the results of this work provide further support to the existence of a strong genetic component in the pathophysiology of ADHD and related disorders. KCNIP4, CDH13 and DIRAS2 are promising candidates and need to be further examined to get more knowledge about the neurobiological basis of this common disease. This knowledge is essential for understanding the molecular mechanisms underlying the emergence of this disorder and for the development of new treatment strategies.
Chemical neurotransmission is a complex process of central importance for nervous system function. It is thought to be mediated by the orchestration of hundreds of proteins for its successful execution. Several synaptic proteins have been shown to be relevant for neurotransmission and many of them are highly conserved during evolution- suggesting a universal mechanism for neurotransmission. This process has checkpoints at various places like, neurotransmitter uptake into the vesicles, relocation of the vesicles to the vicinity of calcium channels in order to facilitate Ca2+ induced release thereby modulating the fusion probability, formation of a fusion pore to release the neurotransmitter and finally reuptake of the vesicles by endocytosis. Each of these checkpoints has now become a special area of study and maintains its own importance for the understanding of the overall process. Ca2+ induced release occurs at specialized membrane structures at the synapse known as the active zones. These are highly ordered electron dense grids and are composed of several proteins which assist the synaptic vesicles in relocating in the vicinity of Ca2+ channels thereby increasing their fusion probability and then bringing about the vesicular fusion itself. All the protein modules needed for these processes are thought to be held in tight arrays at the active zones, and the functions of a few have been characterized so far at the vertebrate active zones. Our group is primarily interested in characterizing the molecular architecture of the Drosophila synapse. Due to its powerful genetics and well-established behavioural assays Drosophila is an excellent system to investigate neuronal functioning. Monoclonal antibodies (MABs) from a hybridoma library against Drosophila brain are routinely used to detect novel proteins in the brain in a reverse genetic approach. Upon identification of the protein its encoding genetic locus is characterized and a detailed investigation of its function is initiated. This approach has been particularly useful to detect synaptic proteins, which may go undetected in a forward genetic approach due to lack of an observable phenotype. Proteins like CSP, Synapsin and Sap47 have been identified and characterized using this approach so far. MAB nc82 has been one of the shortlisted antibodies from the same library and is widely used as a general neuropil marker due to the relative transparency of immunohistochemical whole mount staining obtained with this antibody. A careful observation of double stainings at the larval neuromuscular junctions with MAB nc82 and other pre and post-synaptic markers strongly suggested an active zone localization of the nc82 antigen. Synaptic architecture is well characterized in Drosophila at the ultrastructural level. However, molecular details for many synaptic components and especially for the active zone are almost entirely unknown. A possible localization at the active zone for the nc82 antigen served as the motivation to initiate its biochemical characterization and the identification of the encoding gene. In the present thesis it is shown by 2-D gel analysis and mass spectrometry that the nc82 antigen is a novel active zone protein encoded by a complex genetic locus on chromosome 2R. By RT-PCR exons from three open reading frames previously annotated as separate genes are demonstrated to give rise to a transcript of at least 5.5 kb. Northern blots produce a prominent signal of 11 kb and a weak signal of 2 kb. The protein encoded by the 5.5 kb transcript is highly conserved amongst insects and has at its N-terminus significant homology to the previously described vertebrate active zone protein ELKS/ERC/CAST. Bioinformatic analysis predicts coiled-coil domains spread all over the sequence and strongly suggest a function involved in organizing or maintaining the structure of the active zone. The large C-terminal region is highly conserved amongst the insects but has no clear homologues in veretebrates. For a functional analysis of this protein transgenic flies expressing RNAi constructs under the control of the Gal4 regulated enhancer UAS were kindly provided by the collaborating group of S.Sigrist (Gِttingen). A strong pan-neuronal knockdown of the nc82 antigen by transgenic RNAi expression leads to embryonic lethality. A relatively weaker RNAi expression results in behavioural deficits in adult flies including unstable flight and impaired walking behavior. Due to this peculiar phenotype as observed in the first knockdown studies the gene was named “bruchpilot” (brp) encoding the protein “Bruchpilot (BRP)” (German for crash pilot). A pan-neuronal as well as retina specific downregulation of this protein results in loss of ON and OFF transients in ERG recordings indicating dysfunctional synapses. Retina specific downregulation also shows severely impaired optomotor behaviour. Finally, at an ultrastructural level BRP downregulation seems to impair the formation of the characteristic T-shaped synaptic ribbons at the active zones without significantly altering the overall synaptic architecture (in collaboration with E.Asan). Vertebrate active zone protein Bassoon is known to be involved in attaching the synaptic ribbons to the active zones as an adapter between active zone proteins RIBEYE and ERC/CAST. A mutation in Bassoon results in a floating synaptic ribbon phenotype. No protein homologous to Bassoon has been observed in Drosophila. BRP downregulation also results in absence of attached synaptic ribbons at the active zones. This invites the speculation of an adapter like function for BRP in Drosophila. However, while Bassoon mutant mice are viable, BRP deficit in addition to the structural phenotype also results in severe behavioural and physiological anomalies and even stronger downregulation causes embryonic lethality. This therefore suggests an additional and even more important role for BRP in development and normal functioning of synapses in Drosophila and also in other insects. However, how BRP regulates synaptic transmission and which other proteins are involved in this BRP dependant pathway remains to be investigated. Such studies certainly will attract prominent attention in the future.
Caretaker-Gen-Syndrome
(2001)
Ataxia telangiectasia: Identifizierung und Charakterisierung nicht-konservativer Spleißmutationen und deren Auswirkungen im ATM-Gen. Ein hoher Anteil der bisher im ATM-Gen identifizierten Mutationen (>350, www.vmresearch.org/atm.htm) stellt Deletionen oder Insertionen direkt an den Exongrenzen dar; viele dieser Aberrationen wurden allerdings nur auf cDNA-Ebene detektiert. Sollte es sich hierbei in den meisten Fällen um Mutationen an den Spleiß-Konsensussequenzen handeln, läge der Anteil der Spleißmutationen im ATM-Gen beträchtlich höher (~35 Prozent) als in anderen betroffenen Genen (~15 Prozent). Um der Frage nachzugehen, ob im ATM-Primärtranskript aufgrund einer erhöhten Labilität gegenüber Spleißmutationen auch Veränderungen weniger konservierter Positionen innerhalb der Donor- oder Akzeptor-Spleißstellen zu aberrantem Spleißen führen, wurden 20 AT-Zellinien mittels „Protein Truncation Test“ nach Deletionen oder Insertionen an den Exongrenzen durchsucht. Die 7 neu identifizierten Spleißmutationen wurden anschließend unter Verwendung eines „Splice Scoring“- Systems näher charakterisiert, die Penetranz der jeweiligen Mutation durch semiquantitative PCR evaluiert und die Auswirkungen auf Proteinebene durch Western Blotting überprüft. Obwohl nur eine der 7 neu identifizierten Spleißmutationen eine schwächer konservierte Position der Spleißsequenzen betraf, konnten im Rahmen einer Kooperation mit der Medizinischen Hochschule Hannover (Arbeitsgruppe Dr. T. Dörk) weitere Spleißmutationen an den Intronpositionen +3, +5 und -6 identifiziert werden, die ebenfalls in völlig aberrantem Spleißen resultieren. Daten weiterer Arbeitsgruppen lassen vermuten, daß tatsächlich ~ 50 Prozent aller Spleißaberrationen im ATM-Gen auf Mutationen außerhalb der konservierten Dinukleotidbereiche (gt und ag) zurückführen sind. Nijmegen Breakage Syndrom (NBS): Suche nach Genen, die einen NBS-ähnlichen Phänotyp auslösen. Über 90 Prozent aller NBS-Patienten tragen Mutationen im NBS1-Gen, dessen Translationsprodukt im Komplex mit MRE11 und RAD50 eine zentrale Rolle in DNA-DSB-Reparatur und Zellzykluskontrolle spielt. Weitere Mutationen bei Patienten mit NBS-ähnlichem Phänotyp wurden im Gen der DNA-Ligase IV identifiziert, die zusammen mit weiteren Angehörigen des NHEJ-Reparaturweges (XRCC4, DNA-PKcs, Ku70, Ku80) ebenfalls in DNA-DSB-Reparatur involviert ist. Zellen von Patienten mit NBS-ähnlichem Phänotyp wurden daher durch direkte Sequenzierung und/oder Western Blotting auf Defekte in den oben genannten Genen/Proteinen untersucht. In einem parallel durchgeführten unabhängigen Mutationsscreening (Medizinische Hochschule Hannover, Arbeitsgruppe Dr. T. Dörk) wurden in Fibroblasten einer Patientin mit NBS-ähnlichem Phänotyp Mutationen im RAD50-Gen identifiziert. Die Auswirkungen der RAD50-Defizienz auf die zelluläre Lokalisation der beiden Komplexpartner NBS1 und MRE11 sowie deren Fähigkeit zur Focibildung nach DNA-Schädigung wurde im Rahmen dieser Arbeit durch Immunfluoreszenzstudien untersucht: während NBS1 vorwiegend nukleäre Lokalisation aufwies, war MRE11 zu etwa gleichen Anteilen zwischen Nukleus und Zytoplasma verteilt; beide Proteine waren nach Bestrahlung der Zellen nicht mehr zur Focibildung fähig. Da in MRE11-defizienten Zellen keine nukleäre NBS1-Lokalisation beobachtet wird, scheint der Kerntransport des NBS1 von funktionellem MRE11, nicht aber von RAD50 abhängig zu sein. Fanconi Anämie (FA): Untersuchung einer möglichen Verbindung zwischen den FA-Proteinen und der RAD51-Familie. FA-Zellen aller bisher bekannter Komplementationsgruppen zeichnen sich durch Hypersensitivität gegenüber DNA-„interstrand crosslinks“ (ICLs) aus, zu deren Behebung u.a. die homologe Rekombinationsreparatur (HRR) eingesetzt wird, bei der das RAD51(A)-Protein eine zentrale Rolle spielt. Aufgrund schwacher Homologien werden 5 weitere Proteine (RAD51B, C, D, XRCC2 und 3) der RAD51-Familie zugeordnet. Da Knockout-Zellinien aller RAD51-Familienmitglieder ebenfalls hohe Sensitivität gegenüber ICLs aufweisen, wurde eine mögliche Verbindung zwischen den FA-Proteinen FANCA, C, G und der RAD51-Familie getestet. Unter Verwendung des "Yeast Two Hybrid" (Y2H)-Systems konnten zunächst mehrere Interaktionen zwischen FA- und RAD51-Proteinen detektiert werden. Zur Bestätigung einer funktionellen Verbindung wurden die FA- und RAD51-Proteine in humanen 293-Zellen überexprimiert. Aufgrund der focibildenden Eigenschaften des RAD51-Proteins wurden die FA-Proteine und die RAD51-Familie auf Focibildung nach DNA-Schädigung sowie etwaige Kolokalisationen getestet; mögliche physikalische Interaktionen wurden durch Koimmunpräzipitationsstudien überprüft. Die RAD51-Familie zeigten keinerlei Focibildung nach DNA-Schädigung während die FA-Proteine in einigen Experimenten eine Lokalisation in nukleäre Foci zeigten, die sich jedoch in Größe und Homogenität deutlich von denen klassischer DNA-Reparaturfoci unterschieden und nicht mit RAD51 kolokalisierten. Die häufige Beschränkung der FA-Foci auf Bereiche besonders dicht gepackten Chromatins kann möglicherweise als weiterer Hinweis auf die postulierte Rolle der FA-Proteine bei Chromatin Remodelling Mechanismen interpretiert werden. Bei Überexpression in HEK293-Zellen konnte keine der im Y2H-System identifizierten Interaktionen zwischen FA- und RAD51-Proteinen durch Koimmunpräzipitationen detektiert werden. Dennoch erscheinen seit der Identifizierung des FANCD2, das durch den FA-Komplex aktiviert wird und mit dem RAD51-Interaktor BRCA1 in nukleäre Foci kolokalisiert, weitere Untersuchungen einer Verknüpfung der FA-Proteine mit den Angehörigen des HRR-Weges durchaus sinnvoll.
The Contribution of Common and Rare Variants to the Complex Genetics of Psychiatric Disorders
(2010)
Attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD), one of the most frequent childhood-onset, chronic and lifelong neurodevelopmental diseases, affects 5 - 10% of school – aged children and adolescents, and 4% of adults. The classified basic symptoms are - according to the diagnostic system DSM-VI - inattentiveness, impulsivity and hyperactivity. Also daily life of patients is impaired by learning problems, relationship crises, conflicts with authority and unemployment, but also comorbidities like sleep - and eating problems, mood - and anxiety disorders, depression and substance abuse disorders are frequently observed. Although several twin and family studies have suggested heritability of ADHD, the likely involvement of multiple genes and environmental factors has hampered the elucidation of its etiology and pathogenesis. Due to the successful medication of ADHD with dopaminergic drugs like methylphenidate, up to now, the search for candidate genes has mainly focused on the dopaminergic and - because of strong interactions - the serotonergic system, including the already analyzed candidate genes DAT1, DRD4 and 5, DBH or 5-HTTLPR. Recently, DNA copy number changes have been implicated in the development of a number of neurodevelopmental diseases and the analysis of chromosomal gains and losses by Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) has turned out a successful strategy to identify disease associated genes. Here we present the first systematic screen for chromosomal imbalances in ADHD using sub-megabase resolution Array CGH. To detect micro-deletions and -duplications which may play a role in the pathogenesis of ADHD, we carried out a genome-wide screen for copy number variations (CNVs) in a cohort of 99 children and adolescents with severe ADHD. Using high-resolution aCGH, a total of 17 potentially syndrome-associated CNVs were identified. The aberrations comprise four deletions and 13 duplications with approximate sizes ranging from 110 kb to 3 Mb. Two CNVs occurred de novo and nine were inherited from a parent with ADHD, whereas five are transmitted by an unaffected parent. Candidates include genes expressing acetylcholine-metabolising butyrylcholinesterase (BCHE), contained in a de novo chromosome 3q26.1 deletion, and a brain-specific pleckstrin homology domain-containing protein (PLEKHB1), with an established function in primary sensory neurons, in two siblings carrying a 11q13.4 duplication inherited from their affected mother. Other genes potentially influencing ADHD-related psychopathology and involved in aberrations inherited from affected parents are the genes for the mitochondrial NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex assembly factor 2 (NDUFAF2), the brain-specific phosphodiesterase 4D isoform 6 (PDE4D6), and the neuronal glucose transporter 3 (SLC2A3). The gene encoding neuropeptide Y (NPY) was included in a ~3 Mb duplication on chromosome 7p15.2-15.3, and investigation of additional family members showed a nominally significant association of this 7p15 duplication with increased NPY plasma concentrations (empirical FBAT, p = 0.023). Lower activation of the left ventral striatum and left posterior insula during anticipation of large rewards or losses elicited by fMRI links gene dose-dependent increases in NPY to reward and emotion processing in duplication carriers. Additionally, further candidate genes were examined via Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This method enables the analysis of SNPs directly from human genomic DNA without the need for initial target amplification by PCR. All these findings implicate CNVs of behavior-related genes in the pathogenesis of ADHD and are consistent with the notion that both frequent and rare variants influence the development of this common multifactorial syndrome. The second part of this work concentrates on MLC1, a gene associated with Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts, located on chromosome 22q13.33. To get more insight in the disease itself, a targeting vector for a conditional knockout mouse was constructed using homologous recombination. Furthermore, MLC1 has been suggested as a risk gene for schizophrenia, especially the periodic catatonia subtype. An initially identified missense mutation was found to be extremely rare in other patient cohorts; however, a recent report again argued for an association of two intronic MLC1 SNPs with schizophrenia and bipolar disorder. A case-control study of these polymorphisms as well as SNPs in the transcriptional control region of MLC1 was conducted in 212 chronic schizophrenic patients, 56 of which suffered from periodic catatonia, 106 bipolar patients, and 284 controls. Both intronic and promoter polymorphisms were specifically and significantly associated with periodic catatonia but not schizophrenia or bipolar disorder in general. A haplotype constructed from all polymorphisms was also associated with periodic catatonia. The MLC1 variation is associated with periodic catatonia; whether it constitutes a susceptibility or a modifier gene has to be determined.
Seit der Entdeckung des ersten Gens für den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schlüssel-Enzym für die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zusätzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anfällt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen führen zu einem signifikanten Effekt auf die benötigte Coumarin-Dosis und die Stabilität der Hämostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1“ (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit völlig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellulären Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein können. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke Ähnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivität, wobei die Affinitäten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich höher sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen führt in beiden Proteinen zu einem fast vollständigen Verlust der Aktivität. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 – wie VKORC1 – in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine ähnliche Struktur, die gleiche zelluläre Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivität hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen könnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out Mäusen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem für Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als Köder 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferhäufigkeit und funktioneller Überlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpräzipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation näher untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke Überschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies könnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, führt aber auch zu neuen Hypothesen bezüglich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1“ (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals Würzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein“ (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP führen zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die Ähnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch überhöhte Dosierung von Coumarinen während der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpräzipitationsexperimenten nicht bestätigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bedürfen weiterführender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen wäre auch eine kritische Betrachtung der übrigen 85 primären Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll.
Die Positionsklonierung hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung und Isolierung von Genen erwiesen. Da ihre Anwendung im Allgemeinen keine Informationen über den zugrundeliegenden Pathomechanismus einer Erkrankung voraussetzt, eignen sich die Methoden der Positionsklonierung in besonderem Maße für die Erforschung hereditärer Netzhauterkrankungen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden sie zur Untersuchung ausgewählter retinaler Degenerationen eingesetzt. Dabei konnten wichtige Beiträge für die Aufklärung der genetische Ursachen dieser Erkrankungen geleistet werden. Die autosomal dominante North Carolina Makuladystrophie (NCMD) oder die zentral areoläre Pigmentepitheldystrophie (CAPED) sind allelische Erkrankungen mit allenfalls gering progredientem Verlauf. Ihr Genlokus liegt in einem etwa 7,2 cM großen Bereich auf 6q14-q16.2 zwischen den DNA-Markern D6S424 und D6S1671. Mit Hilfe von 21 polymorphen DNA-Markern welche den NCMD-Lokus (MCDR1) flankieren, wurden Kopplungsanalysen in drei deutschen NCMD-Familien durchgeführt. Die Analyse der krankheitsassoziierten Haplotypen erbrachte Hinweise auf einen gemeinsamen Vorfahren aller drei Familien. Darüber hinaus konnte der MCDR1-Lokus auf 3,2 cM eingeengt werden und wird von den Markern D6S249 und D6S475 flankiert. Dies bedeutet einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klonierung des zugrundeliegenden Krankheitsgens. Eine häufige Ursache für den frühzeitigen Verlust der zentralen Sehschärfe bei Jungen ist die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS). Ihr Genlokus wurde in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert, wo er von den DNA-Markern DXS418 und DXS999/DXS7161 flankiert wird. Die Analyse von EST-Sequenzen aus dieser Region ermöglichte die Isolierung eines neuen retinaspezifischen Transkriptes, welches als RS1 bezeichnet wurde. Das RS1-Gen besteht aus sechs Exonen und codiert ein Protein, welches eine in der Evolution hoch konservierte Discoidin-Domäne enthält. Diese Domäne ist in anderen Proteinen u.a. an der Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Mutationsanalysen in betroffenen Personen aus neun nicht-verwandten RS-Familien ergaben neun verschiedene Sequenzveränderungen die mit dem Krankheitsbild der jeweiligen Familie segregierten. Einen ersten Einblick in die zeitliche und räumliche Expression ergab die Untersuchung des murinen Orthologs Rs1h mit Hilfe von Northern Blot, RT-PCR und RNA in situ-Hybridisierungen. Rs1h wird in der Maus hauptsächlich in den Photorezeptoren exprimiert. Die Expression beginnt erst postnatal und ist mit der Entwicklung der Photorezeptoren korreliert. Das Auftreten zahlreicher weißlich-gelber Flecken, sogenannter Drusen, in radiärer Anordung am hinteren Augenpol ist das charakteristische Merkmal einer Gruppe von Netzhauterkrankungen mit gemeinsamer Ätiologie, die unter dem Begriffen Doynsche Honigwaben Dystrophie (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) oder radiäre Drusen zusammengefasst werden. Der Genlokus dieser Erkrankung wurde auf den kurzen Arm von Chromosom 2 in den Bereich 2p16 kartiert. Die Durchsuchung von EST-Datenbanken führte zur Identifizierung des neuronal exprimerten Gens pNEU60. Dieses besteht aus zwei Exonen, wobei der vollständige codierende Bereich im zweiten Exon liegt. Die Analyse des pNEU60-Proteins ergab eine Struktur aus sieben Transmembrandomänen, dem gemeinsamen Merkmal G-Protein gekoppelter Rezeptoren, wie z.B. Rhodopsin. Patienten mit radiären Drusen zeigten keinerlei Sequenzveränderungen in pNEU60. Die Untersuchung von fast 200 Patienten mit der phänotypisch sehr ähnlichen altersbedingten Makuladegeneration (AMD), führte zur Identifizierung von drei potentiellen Mutationen, darunter eine nonsense-Mutation, sowie zwei polymorphen Veränderungen. Die Assoziation einer einzigen missense-Mutation (R345W) im ubiquitär exprimierten Gen EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) mit der DHRD und MLVT wurde von einer amerikanischen Arbeitsgruppe nachgewiesen. Die R345W Mutation in diesem proximal zu pNEU60 liegenden Gen wurde in den zur Verfügung stehenden zwei MLVT-Familien sowie einer DHRD-Familie nachgewiesen. Bei der Analyse von 14 Patienten mit sporadischen radiären Drusen konnte weder die R345W Mutation, noch irgendeine andere krankheitsassoziierte Mutation nachgewiesen werden. Es wurden jedoch drei polymorphe Sequenzvarianten, sowie zwei polymorphe Di- bzw. Trinukleotidsequenzen identifiziert. Die Klonierung des orthologen EFEMP1-Gens des Rinds diente als Voraussetzung zur Untersuchung der Interaktionsfähigkeit von EFEMP1 mit anderen Proteinen. Mit der Anwendung des Hefe Zwei-Hybrid Systems konnte gezeigt werden, dass die EGF-Domänen von EFEMP1 eine Interaktion mit sich selbst ermöglichen. Die Einführung der R345W Mutation hatte dabei keinen Einfluss auf diese Wechselwirkungen. Die beschriebene Interaktion mit dem zur Familie der Ubiquiline gehörenden Protein DA41 konnte nicht reproduziert werden. Das Gen welches mit der inkompletten Form der X-gebundenen kongenitalen stationären Nachtblindheit (CSNB2) assoziiert ist, codiert die a1-Untereinheit des retinaspezifischen spannungsabhängigen L-Typ Kalziumkanals (CACNA1F). Mit Hilfe von RT-PCR Analysen und RNA in situ-Hybridisierungen wurde die räumliche Expression dieses Gens in der Netzhaut untersucht. Dabei wurde das CACNA1F-Transkript in der äußeren und inneren Körnerschicht, sowie in der Ganglienzellschicht nachgewiesen.
In the present study, a new gene cluster of Listeria monocytogenes EGD containing three internalin genes was identified and characterized. These genes, termed inlG, inlH and inlE, encode proteins of 490, 548 and 499 amino acids, respectively, which belong to the class of large, surface-bound internalins. Each of these proteins contains a signal peptide, two regions of repeats (Leucine-rich repeats and B repeats), an inter-repeat region and a putative cell wall anchor sequence containing the sorting motiv LPXTG. PCR analysis revealed the presence of the inlGHE gene cluster in most L. monocytogenes serotypes. A similar gene cluster termed inlC2DE localised to the same position on the chromosome was described in a different L. monocytogenes EGD isolate. Sequence comparison of the two clusters indicates that inlG is a new internalin gene, while inlH was generated by a site-specific recombination leading to an in-frame deletion which removed the 3'-terminal end of inlC2 and a 5'-portion of inlD. The genes inlG, inlH and inlE seem to be transcribed extracellularly and independent of PrfA. To study the function of the inlGHE gene cluster several in-frame deletion mutants were constructed which lack the genes of the inlGHE cluster individually or in combination with other inl genes. When tested in the mouse model, the inlGHE mutant showed a significant reduction of bacterial counts in liver and spleen in comparison to the wild type strain, indicating that the inlGHE gene cluster plays an important role in virulence of L. monocytogenes. The ability of this mutant to invade non-phagocytic cells in vitro was however two- to three-fold higher than that of the parental strain. To examine whether deletion of the single genes from the cluster has the same stimulatory effect on invasiveness as deletion of the complete gene cluster, the single in-frame deletion mutants inlG, inlH and inlE were constructed. These mutants were subsequently reverted to the wild type by introducing a copy of the corresponding intact gene into the chromosome by homologous recombination using knock-in plasmids. To determine a putative contribution of InlG, InlH and InlE in combination with other internalins to the entry of L. monocytogenes into mammalian cells, the combination mutants inlA/GHE, inlB/GHE, inlC/GHE, inlA/B/GHE, inlB/C/GHE, inlA/C and inlA/C/GHE were constructed. Transcription of the genes inlA, inlB and inlC in these mutants was studied by RT-PCR. Deletion of inlGHE enhances transcription of inlA and inlB, but not of inlC. This enhancement is not transient but can be observed at different time-points of the bacterial growth curve. Deletion of inlA also increases transcription of inlB and vice-versa. In contrast, the amounts of inlA and inlB transcripts in the single deletion mutants inlG, inlH and inlE were similar to those from the wild type.