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Molekulare Charakterisierung eines Tropomodulin-Homologen des Fuchsbandwurms E. multilocularis
(2002)
Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals ein Tropomodulin- homologer Faktor aus einem Plathelminthen auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Zudem wurde die Interaktion des kodierten Faktors mit einem kürzlich isolierten Tropomyosin- Homologen aus E. multilocularis nachgewiesen. Basierend auf diesen Daten ist es nun möglich, die biologische Signifikanz der Interaktion von Elp mit EmTY weiterführend zu untersuchen. Sollte sich in diesen Studien herausstellen, daß der ERM- Faktor Elp in der Tat mit dem Tropomodulin- Tropomyosin- System der E. multilocularis- Zelle interferiert, könnte dies ein wichtiger Beitrag zu unserem Verständnis des signaltransduktorischen Geschehens zwischen der Plasmamembran und dem Zytoskelett bei E. multilocularis sein.
Vergleichende Proteomanalyse eines avirulenten und virulenten Stammes von Legionella pneumophila Sg1 Subgruppe OLDA unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die Stämme unterliegen einer spontanen LPS-Phasenvariation und unterscheiden sich phänotypisch in multiplen Eigenschaften. Es zeigten sich different exprimierte Proteine der Membranoberfläche, der LPS-Biosynthese und des Bakterienstoffwechsels.
Im Rahmen der von November 1999 bis März 2000 durchgeführten bayerischen Meningokokkenträgerstudie wurden in zahlreichen Kindergärten und Schulen der bayerischen Gemeinden Ansbach, Augsburg, Erlangen, Griesbach, Ingolstadt, München, Pfarrkirchen, Sonthofen und Weiden insgesamt 287 Neisseria lactamica-Stämme isoliert. 26 ausgewählte, aus den benachbarten Städten Augsburg, Ingolstadt und München stammende Isolate wurden einer Multi-Lokus-Sequenztypisierung (MLST) zur Untersuchung ihrer genetischen Diversität unterzogen. Dabei wurden sowohl Sequenzen der 3 Stoffwechselgene argF, recA und rho, als auch Sequenzen des 16S rRNA-Gens analysiert. Für das 16S rRNA-Gen fanden sich zehn, für argF fünf, für recA acht und für rho neun differente Allele. Auf Basis der vier analysierten Gene konnten 17 verschiedene Genotypen definiert werden, von denen zwölf nur einmal, fünf hingegen mehrmals vorkamen. Es ist anzunehmen, dass durch Sequenzierung der vier in dieser Studie verwendeten Gene bereits eine ausreichende Diskriminierung von Neisseria lactamica erfolgte, da Versuche eine weiterführende Diskriminierung durch Sequenzierung des porB-Gens zu erreichen, keine wesentlichen zusätzlichen Informationen erbrachten. Durch visuelle Inspektion der Sequenzen konnte bei allen vier Genloci das Überwiegen von Rekombinationsereignissen gegenüber Punktmutationen bestätigt werden, so dass für die Spezies Neisseria lactamica horizontaler Gentransfer anzunehmen ist. Da nur ein einziger Genotyp in zwei verschiedenen Städten beobachtet wurde, zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass eine klonale Ausbreitung von Neisseria lactamica nur dann nachweisbar ist, wenn eine epidemiologische Verknüpfung zwischen Trägern besteht.
Das Gram negative Bakterium Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger der bakteriellen Meningitis. Obwohl das ausschließlich humanpathogene Bakterium in bis zu 25% der Europäischen Bevölkerung die oberen Atemwege als harmloser Kommensale besiedelt, kommt es unter bestimmten, noch nicht ganz verstandenen Bedingungen zu einer klinisch manifesten Infektion. In dieser Arbeit wurde die neue Technologie der DNA Mikroarray Technologie für die Untersuchung des Transkriptoms bei Neisseria meningitidis etabliert. Untersucht wurde die Reaktion von N. meningitidis auf einen Hitzeschock, eine plötzliche Steigerung der Temperatur. Während einer Infektion wird das Bakterium durch induziertes Fieber sehr ähnlichen Bedingungen ausgesetzt. Im Ergebnis erlaubten die RNA Expressionsanalysen nicht nur eine sichere Unterscheidung deregulierter Gene von Genen mit konstanter Expression, sondern es konnte auch das Ausmaß der Deregulation exakt bestimmt werden. Die Daten der DNA Mikroarray Experimente wurden mit der etablierten Technik der RT-PCR exakt bestätigt. Bei den Hitzeschock-Versuchen mit Neisseria meningitidis konnten zahlreiche ORFs als Hitzeschock-Gene identifiziert werden. Die Funktion dieser Gene, darunter groEL/groES und dnaJ/dnaK, war bereits bei anderen Organismen beschrieben worden, was die Qualität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unterstreicht. Es konnte gezeigt werden, dass die Intensität des Hitzeschocks und damit die Deregulation der Hitzeschock-Gene mit steigender Temperatur zunimmt. Eine Erklärung für dieses interessante Ergebnis wäre, dass mit Steigerung der Temperatur der Schaden im Bakterium zunimmt und dadurch auch mehr Hitzeschock Proteine zur Reparatur benötigt werden. Daneben wurde erstmals die transkriptionelle Beeinflussung von Genen aus dem Bereich der Transformation durch einen Hitzeschock gefunden. Diese Daten konnten durch einen phänotypischen Nachweis der Verminderung der Transformationsaktivität von Meningokokken nach einem Hitzeschock bestätigt werden. Diese neue Technik wird eine der Schlüsseltechnologien für die Forschung in der postgenomischen Ära sein. Viele Fragen in dem noch lückenhaften Wissen über die Pathologie von Neisseria meningitidis sollen sich in Zukunft mit Hilfe der DNA Mikroarrays beantworten lassen.
Die opportunistische humanpathogene Hefe Candida glabrata ist zum zweithäufigsten Erreger einer Candidose avanciert. Infektionen mit Candida glabrata sind schwierig zu behandeln und bergen eine hohe Sterblichkeit bei Risikopatienten in sich. Dies liegt vor allem in der geringen Sensitivität von C. glabrata gegenüber den etablierten Azol-Derivaten begründet. Deswegen ist man bei C. glabrata, wie auch bei anderen pathogenen Pilzen, auf der Suche nach geeigneten Zielstrukturen für neue Antimykotika. Dabei rückte die Hemmung der 1-3-ß-D-Glucan-Synthetase in den Brennpunkt wissenschaftlichen Interesses. Die 1-3-ß-D-Glucan-Synthetase ist ein pilzspezifisches Enzym, welches beim Menschen nicht vorkommt. Sie ist am Zellwandaufbau der Hefen beteiligt und wird durch die FKS Gene codiert. Die 1-3-ß-D-Glucan-Synthetase-Hemmer sind wirksam gegenüber Pilzen, die gegenüber anderen Antimykotika resistent sind. Dies führte zur Entwicklung der Echinocandine, echinocandin ähnlicher Lipopeptide und Pneumocandine, wovon einige in klinische Versuche aufgenommen wurden. In dieser Arbeit wurde ein FKS homologes Gen von C. glabrata identifiziert, kloniert und sequenziert. Die erhaltene Gensequenz des gefundenen FKS-Homologs von Candida glabrata wurde in der GenBank des National Center for Biotechnological Information veröffentlicht.
Kurzfassung in deutsch Ziel dieser Studie war die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque bei einem Hypophosphatasiepatientenkollektiv durch Anwendung der 16S rRNA Technologie. Das Kollektiv bestand aus sieben männlichen Patienten mit einer infantil-juvenilen Hypophosphatasie. Es sollten mikrobiologische Evidenzen für oder gegen die Hypothese einer frühen Parodontitis bei Hypophosphatasiepatienten gewonnen werden. Subgingivale Plaqueproben wurden von jedem Patienten entnommen. Anschließend folgte die DNA Extraktion aus den Plaqueproben und die Amplifikation der 16S rRNA Gene mittels zweier verschiedener universeller Primer-Paare: 27f/519r; 515f/1525r. Die PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Dann folgte ein Vergleich der Sequenzen mit der Genbank Database durch den BLAST-Server des National Center for Biotechnology Information (NBCI, Bethesda, MD, USA). Insgesamt wurden zwei verschiedene 16S rRNA Genbanken erstellt und 101 Klone pro Genbank identifiziert. Mit der 27f/519r PCR wurden 15 bakterielle Familien, mit der 515f/1525r PCR 10 bakterielle Familien identifiziert. 66 Phylotypen wurden in der 27f/519r Genbank identifiziert, 41 in der 515f/1525r Genbank. Der Coverage war 50% in der 27f/519r Genbank und 73% in der zweiten Genbank. In allgemeinen zeigte sich ein hoher Anzahl der Keime der physiologischen Plaqueflora (Streptococcus sp. und Actinomyces sp.), dagegen kamen putative Parodontalpathogene wie Porphyromonas gingivalis, Filifactor alocis, Tannerella forsythensis, Campylobacter rectus niemals vor. Die Analyse der bakteriellen Diversität der subgingivalen Plaque erbrachte eine deutlich andere Zusammensetzung im Vergleich zu Padodontitispatienten. Es zeigte sich somit keine mikrobiologische Evidenz für eine Parodontitis bei dem Hypophosphatasiepatientenkollektiv.
Durch den monoklonalen Antikörper mAk 2625, der ein Epitop im Bereich des LPS bindet, konnte für den virulenten Stamm RC1 von Legionella pneumophila Serogruppe 1 Subgruppe OLDA eine spontane instabile LPS-Mutante isoliert werden. Die Mutante zeigte eine Phasenvariation des Epitops, sowie einen Verlust der Virulenz und Serumresistenz. Um Zugang zum molekularen Mechanismus der Phasenvariation des LPS zu bekommen, erfolgte zunächst die Komplementierung der stabilen mAk 2625-negativen LPS-Mutante 137 mit der Genbank des zugehörigen Wildtyps. Die Komplementierung und Rekonstitution des mAk 2625-Epitops gelang mit einem 3 kb langen klonierten genomischen Fragment. Die Mutation des Stammes 137 konnte einer Deletion eines Cytosin-Restes im später benannten Orf 8 zugeschrieben werden. Das Protein welches sich aus der Sequenz von Orf 8 ableitet, zeigt Homologien zu bakteriellen Methyltransferasen. Mit Sonden, welche sich aus den klonierten Fragmenten ableiteten, konnte eine Genbank des Stammes RC1 nach LPS-Biosynthese-Genen durchsucht werden. Auf diese Weise gelang die Identifizierung einer 32661 bp langen Region des Genoms von Legionella pneumophila, die 30 mögliche offenen Leseraster (Orfs) enthält. Einige dieser Orfs zeigen signifikante Homologien zu bekannten Gensequenzen der Core- und O-Antigen-Biosynthese. Der molekulare Mechanismus der Phasenvariation konnte jedoch durch diese Untersuchungen nicht entschlüsselt werden. Erst anschließende Untersuchungen zeigten, daß es sich um ein 30 kb langes instabiles genetisches Element handelt, das vermutlich auf einen Phagenursprung zurückgeht.
Candida albicans ist ein opportunistischer Hefepilz, den die meisten gesunden Menschen als harmlosen Kommensalen des Verdauungstraktes beherbergen. Bei einer Schwächung des Immunsystemes kann es jedoch zu schweren Candida-Infektionen bis hin zur lebensbedrohlichen Pilzsepsis kommen. Neben anderen Virulenzfaktoren spielt offenbar der Polymorphismus, also die Fähigkeit, sowohl in einer sprossenden Hefeform als auch in einer filamentösen Hyphenform zu wachsen, eine bedeutende Rolle in der Pathogenität von C._albicans. Welche Wachstumsform überwiegt, hängt entscheidend von den Wachstumsbedingungen, insbesondere auch vom pH-Wert, ab. Im Zentrum des pH-abhängigen Transduktionsweges steht der alkalisch-exprimierte Transkriptionsfaktor RIM101, dessen inaktive Vorläuferform unter neutralen bzw. alkalischen Wachstumsbedingungen vermutlich durch eine zweistufige proteolytische Prozessierung des C-Terminus in (mindestens) eine aktive Form übergeführt wird. Diese wiederum hat mindestens zwei Funktionen: Erstens induziert sie im Rahmen der pH-abhängigen Genexpression unter anderem PHR1 und reprimiert PHR2, die beide für den Zellwandaufbau erforderliche, funktionell homologe Proteine kodieren. Zweitens steuert sie bei gleichzeitig vorliegender Temperaturerhöhung auf ca. 37°C auf noch unbekannte Weise den Übergang der Zelle in die filamentöse Wachstumsform. Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen C-terminaler Verkürzungen von Rim101 auf das Wachstum, die PHR1-Induktion und die Filamentierung, jeweils in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert, zu untersuchen. Daraus können neue Einsichten über die Bedeutung von RIM101, den Mechanismus seiner Aktivierung und seine Funktion im Geflecht der Transduktionskaskaden gewonnen werden. Hierzu wurden zunächst 14 phr2∆-Suppressormutanten isoliert, die trotz der phr2∆-Nullmutation in der Lage waren, bei saurem pH-Wert zu wachsen. Es zeigte sich, dass diese Stämme im sauren Milieu nicht nur eine starke PHR1-Induktion aufwiesen, sondern darüber hinaus unabhängig vom pH-Wert des Mediums in hohen Raten zur Filamentierung fähig waren. Die molekulargenetische Analyse beider RIM101-Allele in diesen Revertanten ergaben, dass in jedem der Stämme ein RIM101-Allel eine Nonsense-Mutation enthielt, die offensichtlich zur Synthese eines trunkierten und damit konstitutiv aktiven Rim101p führte. Die spontan aufgetretenen RIM101-Suppressormutationen fanden sich bei den 14 verschiedenen analysierten Revertanten in einem umschriebenen Bereich, der auf dem das C-terminale Drittel codierenden Teil des RIM101-ORF liegt. Um die Folgen von stärkeren, also weiter upstream lokalisierten, Rim101p-Trunkierungen zu untersuchen, wurden daraufhin C.-albicans-Stämme konstruiert, die nach Transformation eines linearisierten Plasmides jeweils ein RIM101-Allel mit einer gezielt eingeführten Nonsense-Mutation enthielten. Wir erhielten 19 solcher Stämme (phr2∆) mit in 5’-Richtung progessiven RIM101-Trunkierungen in einem weiten Bereich des RIM101-ORF. Interessanterweise konnten wir bei der darauf folgenden Untersuchung der gewonnenen Stämme drei Gruppen von RIM101-Trunkierungen unterscheiden, die verschiedene Konsequenzen für Wachstum und Filamentierung mit sich brachten: a) Der Austausch der Codons 281, 305 und 333, die näher am 5’-Ende im Bereich oder der Nähe der Zinkfingerregion lokalisiert sind, ermöglicht kein Wachstum bei pH 4. b) Die Einführung von Nonsense-Codons an die Stellen 385 und 411 führt dazu, dass die entsprechenden Stämme bei pH 4 wachsen und PHR1 induzieren, aber nicht in der Lage sind, bei diesem pH-Wert zu filamentieren. c) Dagegen erlaubt der Ersatz von einem der Codons 463 bis 475 durch ein Stop-Codon Wachstum, PHR1-Induktion und filamentöses Wachstum bei pH 4. Die Region zwischen den Aminosäuren 411 und 463 muss also für die Initiation der Keimschlauchbildung essentiell, für die Induktion pH-regulierter Gene wie PHR1 aber nicht notwendig sein. Dieses Ergebnis scheint darauf hinzuweisen, dass der Funktion des Transkriptionsfaktors Rim101p in den Bereichen Zellwandaufbau/Wachstum und pH-abhängiger Morphogenese zwei verschiedenartige Steuermechanismen zugrunde liegen. Denkbare Modelle für solche Mechanismen werden in der vorliegenden Arbeit auf dem Hintergrund früherer Studien diskutiert. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der potentiellen Bedeutung von Rim101p bei der Regulation der Expression von sog. sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs). Mit Hilfe eines Reportersystemes sollen die Auswirkungen von RIM101-Mutationen auf drei „hyphenspezifische“ Mitglieder der SAP-Genfamilie, nämlich SAP4, SAP5 und SAP6, untersucht werden. Daraus gewonnene Informationen könnten die bisher vorwiegend isolierte Betrachtung des Dimorphismus und der Proteinasen im Pathogenitätsprozess ausweiten auf ein sich ergänzendes Zusammenspiel dieser Faktoren.
Helicobacter pylori ist ein an seine ökologische Nische hochgradig angepasstes Bakterium, das den Magen von mehr als 50% der Weltbevölkerung chronisch besiedelt. Bei 10 bis 20% der Infizierten können schwerere Krankheitsverläufe von Magengeschwüren bis hin zu Karzinomen auftreten. Die Chemotaxis-gesteuerte Motilität von H. pylori, vermittelt durch ein Bündel von 2-8 polaren Flagellen, ist für die Besiedelung und persistente Infektion des Wirtes essenziell. Mehr als 40 Komponenten des Flagellen- und Chemotaxissystems konnten mit Hilfe der beiden sequenzierten H. pylori-Genome identifiziert werden, wobei die Gene einzeln oder in kleinen transkriptionellen Einheiten über das gesamte Genom verteilt angeordnet sind. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Organisation und Vernetzung der transkriptionellen Regulation der Flagellenbiogenese und mögliche Querverbindungen zu anderen zellulären Funktionen in H. pylori umfassend charakterisiert werden. H. pylori verfügt über zwei unterschiedliche Flagellingene, flaA und flaB, deren Transkription von den beiden alternativen Sigma-Faktoren Sigma28 und Sigma54 kontrolliert wird. Um die transkriptionelle Regulation der beiden Gene in zwei unterschiedlichen Flagellenregulons zu untersuchen, wurde die Genexpression von flaA und flaB abhängig von der Wachstumsphase analysiert. Mit flaA- und flaB-Promotorfusionen wurde hier erstmalig ein sensitives, Biolumineszenz-basiertes Reportersystem für Expressionsstudien in H. pylori etabliert und genutzt. Die Transkriptmengen der beiden Flagellingene wurden weiterhin direkt mittels Northern Blot-Hybridisierungen und RT-PCR bestätigt. Es ergab sich eine Wachstumsphasen-abhängige, differentielle Regulation, bei der in Übereinstimmung mit der strukturellen Anordnung der Flagelline im Filament und der Zugehörigkeit der Gene zu zwei Regulationsklassen, das Verhältnis der flaA- zur flaB-Expression im Verlauf der Wachstumskurve stark anstieg. Um genomweite Analysen durchführen zu können, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Plattform zur Untersuchung von H. pylori mit DNA-Microarrays etabliert. Hierzu wurde in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ein PCR-Produkt-Microarray mit 1590 H. pylori-spezifischen Sonden produziert. Zusätzlich wurde ein industriell gefertigter, Oligonukleotid-basierter, H. pylori-Microarray erstmalig verwendet und validiert. Mit Hilfe der Microarray- Technologie wurden verschiedene zentrale Regulatoren der H. pylori-Flagellenbiogenese zum ersten Mal auf genomweiter Ebene untersucht. Hierzu zählten die beiden alternativen Sigma-Faktoren FliA und RpoN, der Anti-Sigma28-Faktor FlgM, das RpoN-spezifische Zwei-Komponenten System FlgS/FlgR und die Flagellen-Basalkörperkomponenten FlhA und FlhF. Bis auf die fliA- und flgM-Mutanten, die, in Übereinstimmung mit ihrer antagonistischen Funktion, Stummelflagellen bzw. eine leicht erhöhte Flagellenzahl aufwiesen, bewirkten die Mutationen in allen anderen untersuchten Genen einen flagellenlosen unbeweglichen Phänotyp. Die Klassen 2 und 3 des H. pylori-Flagellenregulons konnten durch die Analysen des FliA- und des RpoNRegulons neu definiert und um zehn neue Gene ergänzt werden. Für FlhA und FlhF konnte eine Funktion als übergeordnete Regulatoren der Klassen 2 und 3 des Flagellenregulons gezeigt werden. Des Weiteren wurden 24 Gene einer neuen regulatorischen Zwischenklasse zugeordnet. Diese Gene werden von mehr als einem Promotor kontrolliert und umfassen Flagellen- sowie Nicht-Flagellengene. Durch globale Untersuchungen von Doppelmutanten wurde die komplexe Einbindung des Anti-Sigma-Faktors FlgM in die FlhA- und FlhF-vermittelte transkriptionelle Rückkopplung nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Arbeit konnte ein neues Modell der Regulation der Flagellenbiogenese für H. pylori entwickelt werden. Es beinhaltet drei regulatorische Genklassen mit einer intermediären Klasse, die von den drei H. pylori-Sigma-Faktoren Sigma80, Sigma54 und Sigma28 zusammen mit den assoziierten Regulatoren FlgS/FlgR und FlgM kontrolliert werden. FlgM vermittelt als Anti-Sigma28-Faktor die transkriptionelle Rückkopplung auf die Klasse 3- und, im Zusammenspiel mit FlhA, auch auf die Klasse 2-Flagellengene. FlhF kontrolliert die Expression der Klasse 2-Flagellengene durch einen FlgM-unabhängigen, bislang ungeklärten Mechanismus. Die Sigma80-abhängigen Klasse 1-Flagellengene werden, anders als bei vielen anderen Bakterien, mit Stoffwechselgenen koreguliert und beinhalten auch die Flagellenmotor- und Chemotaxisgene. Dies spiegelt die Anpassung von H. pylori an seine spezifische ökologische Nische wieder, mit der Notwendigkeit, während der gesamten Infektion die Motilität aufrecht zu erhalten.
Ich praesentiere hier die Klonierung und Funktion eines ACAT-aehnlichen Enzyms von Toxoplasma gondii (T. gondii), das lebensnotwendig fuer T. gondii zu sein scheint. Medikamente, die gegen die menschliche ACAT gerichtet sind, erhoehen in geringen Konzentrationen die ACAT-Aktivitaet von T. gondii. In hoeheren Konzentrationen schraenken sie jedoch die Vitalitaet von T. gondii ein.