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Regulation Tumornekrosefaktor (TNF) Rezeptor assoziierter Signalwege durch das Adapterprotein TRAF1
(2015)
TWEAK ist ein zu der TNF-Superfamilie (Tumor Necrosis Factor) zugehöriges Zytokin, welches in Form löslicher und membranständiger Moleküle vorkommt. Beide Formen des Liganden können an den Rezeptor (Fn14) binden. Viele verschiedene intrazelluläre Signalwege werden durch den Fn14 aktiviert, beispielweise Erk1/2, JNK, Jun und STAT3, vor allem jedoch das NFkB. Lösliches und membranständiges TWEAK zeigen eine ähnliche Aktivierungseffizienz bezüglich des alternativen NFkB-Signalwegs, wohingegen membranständiges TWEAK weit besser als lösliches TWEAK den klassischen NFkB-Signalweg aktiviert. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die TWEAK-vermittelte Induzierbarkeit von verschiedenen Zielgenen des NFkB-Systems untersucht. Lösliches TWEAK zeigte einen weit schwächeren aktivierenden Effekt auf den klassischen NFkB-Signalweg als TNF, das ein sehr guter Aktivator des klassischen NFkB-Systems ist (Abb. 5, 6). Nichtsdestotrotz war TWEAK imstande eine stärkere TRAF1-Induktion als TNF herbeizuführen (Abbildung 7, 8). TRAF1 ist ein durch NFkB-System stark reguliertes Gen. Um posttranskriptionelle TRAF1-Modifikationen als Ursache für die unerwartet gute TRAF1-Induktion durch lösliches TWEAK auszuschließen, wurde die TRAF1-Expression nach Proteasom- und Caspasen-Inhibition untersucht (Abbildung 9). Dies ergab keinen Hinweis auf einen Einfluss dieser Prozessen auf der TRAF1-Expression.
Mittels des IKK2-spezifischen Inhibitor TPCA-1 wurde die TWEAK-vermittelte TRAF1-Induktion Zelltyp-abhängig gehemmt, wohingegen die TNF-vermittelte Induktion von TRAF1 in allen Zelllinien vollständig inhibiert wurde (Abbildung 13). Versuche mit dem NEDD8-aktivierenden Enzym (NAE) Inhibitor MLN4924, resultierten in einer totalen Inhibition der TRAF1-Expression in allen TWEAK- und TNF-stimulierten Zellen (Abbildung 14). Diese Befunde sprechen dafür, dass bei der TWEAK-vermittelten TRAF1-Expression beide Zweige des NFkB-Signalwegs Zelltyp-abhängig beteiligt sind.
Die Oligomerisierung der Liganden der TNF-Familie verstärkt oft ihre Aktivität. Oligomerisiertes TWEAK imitiert die biologische Aktivität von membranständigem TWEAK. Lösliches TWEAK wurde mit einem anti-Flag Antikörper oligomerisiert und die TRAF1-Induktion durch den alternativen NFkB-Signalweg wurde analysiert
Oligomerisiertes TWEAK aktivierte Zelltyp-unabhängig den klassischen NFkB-Signalweg stärker als lösliches TWEAK, wohingegen kein Effekt auf die TRAF1-Induktion oder auf die Aktivierung den alternativen NFkB-Signalweg festgestellt wurde (Abbildung 11, 12). TWEAK ist imstande die TRAF2-vermittelte CD40-Induktion des klassischen NFkB-Signalwegs zu hemmen (Abbildung 16, 17). Um den Beitrag von TWEAK-Induziertem TRAF1 zur CD40-Inhibition zu herauszufinden, wurden TRAF1-stabil transfizierte 786O- und U2OS-Zellen hergestellt (Abbildung 19). Die CD40-Induzierte IkBa-Degradation und IL8/6 Produktion war in den TRAF1-Transfektanten als auch in mit löslichem TWEAK vorbehandelte Zellen stark inhibiert (Abbildung 21, 22), wobei die CD40-Expression und CD40/CD40L-Interaktion unverändert blieb (Abbildung 20). Diese Ergebnisse sprechen für einen wichtigen Beitrag des Adaptorprotein TRAF1 in der TWEAK-vermittelte Inhibition der CD40-induzierte Aktivierung des klassischen NFkB-Signalwegs.