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Der primäre Hyperaldosteronismus (PA) stellt aktuell den häufigsten Grund für das Vorliegen einer sekundären Hypertonie dar. Der in der Bestätigungsdiagnostik verwendete Kochsalzbelastungstest basiert dabei auf einem fehlenden Absinken der Aldosteronkonzentration im Testverlauf bei Patient:innen mit PA im Vergleich zu Patient:innen mit essentieller Hypertonie (EH). Die Konzentrationsbestimmung erfolgte bisher mittels Immunoassay. Mit der LC-MS/MS steht jedoch mittlerweile eine weitere wichtige analytische Methode in der quantitativen Bestimmung von Steroidhormonen zur Verfügung, welche in dieser Arbeit im Hinblick auf den Kochsalzbelastungstest untersucht wurde. Hohe Bedeutung kommt außerdem der Subtypdifferenzierung des PA zu, da die Ätiologie der Erkrankung wegweisend für die Art der Therapie ist.
Das Ziel dieser Studie war einerseits die Ermittlung eines LC-MS/MS-spezifischen Aldosteron-Cut-off-Wertes im Kochsalzbelastungstest und die Evaluation des Nutzens der Bestimmung von Steroidprofilen in der Diagnostik des PA.
Zum anderen wurde der diagnostische Nutzen des Orthostasetests zur Unterscheidung von unilateraler und bilateraler Genese bei vorliegendem PA untersucht. Im Rahmen dieser Studien wurden 187 bzw. 158 Patient:innen analysiert, die zwischen 2009 und 2019 bei Verdacht auf oder Vorliegen eines PA im Universitätsklinikum Würzburg vorstellig wurden. Die Diagnose wurde gemäß der aktuellen Leitlinie anhand der Ergebnisse des Kochsalzbelastungstests, NNVKs, Bildgebung und postoperativen Outcomes gestellt. Mithilfe der LC-MS/MS wurden erneut die Aldosteronkonzentrationen der aufbewahrten Serumproben des Kochsalzbelastungstests, sowie ein erweitertes Steroidpanel bestimmt. Unter Verwendung einer ROC-Analyse wurden die jeweils bestehenden Cut-off-Werte optimiert bzw. neu ermittelt. Die mittels Immunoassay bestimmten Aldosteronkonzentrationen lagen um 28 ng/L höher als die mittels LC-MS/MS bestimmten Konzentrationen. Trotzdem lag der neu ermittelte LC-MS/MS-spezifische Aldosteron-Cut-off-Wert für den
Kochsalzbelastungstest bei 69 ng/L und damit höher als der für den Immunoassay geltende, optimierte Aldosteron-Cut-off von 54 ng/L. Unter Verwendung des LC-MS/MS- spezifischen Cut-off-Werts erreichte der Kochsalzbelastungstest eine Sensitivität von 78,6% bei einer Spezifität von 89,3%. Die Sensitivität des Immunoassay-spezifischen Cut-off-Werts betrug 95,2% bei einer Spezifität von 86,9%.
Das Bestimmen des gesamten Steroidprofils führte zu keiner zusätzlichen diagnostischen Information bei Durchführung des Kochsalzbelastungstests.
Bei Betrachtung der gesamten Patient:innenkohorte erreichte der Orthostasetest, basierend auf einem Absinken der Plasmaaldosteronkonzentration nach 4h in Orthostase um ≥ 28% eine Sensitivität von 36,7% bei einer Spezifität von 100%. Wurde das Vorliegen eines gültigen Tests (Cortisolabfall nach 4h ≥ 10%) oder das Vorliegen einer unilateralen Raumforderung in der Bildgebung vorausgesetzt, stieg die Sensitivität des Orthostasetests auf 51,4% bzw. 51,6% bei gleichbleibend hoher Spezifität von 100% an. Abschließend lässt sich sagen, dass der Orthostasetest keine Alternative zum NNVK darstellt, jedoch als einfache, nicht invasive Methode der zusätzlichen Orientierung zur Untersuchung der Ätiologie des PAs dienen kann. Eine prospektive Evaluation der jeweils neu ermittelten Cut-off-Werte wird notwendig sein, um deren Anwendbarkeit im klinischen Alltag zu überprüfen. Außerdem könnte die Bestimmung der Hybridsteroide 18-Oxocortisol und 18-Hydroxycortisol wegweisend für die Genese des PA sein.
Der primäre Hyperaldosteronismus ist eine der häufigsten Ursachen einer sekundären Hypertonie. Entscheidend für eine adäquate Therapie ist die Subtypen-Differenzierung zwischen Aldosteron produzierenden Adenomen und bilateralen Hyperplasien der Nebennierenrinde. Hierfür wird heutzutage eine selektive Katheterisierung der Nebennierenvenen durchgeführt. Diese Untersuchung ist jedoch sehr aufwendig und geht mit einer hohen Strahlenbelastung einher. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit 11 fluorierte Inhibitoren der Aldosteronsynthase (CYP11B2) auf ihre in-vitro- und in-vivo-Wirksamkeit und Selektivität untersucht. Ziel war es, über eine gezielte Bindung radiofluorierter Tracer an Aldosteron produzierenden Zellen eine nicht invasive Bildgebung zur Subtypendifferenzierung beim primären Hyperaldosteronismus zu entwickeln. Hierbei konnten mehrere vielversprechende Substanzen gefunden werden, die selektiv an CYP11B2 binden und die Aldosteronproduktion hemmen. Diese können somit möglicherweise für die Subtypendifferenzierung beim primären Hyperaldosteronismus eingesetzt werden.
Der primäre Hyperaldosteronismus ist die häufigste Ursache einer sekundären Hypertonie. Ein Aldosteronüberschuss kann in vitro und in vivo DNA-Schäden verursachen. In einzelnen Fallberichten wurde über eine Koinzidenz des primären Hyperaldosteronismus mit Nierenzellkarzinomen wie auch anderen Tumoren berichtet. Die Prävalenz benigner und maligner Neoplasien bei Patienten mit primärem Hyperaldosteronismus wurde bislang jedoch noch nicht untersucht.
In der multizentrischen MEPHISTO-Studie wurde die Prävalenz von benignen und malignen Tumorerkrankungen bei 338 Patienten mit bestätigtem primärem Hyperaldosteronismus untersucht. Hypertensive Probanden der populationsbasierten SHIP-Studie dienten als gematchte Kontrollgruppe.
Bei 120 (35,5%) der 338 Patienten mit primärem Hyperaldosteronismus war eine Tumorerkrankung diagnostiziert worden, 30 der Patienten hatten zwei oder mehr Neoplasien. Das Auftreten eines Malignoms wurde bei 9,5% der Patienten mit primärem Hyperaldosteronismus und bei 6,0% der hypertensiven Kontrollgruppe dokumentiert (p=0,08). Patienten mit primärem Hyperaldosteronismus und einem Malignom in der Vorgeschichte wiesen bei der Diagnose des primären Hyperaldosteronismus höhere Aldosteronspiegel auf (p=0,009). Es konnte zudem ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Höhe des Aldosteronspiegels und der Malignomprävalenz beobachtet werden (p=0,03). Insgesamt wurden unter den Patienten mit primären Hyperaldosteronismus 158 Neoplasien nachgewiesen, die in 62% der Fälle benigne und in 25% der Fälle maligne waren (14% Neoplasien unbekannter Dignität). Ein Nierenzellkarzinom wurde bei 5 Patienten (13% aller malignen Tumore) diagnostiziert, in der hypertensiven Kontrollgruppe trat kein Nierenzellkarzinom auf.
Im Vergleich zur hypertensiven Kontrollgruppe wurde bei Patienten mit primärem Hyperaldosteronismus ein Trend hin zu einer erhöhten Prävalenz von Malignomen beobachtet, der beim Nierenzellkarzinom besonders deutlich ausgeprägt und signifikant mit der Höhe des Aldosteronspiegels assoziiert war.
Patienten mit erhöhten Aldosteronspiegeln zeigen eine gesteigerte Inzidenz für Malignome, insbesondere von Nierenzellkarzinomen. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Aldosteron-vermittelte oxidative Nierenschädigung näher zu analysieren sowie die auf Zellebene gezeigte Beeinflussung der antioxidativen Schutzmechanismen im lebenden Organismus nachzuweisen und mögliche therapeutische Ansatzpunkte zu identifizieren. Dazu wurde ein Interventions-versuch über 28 Tage durchgeführt. Neben einer Aldosterongabe wurden folgende Interventionen verwendet: Spironolacton zur Blockade des Mineralkortikoid-Rezeptors (MR), Apocynin als Hemmstoff der NADPH-Oxidasen (Nox), L-NAME zur Blockade der NO-Synthasen (NOS), PDTC, einen Hemmstoff des Transkriptionsfaktors NF-kB sowie Sulforaphan, ein natürlicher Nrf2-Induktor. Eine weitere Gruppe erhielt Sulforaphan ohne additive Aldosterongabe. Die Nierenschäden wurden mittels histopathologischer Schädigungsscores und der Anzahl an DNA-Doppelstrangbrüche analysiert. Die Beeinflussung der antioxidativen Abwehr wurde durch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nrf2 und durch die Quantifizierung antioxidativer Enzyme bestimmt.
Im Nierengewebe führte Aldosteron zu einer Zunahme von oxidativem Stress. Histologisch zeigte sich ein Anstieg von glomerulären Schäden. Auch kam es zu einer deutlichen Zunahme von Doppelstrangbrüchen der DNA. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Aldosteron auch in vivo zu einer Zunahme der Nrf2-Aktivität führte, wobei sich dies auf Proteinebene nicht in einer (dauerhaften) Synthesesteigerung von antioxidativen Enzymen wiederspiegelte und keinen ausreichenden Schutz des Nierengewebes bot. Für die Interventionsgruppen konnte keine signifikante Auswirkung auf das Vorliegen von oxidativem Stress gezeigt werden. Dies könnte an der Versuchsdauer bzw. an der gewählten Nachweismethode gelegen haben. Nichtsdestotrotz zeigte die Blockade der Nox durch Apocynin bzw. der NOS durch L-NAME eine effektive Reduktion der histologischen und genomischen Schäden. Die L-NAME-Gruppe wies dabei die höchsten Blutdruckwerte auf, diese waren auch zur Aldosterongruppe signifikant gesteigert. Die beobachteten Effekte waren folglich nicht durch den in der Aldosterongruppe erfolgten Blutdruckanstieg, sondern vielmehr durch den Anstieg von oxidativem Stress zu erklären. Ebenfalls blieb die Nrf2-Aktivität bei der Gabe von Apocynin und L-NAME weitgehend auf Kontrollniveau, was dafürspricht, dass der in der Aldosterongruppe messbare Nrf2-Anstieg am ehesten als Reaktion auf chronisch erhöhten oxidativen Stress erfolgte, welcher durch die Interventionen ausblieb. Die Blockade von NF-κB mittels PDTC führte zu vergleichbaren Effekten wie Apocynin und L-NAME. Das deutet darauf hin, dass Aldosteron über die Aktivierung von NF-κB die vermehrte Synthese von pro-oxidativen Enzymen wie Nox und NOS anregt. Die Gabe von Spironolacton hatte den stärksten protektiven Effekt, sowohl auf histologische Veränderungen als auch auf das Entstehen von DNA-Doppelstrangbrüchen, wobei die Nrf2-Aktivität in dieser Gruppe ebenfalls auf Kontrollniveau blieb. Die Aldosteroneffekte wurden folglich über den MR vermittelt. Eine additive Nrf2-Induktion mittels Sulforaphan konnte auch keinen (dauerhaften) Effekt auf die Synthese antioxidativer Enzyme zeigen. Dennoch zeigte diese Gruppe einen ähnlich effektiven Schutz vor den oxidativen Nierenschäden wie die Gabe von Spironolacton. Vieles spricht dafür, dass die Wirkung von Sulforaphan dabei über seine Wirkung als direktes Antioxidans bzw. Radikalfänger und nicht über den Nrf2-Weg zu erklären ist.
Aldosteron führt in der Niere über oxidativen Stress zu glomerulärer Fibrose und DNA-Schäden. Das könnte eine Erklärung für die gesteigerte Inzidenz von Nierenzellkarzinomen in Patienten mit erhöhten Aldosteronspiegeln darstellen. Unsere Ergebnisse sprechen dafür, dass Aldosteron über eine Signalkaskade über den MR zu einer Aktivierung von Nox und NOS führt. Der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB scheint dabei durch die Synthese pro-oxidativer Enzyme eine Art Verstärker-Effekt zuzukommen. Als Reaktion auf den durch Aldosteron gesteigerten oxidativen Stress kommt es zu einer Aktivierung des antioxidativen Transkriptionsfaktors Nrf2, jedoch ohne dass dies zu einem ausreichenden Schutz des Nierengewebes führt. Mögliche therapeutische Ansatzpunkte für einen Schutz vor den durch Aldosteron vermittelten oxidativen Nierenschäden scheinen eher innerhalb der Aldosteronsignalkaskade, insbesondere in der Blockade des MR, als in der antioxidativen Abwehr zu liegen.
Die Breite der Wirkungen von Aldosteron auf Nierenzellen wurde lange Zeit unterschätzt. Inzwischen zeigte sich ein nicht unerheblicher Anteil des Hyperaldosteronismus an arterieller Hypertonie und ebenso mehren sich die Hinweise auf damit assoziierter erhöhter Inzidenz für maligne Entartung von Nierengewebe. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Hyperaldosteronismus auf Nierenzellen von Ratten in vivo untersucht. Mittels real time quantitative PCR wurden die relative Expressionsveränderungen der mRNA von validierten Nierenschädigungsmarkern im Hyperaldosteronismusmodell kontrolliert beobachtet und statistisch ausgewertet. Anders als im analog durchgeführten Vorversuch mit DOCA an der Stelle von Aldosteron, ließ sich größtenteils kein über der natürlichen Streuung der Daten liegender, signifikanter Effekt der Nierenschädigung durch überhöhte Aldosteronspiegel nachweisen. Hierfür kommen vielfältige Gründe in Frage. Neben der technischen Variabilität, der Beschaffenheit der internen Kontrolle, potentiell vorhandenen Inhibitoren und der Qualität der mRNA, konnten eine Reihe von weiteren Gründen als Ursache für die Diskrepanz zu den Ergebnissen der mit DOCA behandelten Tiere ausgeschlossen werden. Neben der theoretischen Möglichkeit inter-methodischer Differenzen und sich daraus ergebender Variationen, sowie der noch weiter zu untersuchenden Rolle des Glukokortikoidrezeptors durch dessen variable gleichzeitige Aktivierung, ist die Interpretation im Sinne eines zu gering ausgeprägten Schädigungseffektes durch den Hyperaldosteronismus für den gewählten Stichprobenumfang naheliegend. Hiermit stimmt auch die Tatsache überein, dass der Effekt der Behandlung mit Aldosteron im Vergleich zur Behandlung mit DOCA von vorne herein deutlich geringer ausfallend erwartet wurde.
Der Nachweis von oxidativen Stressmarkern hat bei der Untersuchung von Krankheiten wie Diabetes, Krebs und Hypertonie an großer Bedeutung gewonnen. Vor allem 8-Oxo-2’-desoxyguanosin (8-oxodG) wird gezielt mit verschiedenen Methoden gemessen und als Marker für oxidativen Stress herangezogen. Daneben haben 8 Oxoguanin (8-oxoGua), als Produkt aus der Basenexzisionsreparatur der DNA, sowie 8-Oxoguanosin (8-oxoGuo), als Biomarker für oxidativ geschädigte RNA, bisher weniger Aufmerksamkeit bekommen. Das Renin-Angiotensin Aldosteron System (RAAS) spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung des Blutdrucks. Im Falle einer Hypertonie werden Angiotensin II (Ang II) und Aldosteron (Aldo) über einen langen Zeitraum in erhöhter Konzentration ausgeschüttet. Dieser Umstand bewirkt eine nicht physiologische Wirkung der Hormone des RAAS, welche zu einer Induktion von oxidativem Stress führt. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist es, die oxidative Schädigung, ausgelöst durch Ang II und Aldo, in der DNA und der RNA in vitro und in vivo nachzuweisen und dabei speziell den Biomarker 8-oxodG zu untersuchen.
In-vitro-Experimente wurden mit LLC PK1-Zellen, einer Schweinenierenzelllinie, durchgeführt. Ang II und Aldo lösten einen dosisabhängigen Anstieg der DNA Schäden in LLC PK1 Zellen aus. Eine Zeitabhängigkeit wurde für die ersten 30 Minuten gezeigt. Für die restliche Zeit (4 h) blieb der nachgewiesene DNA Schaden konstant. Der FPG Comet-Assay und die immunzytochemische Färbung zeigten jeweils eine signifikante Zunahme von 8-oxodG in LLC-PK1-Zellen an, während die HPLC MS/MS Messung nur geringe Veränderungen nachwies. Das FPG Enzym erkennt neben 8-oxodG auch andere oxidierte Purine und sorgte so für eine Überbestimmung des DNA-Schadens. Bei der immunzytochemischen Färbung entsteht die Überbestimmung durch Kreuzreaktionen des 8 oxodG Antikörpers mit oxidierten Strukturen in der DNA. Der Vorteil beider Analysemethoden ist die direkte Messung von Schädigungen in der Zelle, während die HPLC-MS/MS eine Isolierung der Nukleinsäuren voraussetzt. Bei diesem Schritt kann es zur Oxidation der Marker für oxidativen Stress kommen, welche einen genauen Nachweis erschwert.
In vivo-Versuche hatten zum Ziel, die oxidativen Stressmarker 8-oxoGua, 8-oxodG und 8-oxoGuo im Urin nachzuweisen. Die Behandlung der C57BL/6-Mäuse und Sprague Dawley-Ratten (SD-Ratten) mit den Hormonen des RAAS zeigten einen Anstieg des Blutdrucks, erhöhte DNA Schäden durch oxidativen Stress sowie erhöhte Exkretionsraten der oxidativen Stressmarker. Durch eine Inhibierung des Angiotensin II-Typ1- oder Mineralkortikoidrezeptors sowie die Mutation des Gens AT1a konnte gezeigt werden, dass die Schädigungen unabhängig vom Blutdruck sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass neben NOX4 auch andere NADPH Oxidasen für den oxidativen Stress verantwortlich sein müssen. Eine Aktivierung des Nrf2 Signalweges in den SD-Ratten hat Einfluss auf die Wirkung von Aldo.
Die Exkretionsrate der oxidativen Biomarker im 20-h-Urin der behandelten Tiere zeigen, wie sich das Gleichgewicht zwischen DNA-Reparatur und oxidativem Stress verändert. Da 80 % der DNA in RNA umgeschrieben werden, ist der Nachweis von 8 oxoGuo in den Fokus gerückt. In der praktischen Anwendung kann mit der Messung von 8 oxodG und 8-oxoGuo ein Krankheits- oder Heilungsprozess auf nicht invasive Weise verfolgt werden. Der Nachweis von 8-oxodG und 8-oxoGuo in den Nukleinsäuren stellt einen Einstieg für die Grundlagenforschung dar, da sie nur eine Momentaufnahme der Nukleinsäureschädigung in der Zelle zeigen. Meist findet eine Überbestimmung, ausgelöst durch die Messmethode, statt. In Gewebeproben kann eine Unterbestimmung vorliegen, falls nicht alle Zelltypen vom oxidativen Stress betroffen sind. Daher sollte es ein vorrangiges Ziel sein, ein stabileres Oxidationsprodukt des Guanins nachzuweisen, um das Gleichgewicht der DNA-Oxidation und Reparatur besser zu verstehen.
Dialysepatienten weisen eine hohe Anzahl kardiovaskulärer Ereignisse auf. Betrachtet man die häufigsten Todesursachen von Dialysepatienten, so fällt ein großer Teil in den kardiovaskulären Bereich. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Aldosteron und Cortisol auf kardiale und vaskuläre Ereignisse bei Dialysepatienten mit Diabetes mellitus untersucht. Dazu wurden Daten von 1255 Dialysepatienten mit Diabetes mellitus aus der Deutschen Diabetes Dialyse Studie analysiert.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass mit erhöhten Aldosteronkonzentrationen ein signifikanter Anstieg des Risikos für plötzlichen Herztod (HR: 1.69; 95% CI: 1.06–2.69) einhergeht. Das Risiko an plötzlichem Herztod zu versterben war bei hohen Konzentrationen von Aldosteron und gleichzeitig vorliegenden hohen Konzentrationen von Cortisol noch deutlicher erhöht (HR: 2.86, 95% CI: 1.32–6.21). Ebenso war die Gesamtsterblichkeit signifikant erhöht bei Patienten, die hohe Aldosteron- und Cortisolkonzentrationen aufwiesen im Vergleich zu Patienten mit niedrigen Spiegeln beider Hormone (HR: 1.62, 95% CI: 1.01–2.62).
In dieser Arbeit konnte somit ein deutlicher Zusammenhang hoher Aldosteron- und Cortisolkonzentrationen mit plötzlichem Herztod und Gesamtsterblichkeit gezeigt werden.
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS, engl. reactive oxygen species) sind hochreaktive Biomoleküle, die in geringen Konzentrationen ubiquitär als Produkte des normalen zellulären Metabolismus entstehen. Zum Schutz vor irreversiblen oxidativen Schädigungen durch diese Moleküle, besitzt der Organismus antioxidative Enzyme und nicht-enzymatische Antioxidantien, die ROS neutralisieren. Eine pathophysiologische Zunahme der Generierung und Freisetzung von ROS und/oder verminderte zelluläre Abwehrmechanismen gegen diese können, in Folge einer gestörten Redox-Homöostase, zur Ausbildung des sog. „oxidativen Stresses“ führen, der unter anderem mit einer Reihe kardiovaskulärer Erkrankungen assoziiert ist. Das Steroidhormon Aldosteron (ALDO), das der Gruppe der Mineralocorticoide angehört, besitzt für den Wasser- und Elektrolythaushalt eine essentielle Bedeutung. Als Agonist bindet ALDO an Mineralocorticoidrezeptoren (MR) in der Niere und im Kolon und stimuliert unter physiologischen Bedingungen über die Aktivierung des MR die renale Rückresorption von Natriumionen und Wasser. Epidemiologische Studien sowie in vitro und in vivo Untersuchungen konnten einen kausalen Zusammenhang zwischen erhöhten ALDO-Serumwerten und/oder einer disproportional erhöhten MR-Aktivierung und einer gesteigerten ROS-Generierung im Herz-Kreislaufsystem belegen. Im Gegensatz zu ALDO besitzt das Sexualsteroid 17β-Estradiol (E2) protektive kardiovaskuläre Effekte. E2 fungiert über zwei intrazelluläre Estrogenrezeptor (ER)-Subtypen, ERα und ERβ, die nach ligandabhängiger Aktivierung als nukleäre Transkriptionsfaktoren die Expression spezifischer Zielgene regulieren. Neben ER-vermittelten vasodilatatorischen und antiinflammatorischen Wirkungen innerhalb der Blutgefäße und des Myokards besitzt E2 unter anderem auch antioxidative Eigenschaften und das Potential die zelluläre Redox-Homöostase günstig zu beeinflussen. Auf Grund dieser Befunde wurde die Hypothese aufgestellt, dass E2 über einen ER-vermittelten Mechanismus dem ALDO-induzierten oxidativen Stress in glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte (PRSMC, für engl. primary rat smooth muscle cells) entgegenwirkt. Zusätzlich sollte durch die Supplementation des ERα-spezifischen Agonisten 16α-LE2 und des ERβ-spezifischen Agonisten 8β-VE2 zu ALDO-behandelten Zellen untersucht werden, ob die beiden ER-Subtypen redundante, spezifische oder gegensätzliche Effekte bezüglich der aufgestellten Hypothese, besitzen. Durch Färbungen hormonbehandelter PRSMC mit dem ROS-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Dihydroethidium (DHE) und anschließender Quantifizierung der DHE-Fluoreszenzintensität konnte bestätigt werden, dass der ALDO-induzierte oxidative Stress durch die Kosupplementation von E2, 16α-LE2 und 8β-VE2 über einen ERα- und ERβ-vermittelten Mechanismus signifikant reduziert werden kann. Des Weiteren konnte im Verlauf dieser Arbeit belegt werden, dass die intrazelluläre Konzentration des Reduktionsäquivalents Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat in seiner reduzierten Form (NADPH) in ALDO+E2-, ALDO+16α-LE2- und ALDO+8β-VE2-behandelten PRSMC im Vergleich zu nur mit ALDO-behandelten Zellen signifikant erhöht ist. Ferner konnte in Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen gezeigt werden, dass die Kosupplementation von NADPH zu ALDO-behandelten Zellen, die DHE Oxidation in diesen Zellen signifikant unterbindet. Mittels Western Blot Analysen und Enzymaktivitätsassays hormonbehandelter PRSMC ließ sich schließlich nachweisen, dass ALDO die Enzymaktivität und Proteinexpression des NADPH generierenden Enzyms Glukose-6-phosphat Dehydrogenase (G6PDH) supprimiert. Weiter konnte innerhalb dieser Arbeit erstmalig bestätigt werden, dass E2 die Suppression der G6PDH-Aktivität durch ALDO unterbindet und die Enzymaktivität dieses Proteins wieder auf den basalen Wert anhebt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass E2 der ALDO-induzierten lokalen ROS-Generierung in PRSMC ER-vermittelt entgegenwirkt. Der zugrunde liegende Mechanismus dieses Effekts basiert auf einer Aufrechterhaltung der G6PDH-Enzymaktivität, wodurch die Bioverfügbarkeit des Reduktionsäquivalents NADPH, das eine Schlüsselrolle im zellulären antioxidativen System spielt, gewährleistet wird.
Das Mineralokortikoid Aldosteron ist ein wichtiger Regulator der Salz- und Wasserhomöostase und damit auch des Blutdrucks. Seine physiologische Wirkung entfaltet es über den Mineralokortikoidrezeptor (MR), indem es zu einer Homodimerisierung bzw. Heterodimerisierung mit dem Glukokortikoidrezeptor führt. Zudem sind die pathophysiologischen Wirkungen des Aldosterons beispielsweise auf das Herz-Kreislauf-System in den Focus gerückt, welche zumindest teilweise auch vom MR abhängig sind. Zur weiteren Charakterisierung dieser Signalwege sollen Interaktionen des MR mit möglichen Zielproteinen untersucht werden. Biolumineszenz Resonanz Energietransfer (BRET) ist eine Methode zur Untersuchung von Proteininteraktionen. Um ein BRET-System für den MR zu erstellen, wurde der MR an eine Renilla Luciferase (Rluc) einerseits und das enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) andererseits gekoppelt. Beide Fusionsproteine wurden auf ihre Funktionalität und Interaktion hin überprüft. Befinden sich die Fusionsproteine in räumlicher Nähe, regt das von der Luciferase emittierte Licht das fluoreszierende Protein an. Das aus Fluoreszenz und Lumineszenz berechnete BRET-Signal steigt und weist damit auf eine Proteininteraktion hin. Ansätze ohne fluoreszierenden Akzeptor korrigieren unspezifische Signaländerungen. Wir untersuchten den Effekt von Aldosteron und dem Aldosteronantagonisten Spironolacton sowie von Geldanamycin, das eine Dissoziation des MR von den Hitzeschockproteinen im Zytoplasma bewirkt. Aldosteron führte zu einer Steigerung des BRET-Signals, was die bereits bekannte Interaktion der Fusionsrezeptoren auch im BRET-System bestätigt. Geldanamycin bewirkte ebenfalls eine Signalsteigerung. Die gleichzeitige Gabe der beiden Substanzen sowie die Gabe von Spironolacton bewirkte keine Veränderung des BRET-Signals. Als Negativkontrolle verwendeten wir ein System mit an EYFP gekoppeltem MR und ungekoppelter Luciferase, also ohne Interaktionspartner für den EYFP-MR. Keine der oben genannten Substanzen führte hier zu einer Änderung des BRET-Signals. Das BRET-System kann damit die Grundlage für die Untersuchung der Interaktionen des MR mit weiteren Zielproteinen darstellen.