Refine
Has Fulltext
- yes (60)
Is part of the Bibliography
- yes (60)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (60) (remove)
Keywords
- Apoptose (60) (remove)
Institute
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (19)
- Institut für Virologie und Immunbiologie (8)
- Pathologisches Institut (8)
- Medizinische Klinik und Poliklinik II (6)
- Abteilung für Molekulare Innere Medizin (in der Medizinischen Klinik und Poliklinik II) (4)
- Institut für Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung (3)
- Medizinische Klinik (bis 2004) (3)
- Graduate School of Life Sciences (2)
- Institut für Pharmakologie und Toxikologie (2)
- Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, Gefäß- und Kinderchirurgie (Chirurgische Klinik I) (2)
Sonstige beteiligte Institutionen
Cofilin
(1999)
This study has identified cofilin, an actin binding protein, as a control element in the reorganization of the actin cytoskeleton which is highly relevant for T lymphocyte activation. Cofilin is regulated in its activity by reversible phosphorylation which is inducible by stimulation through accessory receptors such as CD2 and CD28. First it could be demonstrated that accessory receptor triggering induces the transient association of cofilin with the actin cytoskeleton and that only the dephosphorylated form of cofilin possesses the capacity to bind cytoskeletal actin in vivo. PI3-kinase inhibitors block both the dephosphorylation of cofilin and its association with the actin cytoskeleton. Importantly, cofilin, actin, PI3-kinase and one of its substrates, namely phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) which can bind to cofilin, co-localize within CD2-receptor caps. The cofilin/F-actin interaction has been identified as a crucial regulatory element for receptor cap formation and the strength of signal transduction. To this end, appropriately designed cell permeable non-toxic peptides that are homologous to actin binding motifs of the human cofilin sequence were introduced into untransformed human peripheral blood T lymphocytes. These peptides competitively and dose dependently inhibit the activation induced interaction of cofilin with the actin cytoskeleton in vivo. By this approach it was possible to study, for the first time, the functional consequences of this interaction in immunocompetent T cells. The present data demonstrate that inhibition of the actin/cofilin interaction in human T lymphocytes by means of these cofilin derived peptides abolishes receptor cap formation and strongly modulates functional T cell responses such as T cell proliferation, interleukin-2 production, cell surface expression of CD69, gIFN production, and CD95L expression. Importantly, receptor independent activation by PMA and calcium ionophore circumvents these peptide produced inhibitory effects on lymphocyte stimulation and places the cofilin/actin interaction to a proximal step in the cascade of signaling events following T cell activation via surface signals. The present results are novel since as yet no information existed regarding the molecular elements which link cell surface receptor stimulation directly to the resulting reorganization of the actin cytoskeleton.
B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die größte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entzündung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein mögliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden ähnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um mögliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es möglich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberflächenmoleküls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von fünf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierfür eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminosäureaustauschen bei der Translation führen. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch ergänzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von löslichem Fas (sFas) oder Störungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der frühen MALT-Typ Lymphomgenese und möglicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zurückzuführen. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie völlige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verlängerte Überleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller Fälle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben.
Mechanismen der Toxoplasma-gondii-vermittelten Inhibierung der Apoptose in humanen Wirtszelllinien
(2000)
Als obligat intrazellulärer Parasit und Erreger von lebenslang persistierenden Infektionen in Mensch und Tier dürfte Toxoplasma gondii von der Integrität seiner Wirtszelle in besonderem Maße abhängig sein. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss des Parasiten auf die Wirtszellapoptose zu untersuchen. T. gondii inhibiert die in vitro induzierte Apoptose in humanen HL-60- und U937-Zellen. Dabei muss der Parasit aktiv in die Zelle eindringen, jedoch nicht in dieser replizieren können. Er interferiert dabei mit mindestens zwei Komponenten der Apoptose-Signalkaskade: Erstens vermindert T. gondii die Herunterregulation der Mcl-1-Expression nach Apoptoseinduktion. Das führt dazu, dass trotz Apoptoseinduktion die Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma inhibiert wird und daraufhin die Caspasen 9 und 3 sowie deren Substrate weniger stark aktiviert werden. Zweitens wird die Expression der Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) durch T. gondii inhibiert. Beide Mechanismen könnten an der Inhibierung der Wirtszellapoptose durch T. gondii beteiligt sein und dem Parasiten damit sein intrazelluläres Überleben sichern.
Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts"
(2000)
Advanced Glycation Endproducts (AGEs) entstehen aus nicht-enzymatisch glykierten Proteinen. In einer Folge von Dehydratations-, Kondensations- und Oxidationsschritten entsteht ein heterogenes Gemisch aus farbigen, fluoreszierenden Verbindungen. AGE-modifizierte Proteine sind unlöslich und proteaseresistent, bei ihrer Bildung entstehen freie Radikale und andere reaktive Intermediate. Von der AGE-Bildung betroffen sind vor allem langlebige Proteine mit geringem Umsatz wie Kollagen und Kristallin aber auch pathologische Proteinablagerungen, z.B. in der Alzheimer´schen Demenz (AD). Die Akkumulation von AGEs spielt in der Pathogenese von Komplikationen des Diabetes und der Hämodialyse eine Rolle, für die AD wird eine Beteiligung von AGEs am Krankheitsverlauf diskutiert. Die Alzheimer´sche Demenz ist gekennzeichnet durch den histologischen Nachweis seniler Plaques und neurofibrillärer Bündel in Hirngewebe der Patienten. Auf Ebene des Stoffwechsels kommt es zu einer Verringerung des zerebralen Glukoseumsatzes, es finden sich Marker sowohl für eine Akutphasenreaktion als auch für oxidativen Stress. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die AGE-Bildung in vitro die Aggregation von ßA4, dem Hauptbestandteil der senilen Plaques in der AD, beschleunigt. Der geschwindigkeits-bestimmende Schritt ist dabei die Glykierung des ßA4-Monomers. Durch Zugabe von Übergangsmetall-ionen kann die Vernetzung weiter beschleunigt werden. Dies deutet darauf hin, dass AGEs zur Plaquebildung in der AD beitragen, redox-aktive Eisenionen sind in der AD mit den Plaques assoziiert. Mit Hilfe von Metallchelatoren, Antioxidantien oder mit Substanzen, welche die zur Vernetzung notwendigen Aminogruppen abblocken, lässt sich die Aggregation von ßA4 verlangsamen oder verhindern. AGEs wirken zytotoxisch auf BHK 21 Fibroblasten und humane SH-SY5Y Neuroblastoma Zellen. Die Toxizität unterschiedlicher Modell-AGEs ist abhängig von verschiedenen Faktoren, u.a. von dem zur Herstellung verwendeten Protein und vom Zucker. Die LD50 der Modell-AGEs korreliert mit dem AGE-Gehalt und der Radikalproduktion der Präparationen in vitro. Die AGE-Toxizität ist hauptsächlich radikalvermittelt. Oxidativer Stress lässt sich in AGE-behandelten Zellen durch die Bildung intrazellulärer Lipidperoxidationsprodukte nachweisen. Auf Ebene der Signaltransduktion konnte die Aktivierung des Transkriptions-faktors NfkB als Zeichen der Stressabwehr nachgewiesen werden. Die Gabe von Antioxidantien vor oder gleichzeitig mit den AGEs verringerte den Zelltod. Auch durch das Blockieren des Rezeptors für AGEs (RAGE) mit spezifischen Antikörpern konnte die Zahl überlebender Zellen gesteigert werden. Durch AGEs ausgelöster Stress führt in Neuroblastoma Zellen bereits in Konzentrationen unterhalb der LD50 zu Störungen im Redoxstatus, es kommt zur Depletion von GSH und zu Verschiebungen im Verhältnis GSH/GSSG. Damit einher gehen Veränderungen im Energiestoffwechsel der Zelle, nach anfänglich erhöhter Glukoseaufnahme kommt es im weiteren Verlauf der Inkubation zu einer Verringerung der Aufnahme von Glukose aus dem Medium, gefolgt von einer Zunahme der Laktatausschüttung. Ausserdem wurde eine Depletion von ATP um bis zu 50 Prozent nachgewiesen. Antioxidantien können die Störungen im Metabolismus der Zellen verhindern oder abschwächen, die meisten der getesteten Substanzen konnten Redoxstatus und ATP-Gehalt der Zellen zu normalisieren. Obwohl sich in AGE-gestressten Zellkulturen durch Annexin-Fluorescein-Markierung ein geringfügig erhöhter Prozentsatz apoptotischer Zellen nachweisen ließ und AGEs auch die Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma induzieren, verläuft der durch AGEs ausgelöste Zelltod verläuft offenbar insgesamt nekrotisch. Sowohl durch Radikalproduktion als auch über rezeptorvermittelte Signalwege verursachen AGEs oxidativen Stress und induzieren Veränderungen im Metabolismus der Zelle. Dies führt u. a. dazu, dass für die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle nicht mehr genügend Energie zur Verfügung steht. AGE-Stress trägt damit in einer selbstverstärkenden Reaktionskaskade zur Neurodegeneration bei und kann so an der Pathogenese der AD beteiligt sein. Antioxidantien und auch AGE-Inhibitoren könnten einen interessanten Ansatz zur Entwicklung alternativer Therapien in der AD darstellen.
Mitogene Signale werden von der Plasmamembran zum Zellkern über komplexe z.T. miteinander verknüpfte Signaltransduktionskaskaden übertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Proto-Onkoprotein Cot als eine neue Komponente von mitogenen Signalkaskaden identifiziert, die die Fähigkeit hat, sowohl die klassische mitogene Kaskade als auch den JNK-Streß-Kinaseweg zu aktivieren. Wildtyp und aktiviertes Cot phosphorylieren und aktivieren MEK-1 und SEK-1 in vitro. Expression von onkogenem Cot in 293-, NIH3T3- und PC12- Zellen führt auch in vivo zu einer Phosphorylierung der endogenen Proteine c-Jun und ERK-1/2. In Bezug auf diese Fähigkeit, zwei unterschiedliche Signalkaskaden zu stimulieren, wurden die biologischen Effekte von Cot auf verschiedene Zelltypen, sowie seine tumorauslösende Wirkung in der Maus untersucht. Expression von onkogenem c-Raf-1 oder v-Mos führt zu einer Differenzierung in PC12-Zellen. Cot induziert ebenfalls Neuritenbildung in diesen Zellen. Ähnlich wie v-raf hat onkogenes cot eine antiapoptotische Wirkung auf 32D-Zellen nach IL-3-Entzug. In neugeborenen NSF/N-Mäusen induzierte retroviral-exprimiertes onkogenes Cot nach einer Latenzzeit von 7-10 Wochen B-Zell-Lymphome vergleichbar mit v-raf/v-myc induzierten Tumoren [191]. Diese Daten stimmen mit der Rolle von Cot in der klassischen mitogenen Kaskade überein und lassen darauf schließen, daß die simultane Aktivierung von JNK in diesem Zusammenhang keinen antagonistischen Effekt hat. Aktives NF-kB reguliert die Transkription einer Reihe von Ziel-Genen, die in verschiedenen zellulären Funktionen involviert sind. Viele Stimuli, Mitglieder der mitogenen Kaskade eingeschlossen, aktivieren NF-kB, so z.B. auch c-Raf-1, das mit Cot überlappende Effekte auf Apoptose-Suppression, Transformation und Differenzierung aufweist und auf der gleichen Ebene zu funktionieren scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß Cot NF-kB aktiviert, dieses aber indirekt durch einen autokrinen Loop geschieht, der den EGFR und die Streß-Kinasekaskade involviert. Mit c-Raf-1 konnten in unserem Labor bereits ähnliche Ergebnisse gezeigt werden [234]. Eine direkte Interaktion zwischen Cot und der NF-kB-Aktivierung konnte durch die Identifikation von p105, einem Vorläuferprotein und Regulator von NF-kB, als Cot-Interaktionspartner in einem Two-Hybrid Screen gefunden werden. Die Tatsache, daß Cot mit IKKa und IkBa, beides NF-kB-Regulatoren, copräzipitiert, deutet ebenfalls auf einen direkten Mechanismus der Cot-abhängigen NF-kB-Aktivierung hin. Dieser Prozeß wird hauptsächlich durch den Transport der Komponenten des NF-kB-Transkriptionsfaktorkomplexes und seiner Regulatoren zwischen Zytosol und Nukleus kontrolliert. Das kleine G-Protein Ran spielt eine kritische Rolle in derartigen Transportprozessen und wurde interessanterweise ebenfalls in einem Two-Hybrid Screen als neuer Interaktionspartner von Cot identifiziert. Durch Coimmunopräzipitationsexperimente konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Diese Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der NF-kB-Regulation durch Cot hin und geben neue Ansätze, die komplexen Funktionen von Cot in der Zelle zu diskutieren und weiter zu analysieren.
In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivitäten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. Während des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die überlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand für mindestens weitere 48h unbeeinflußt, benötigen aber zum Überleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt für eine Apoptose typische morphologische Veränderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller für den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivität bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivitäten lieferte Hinweise zur Identität der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivität wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivitäten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivität wird zum größten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinitätsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine während des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivität bietet die beste Grundlage für eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für den mitochondrial-vermittelten Weg, für dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase führt, ist Ziel gegenwärtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, schützen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identität dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es möglicherweise dieser Weg, der zum Überleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten während des Serumentzugs wesentlich beiträgt.
Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus über den Antigenrezeptor führt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation über CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und schützt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation über CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in primären B-Lymphozyten aus Mäusen anregt. Die CD40 Abhängigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem für unreife B-Lymphozyten, bestätigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abhängigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden über chimäre Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression über eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen über den BZR wiesen diese eine größere Überlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erklärt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abhängige Aktivitätsverlust eines NFkB-abhängigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die Überexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, führte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsfähigkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdrückte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsfähigkeit aufrecht erhält, während die andere das Überleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach für letztere von zentraler Bedeutung.
Nach Transplantation moduliert die Leber nicht nur die Immunantwort des Empfängers gegenüber ihr selbst, sondern übt auch auf mittransplantierte Organe einen protektiven Effekt aus. Dieses Phänomen wurde in der vorliegenden Arbeit an dem hoch immunogenen Dünndarm untersucht. Diese Studie war dabei nicht nur unter immunologischen Gesichtspunkten von Bedeutung. So stellt die simultane Leber- / Dünndarmtransplantation für Patienten, die an einer Leberzirrhose infolge eines Kurzdarmsyndrom leiden, eine erfolgversprechende Therapieoption dar. Zur experimentellen Analyse dieser speziellen Transplantationsform existierte aber in der Ratte bisher kein vergleichbares Modell. In der vorliegenden Arbeit wird daher erstmalig ein Modell etabliert, in dem – orientiert an den Verhältnissen beim Menschen – Leber (arterialisiert) und Dünndarm simultan und orthotop transplantiert werden. Mittels kurzfristiger Immunsuppression wurde bei allogener Transplantation hier nicht nur Akzeptanz sondern Toleranz erreicht und mittels Indikator-Herz- und Hauttransplantation überprüft. Die dazu benötigte immunsuppressive Dosis unterschritt dabei die für eine erfolgreiche isolierte Dünndarmtransplantation notwendige Immunsuppression erheblich. Dieser Toleranzentwicklung geht eine zeitlich begrenzte Abstoßungsreaktion voraus. Die daran beteiligten zellulären Mechanismen wurden durch sequentielle Immunhistologie dargestellt. Während dieser Abstoßung sammeln sich überdurchschnittlich viele apoptotische T-Lymphozyten, hauptsächlich CD8+ Zellen, im Lebertransplantat, nicht aber im transplantierten Dünndarm an. Dieses Phänomen konnte mittels einer neu etablierten Doppelfärbung dargestellt werden. Apoptoseinduktion in alloreaktiven T-Zellen könnte einer der Mechanismen sein, die den immunsuppressiven Effekt des Lebertransplantates erklären und den gleichzeitig transplantierten Dünndarm vor seiner Abstoßung bewahren.
Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger.
TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.