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Diese Arbeit zeigt das Vorkommen von fünfundzwanzig neuen Norovirusstämmen in Deutschland und stellt ihre phylogenetischen Verwandschaftsverhältnisse dar. Bei zweien dieser Stämme handelte es sich um natürlich entstandene rekombinante Viren, deren Rekombinationsbruchpunkte innerhalb der Capsidregion lagen. Die Schnittstellen wiesen in ihrer unmittelbaren Umgebung charakteristische Eigenschaften rekombinanter Viren auf. Die Virulenz und die Antigenität des Erregers, sowie die Methoden der taxonomischen Zuordnung wurden in Bezug auf die Tragweite dieser Ergebnisse diskutiert. Die genetische Information für den Virusnachweis wurde aus 119 NV-positiven Stuhlproben von bis zu vier Jahre alten Kindern isoliert und sind in den Städten Hamburg, Bochum, Freiburg, Erlangen und Dresden zwischen 1997 und 1998 gesammelt worden. Durch Amplifikation und Sequenzierung wurde die komplette Capsidsequenz von fünfundzwanzig zuvor noch nicht beschriebenen NV-Stämmen ermittelt und mit Maximum-Likelihood Analysen ihre verwandschaftliche Beziehung als phylogenetischer Baum dargestellt. Durch verschiedene, zum Rekombinationsnachweis geeignete Methoden (Exploratory Tree Analysis, Similarity Plots, Splits Tree und Sawyer´s Test) wurden der Datensatz auf das Vorkommen von Rekombinationsereignissen untersucht. Splits Tree lieferte zunächst Hinweise auf insgesamt drei rekombinante Stämme: Hamburg180/1997/GE (HH180), Hamburg137/1997/GE (HH137) und Bochum272/1987/GE (BO272). Durch die im Anschluss verwendeten Methoden (s. o.) wurden jedoch nur die zwei Erstgenannten als Mosaiksequenzen bestätigt, so dass der Stamm BO272 nicht in die Endergebnisse aufgenommen wurde. Sim Plot und Exploratory Tree Analysis ordneten den rekombinanten Stämmen die jeweiligen Parentalstämme zu. Dem zufolge entstanden beide Rekombinanten aus Viren der NV-Genogruppe II/4, HH180 aus Hamburg189/1997/GE und Bochum024/1998/GE und HH137 aus Hamburg189/1997/GE und Hamburg139/1997/GE. Durch das Programm LARD wurden die genauen Lokalisationen der jeweiligen Rekombinationsbruchpunkte ermittelt. Diese befanden sich beim Stamm HH180 an den Sequenzpositionen 519 nt und 762 nt und beim Stamm HH137 an der Position 768 nt. Vor und nach diesen Bruchpunkten wurden Maximum-Likelihood-Bäume aus dem rekombinantem Stamm, den beiden Parentalstämmen und einer Außengruppe erstellt. Mit hohen Boostrapwerten für die einzelnen Verzweigungen wechselten beide rekombinanten Stämme nach jedem Bruchpunkt ihre phylogenetische Zugehörigkeit zu einem anderen Parentalvirus innerhalb des konstruierten Baumes. Um beurteilen zu können, ob Noroviren generell dazu neigen, genetische Information auszutauschen, wurde die Struktur der Rekombinationsregion anaysiert und mit der Struktur von Viren, bei denen Rekombinationsereignisse gehäuft nachgewiesen werden konnten, verglichen. Beide Stämmme zeigten typische Eigenschaften von sogenannten ‚homologous recombination activators’. In Bezug auf die Genomorganisation befanden sich bei jeder Rekombinanten eine der Schnittstellen im Bereich der Protruding-Region der Capsidsequenz, in der sich vermutlich die Antikörper-Bindungsstelle des Virus befindet. Diese Studie zeigt also im Einklang mit späteren Ergebnissen, dass homologe Rekombination innerhalb des NV-Capsidgens kein isoliertes Ereignis darstellt. Im Hinblick auf immunologische Bedeutung und Klassifikation wurde die Tragweite von Rekombinationsereignissen innerhalb verschiedener Genomabschnitten diskutiert und alternative Lösungen vorgeschlagen. Es ist fraglich, ob bei natürlichem Vorkommen von Rekombination in wahrscheinlich immunologisch bedeutsamen Regionen des Virusgenoms die Sequenzierung der Polymerase-Region zur Klassifikation ausreicht, oder ob die Verwendung der Capsidregion sinnvoller wäre.
Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind.
Der erste Teil der vorliegenden Arbeit befasste sich mit der Wirkung von Antioxidantien auf die Apoptose. Dabei sollte vor allem die Abhängigkeit der Apoptosereaktion von der verwendeten Zellinie geprüft werden. Zwei verschiedene Zellmodelle kamen zum Einsatz, A3.01 T-Zelllymphoblasten und E6-1 Jurkat-Zellen. Als Antioxidantien wurden das natürlich vorkommende N-Acetylzystein und das synthetische Antioxidans BHA ausgewählt. Die Zellen wurden mit CD95L stimuliert, und mit den entsprechenden Antioxidantien behandelt. Nach der Inkubation wurden sie mit AnnexinV und 7AAD gefärbt. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, 7AAD an den Nukleus. Die Zellen wurden im Durchflusszytomter analysiert. Zellen, die nur Annexin V positiv waren, wurden als apoptotisch gezählt, während Zellen die für AnnexinV und 7AAD positiv waren (also einen Membranstörungen aufwiesen) als nekrotisch betrachtet wurden. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich schließen, dass die Apoptose in verschiedenen Zelllinien über unterschiedliche Signalwege vermittelt wird. A3.01 Zellen waren bereits für die Existenz eines nekrose-ähnlichen Zelltodes unter Caspaseinhibition bekannt. BHA konnte diesen nekrose-ähnlichen Zelltod verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass BHA nach Apoptoseinduktion ohne Caspaseinhibitoren eine stärkere Apoptose induziert als ein CD95-Ligand alleine. Dieselbe Reaktion konnte bei peripheren Blutmonozyten (PBMC) beobachtet werden. Bei E6-1 Jurkat-Zellen, die nach Inhibition der Caspase keinen nekrotischen Zelltod erleiden, kam es nach der Behandlung mit BHA und CD95 zu einer Abnahme der Apoptose. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die verwendeten Zellinien unterschiedlichen Zelltypen angehören: A3.01 Zellen und PBMC könnten den Typ 1 Zellen zugeordnet werden, die für die Durchführung der Apoptose auf Caspasen angewiesen sind, E6-1 Zellen könnten Typ 2 Zellen verkörpern, die zusätzlich noch auf mitochondriale Stimulation angewiesen sind, um apoptotisch zu werden. Diese mitochondriale Stimulation könnte durch BHA verhindert werden und so bei E6-1 Jurkat-Zellen Apoptose verhindern. NAC hingegen zeigte in der vorliegenden Arbeit einen anti-apoptotischen Effekt sowohl bei der A3.01 Zelllinie, als auch bei E6-1 Jurkat-Zellen. Hieraus könnte geschlussfolgert werden, dass NAC bereits zu einem früheren Zeitpunkt in den Ablauf der Apoptose eingreift. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Reaktivierung von HIV in der chronisch-infizierten T-Zelllinie ACH-2 durch bakterielle CpG-Sequenzen. Auch hier wurden die Zellen mithilfe der Durchflußzytometrie analysiert. Die HIV-Replikationsrate wurde quantitativ mit einem p24-Antikörper gemessen. Es wurde gezeigt, dass CpG-Motive in dieser Zellinie in vitro eine Reaktivierung der HIV-Replikation bewirken. Dieser Effekt wurde nicht durch die PTO-Modifikation der CpG-ODN hervorgerufen, sondern war spezifisch für die CpG-Sequenzen. Eine Behandlung mit ODNs ohne CpG-Sequenzen führte nicht zu einer Induktion der HIV-Replikation in ACH-2-Zellen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die verwendeten Cpg-Sequenzen die latent-infizierte T-Zellinie ACH-2 nicht aktivieren, sondern nur die Virusreplikation anstoßen. Versuche mit humanen nicht-infizierten PBMCs zeigten, dass CD3-positive Zellen, ähnlich wie ACH-2-Zellen, durch CpG-ODNs nicht aktiviert werden, CD3-negative PBMCs dagegen konnten durch die Behandlung mit CpG-ODNs aktiviert werden. Die Reaktivierung von HIV konnte durch die Inhibition verschiedener Transkriptionsfaktoren nicht wesentlich beeinflusst werden. Die NFkB-Inhibtoren CAPE und SN50 und der ERK-MAP-Kinase-Inhibtor UO126 verhinderten die durch CpG-ODNs induzierte HIV-Replikation in ACH-2 Zellen nicht. Unter dem Einfluss von CAPE wurde sogar ein geringfügiger Anstieg der Virusreplikation beobachtet. Dieser Effekt ist wahrscheinlich aber durch die intrinsische Aktivität von CAPE erklärbar. Die Frage nach den distalen Faktoren in den aktivierten Signalwegen muss also unbeantwortet bleiben. Könnten die in dieser Arbeit in vitro beobachteten spezifischen Effekte der CpG-ODNs in vivo bei HIV-positiven Patienten ausgelöst werden, so wäre das ein Schritt mehr in Richtung der vollständigen Eliminierung des Virus aus dem infizierten Organismus. Durch diese Methode könnten die Virusreservoirs in ruhenden T-Zellen, Makrophagen und dentritischen Zellen reaktiviert werden und wären so einer effizienten Therapie mit HAART zugänglich. Als nächster Schritt in diesem Bereich der Forschung sollten deswegen Versuche zu der Wirkung von CpG-Sequenzen auf chronisch-infizierte Zellen HIV-positiver Patienten unternommen werden, um die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ex vivo zu untersuchen.
In dieser Arbeit wurden im Versuchstier Ratte die Transmission von T.gondii über die Muttermilch und deren immunologische Konsequenzen analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass sich Rattenmilch als labordiagnostisches Medium eignet, wobei der direkte visuelle Parasitennachweis mit dem Lichtmikroskop, trotz verschiedender Aufbereitungsmethoden erfolglos blieb. Auch die PCR eignete sich für unsere Versuche nicht als Nachweismethode. Als geeignte und sensitive Methode für den Parasitennachweis in Rattenmilch stellte sich die Anzucht auf humanen Vorhautfibroblasten (HFF-Zellkultur)dar, wobei bereits zwei Tachyzoiten, die in vitro zu Milch nicht infizierter Tiere gegeben wurden, ausreichten, um eine HFF-Zelle zu infizieren. Immunisierungsexperimente wurden durchgeführt, um die Frage zu klären, ob die im Serum von Jungtieren nachgewiesenen Toxoplasma-spezifischen Immunglobulinen über die Muttermilch aufgenommen worden sein könnten. Es gelang in Milch und Serum der Ammen, sowie im Serum der Jungtiere, T. gondii spezifische Immunglobuline nachzuweisen. Die Transmission des Parasiten als freier Tachyzoit wurde in dieser Arbeit simuliert. Tachyzoiten von T. gondii wurden in verschiedener Dosierung in Rattenmilch angereichert und 48 Stunden alten Ratten verabreicht. Die humorale und zelluläre Immunantwort wurde getestet. Tachyzoiten, die über die Milch aufgenommen wurden, können eine Infektion auslösen. Ratten wurden schließlich auf natürlichem Wege über Milch mit T. gondii infiziert, die humorale Immunantwort bestimmt und der Gehalt der infizierten Rattenmilch an Immunglobulinen überprüft. Die Antikörperkonzentration in Serum und Milch der Ammen zeigte eine deutliche Korrelation und im Serum der Nachkommen ließen sich ebenfalls Antikörper nachweisen. Zeichen einer Infektion fanden sich jedoch nicht. Die Rattenmilch kann also T. gondii und toxoplasmaspezifische Immunglobuline enthalten, die von Nachkommen aufgenommen werden. Den Mechanismus der Parasitenübertragung und die Rolle maternaler parasitenspezifischer Immunglobuline für Infektion und parasitenspezifische Immunantwort der Nachkommen gilt es jedoch noch zu klären.
Immunogenität von retroviralen und lentiviralen Vektoren wurde als ein Haupthindernis für deren Applikation in der Gentherapie betrachtet worden. Dies kann jedoch als Vorteil für den Einsatz dieser Vektoren als Impfstoffkandidaten gegen HIV-Infektion und AIDS genutzt werden. Um das Potenzial von lentiviralen Vektoren eine humorale und zelluläre Immunantwort zu induzieren zu prüfen, wurde eine Reihe VSV-G-pseudotypisierter replikations-inkompetenter HIV-1-Vektoren hergestellt, die entweder ein Kodon-optimiertes HIV-p17/p24 (hgag)- oder das Grün fluoreszierende Protein (GFP)-Transgen enthalten. Die Infektion mit dem VSV-G pseudotypisierten HIV-1-Vektor pGJ2 führte in allen getesteten Zelllinien und auch in primären humanen und murinen Zellen zur Transgenexpression. Ebenfalls konnte eine direkte Expression des Transgens in vivo nachgewiesen werden. Balb/c-Mäuse wurden in einem Vektoren- oder DNA-Prime und Vektoren-Boost-Verfahren immunisiert und die humorale und zelluläre Immunantwort wurde untersucht. Die Primärimmunisierung mit DNA und Boosting mit den lentiviralen Vektoren induzierte eine Gag-spezifische humorale Immunantwort, hohe Titer von VSV-G-neutralisierenden Antikörpern und eine Gag- und EGFP-spezifische zytotoxische T-Zell-Antwort. Dabei wurde festgestellt, dass sowohl Strukturbestandteile des lentiviralen Vektors als auch die Transgenexpression zur Aktivierung der Immunantwort beitrugen. So machen die einzigartigen biologischen und immunologischen Eigenschaften der replikationsdefizienten HIV-Vektoren aus diesen Konstrukten wertvolle Werkzeuge, um weiter die Immunmechanismen, die für den Schutz gegen HIV-Infektion und Krankheit bedeutsam sind, zu studieren. Im Rahmen der hierzu durchgeführten Arbeiten wurden außerdem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektoren hergestellt und analysiert. Um die Transkription der lentiviralen Vektor-Kassette durch das Vacciniavirus zu ermöglichen, wurde vor den Transkriptionsstart ein Vaccinia-Promotor gesetzt und an das 3’-Ende das Transkription-Stoppsignal angehängt. Obwohl die genomische Analyse eine erfolgreiche Herstellung der Hybridvektoren bestätigen konnte, muss die Produktion der lentiviralen Vektoren nach der Vaccinia-Infektion weiter optimiert werden. Nichtsdestotrotz könnte die Kombination von replizierenden Vacciniaviren und replikationsinkompetenten HIV-Vektoren ein neuartiges Impfkonzept darstellen. Die Expression von HIV-Strukturgenen würde in der ersten Phase der Infektion mit dem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektor zu einer starken humoralen und zellulären Immunantwort führen. Die Bildung von lentiviralen Vektoren würde diese Immunantwort weiter boosten, und falls die lentivirale Vektorkassette dann ein entsprechendes Transgen enthalten würde, würde dies weiter die Immunantwort verstärken und vor allem könnte diese Art des Impfstoffes eine langzeitige falls nicht dauerhafte HIV-spezifische Immunantwort erzeugen.
Die Morphogenese von Viruspartikeln und deren Freisetzung aus infizierten Zellen sind späte Schritte im viralen Lebenszyklus. Matrix-Proteine (M) negativsträngiger RNA-Viren und Retroviren, bei denen es sich um periphere Membran-assoziierte Proteine handelt, spielen für diese Prozesse eine besonders wichtige Rolle. Im Verlauf der Masernvirus (MV)-Infektion interagiert das M-Protein mit dem viralen Nukleoproteinkomplex im Innern der Viruspartikel einerseits und mit den viralen Glykoproteinen auf der Oberfläche andererseits. Die Bedeutung des MV M-Proteins für die Partikelproduktion und sein intrazellulärer Transport wurden bislang wenig untersucht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das MV M-Protein in höhermolekularen Komplexe oligomerisiert und transient mono-ubiquitiniert vorliegt. Beide biochemischen Eigenschaften des M-Proteins sind wahrscheinlich für die Partikelentstehung von Bedeutung, wie durch Studien an M-Protein-Orthologen anderer Viren bereits belegt wurde. Das MV M-Protein assoziierte mit Membranen und speziellen Membranmikrodomänen, sogenannten Detergenz-resistenten Membranfraktionen (DRMs), und vermittelte nach transienter Expression in Fibroblasten die Produktion Virus-ähnlicher Partikel (virus-like particles, VLPs). Es ist beschrieben, dass umhüllte Viren präferenziell aus DRMs freigesetzt werden. Die Koexpression des MV-Glykoproteins F erhöhte den Anteil mit DRM-assoziierten M-Proteins um ein Vierfaches, steigerte jedoch, wie auch das H-Protein, die Effizienz der VLP-Freisetzung nicht. Überraschenderweise waren beide jedoch selbst in der Lage VLPs zu induzieren. Die Effizienz der VLP-Produktion war gering und entsprach der der Viruspartikelfreisetzung. Dendritische Zellen (DCs) sind für MV semipermissiv. Obwohl alle viralen Proteine synthetisiert werden, wird kein infektiöses Virus freigesetzt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Lokalisation der M-, H- und N-Proteine dramatisch von der in der produktiv infizierbaren Fibroblastenzelllinie HeLa abweicht. Während in infizierten HeLa-Zellen das M-Protein mit Lamp-1-positiven späten Endosomen kolokalisierte, akkumulierten in DCs alle untersuchten viralen Proteine in einem spät endosomalen Kompartiment, das das Tetraspanin CD81, aber nicht Lamp-1, enthielt und möglicherweise an der MHC-Klasse-II-abhängigen Antigenpräsentation beteiligt ist.
Coronaviren besitzen mit etwa 30 kb das größte Genom aller bisher bekannten RNA-Viren. Die Synthese der subgenomischen RNAs findet durch einen einzigartigen Mechanismus, die sog. diskontinuierliche Transkription, statt. Diese beiden Besonderheiten erfordern einen leistungsfähigen Replikationskomplex, der sich aus den Prozessierungsprodukten der Polyproteine 1a und 1ab und einigen zellulären Proteinen zusammensetzt. Die Aktivitäten und die Expression der beteiligten Proteine werden auf co- und posttranslationeller Ebene reguliert. Dazu gehört eine ribosomale Leserasterverschiebung, die das Verhältnis zwischen den ORF1aund ORF1b-kodierten Proteinen festlegt, sowie eine umfangreiche proteolytische Prozessierung durch virale Proteasen. Während die hochkonservierten ORF1b-kodierten Proteine vor allem RNA-synthetisierende und -prozessierende Funktionen besitzen, übernehmen die weniger konservierten ORF1a-kodierten Proteine vor allem organisierende oder regulierende Funktionen. So sind sie beispielsweise maßgeblich an der intrazellulären Lokalisation, strukturellen Organisation und proteolytischen Regulation des Replikationskomplexes beteiligt und haben darüber hinaus nichtessentielle Aufgaben, die möglicherweise bei spezifischen Interaktionen des Virus mit seinem Wirt von Bedeutung sind. Die meisten der bisher charakterisierten ORF1bkodierten Proteine besitzen essentielle Enzymfunktionen im viralen RNA-Metabolismus. Einige dieser Enzyme, wie die NendoU oder ExoN, sind spezifisch für die Nidovirales oder nur bestimmte Nidovirusfamilien. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels eines revers-genetischen Ansatzes versucht, die Funktion und Bedeutung verschiedener viraler Proteine im Replikationszyklus von HCoV-229E zu untersuchen. Dazu wurden Transkripte von HCoV-229E-cDNAs genomischer Länge, in die entsprechende Substitutionen eingeführt worden waren, in Zellen transfiziert und anschließend analysiert, inwieweit eine virale RNA-Synthese stattfand. Sofern sich infektiöse Viren im Zellkulturüberstand befanden, wurde diese näher charakterisiert, insbesondere um mögliche Defekte in der Virusreplikation und Veränderungen in der Sequenz zu identifizieren. Es wurde gezeigt, dass die Nichtstrukturproteine 13, 14, 15 und 16 wichtige Funktionen innerhalb der viralen RNA-Synthese besitzen, wobei die Aktivitäten von nsp13 und nsp16 essentiell waren. Als besonders kritisch erwiesen sich auch die zinkbindenden Reste der Nterminalen Subdomäne (ZBD) des Nichtstrukturproteins 13. Das Nichtstrukturprotein 14 besitzt ebenfalls eine zentrale Rolle innerhalb der viralen RNA-Synthese und scheint darüber hinaus an der Synthese der subgenomischen RNAs beteiligt zu sein. Die Bedeutung von nsp15 für die Lebensfähigkeit von HCoV-229E konnte anhand entsprechender Mutanten zweifelsfrei nachgewiesen werden, wobei die maßgeblichen Defekte wohl nicht ausschießlich in der RNASynthese, sondern eher in einem späteren Schritt des Replikationszyklus zu suchen sind. Mittels verschiedener Mutanten, die Substitutionen an Spaltstellen der MPRO trugen, konnte die essentielle Bedeutung der posttranslationellen Regulation der Replikaseaktivität durch die Hauptprotease gezeigt werden. In den allermeisten Fällen führten Mutationen, die die Spaltungseffizienz reduzierten, zu einem Abfall in der RNA-Synthese und lebensfähige Viren konnten nicht isoliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Replikon auf der Basis des HCoV-229E hergestellt, das über Monate in Zellkultur gehalten und dessen Reportergenexpression durch Fluoreszenz- Mikroskopie beobachtet werden konnte. Es zeigte sich, dass für eine dauerhafte Koexistenz von Wirtszelle und Replikon-RNA nur wenige Veränderungen im viralen Genom notwendig waren. Mit Hilfe eines mutierten Derivats dieses Replikons gelang es, den Defekt einer viralen nsp15- Mutante näher zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit widmete sich der Charakterisierung von chimären HCoV-229E-Klonen, deren Nichtstrukturproteine 7 und 8 bzw. 7 bis 9 gegen die entsprechenden Proteine des HCoVNL63 ausgetauscht wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die Nichtstrukturproteine 7 und 8 von derselben Spezies stammen müssen, damit RNA-Synthese stattfindet, was auf eine essentielle Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen schließen ließ. Die Identifizierung und Analyse adaptiver Mutationen in allen hier untersuchten chimären Klonen zeigte, dass offenbar neben der nsp7-nsp8-Interaktion noch weitere Interaktionen dieser Proteine mit anderen Proteinen, wie zum Beispiel nsp12 und nsp13, auf funktioneller und/oder struktureller Ebene von Bedeutung sind. Darüber hinaus ließen eine Reihe von Mutationen im Bereich des Leserasterverschiebungselements darauf schließen, dass sich bei diesen Viren die Leserasterverschiebungsrate geändert haben könnte. Diese Hypothese konnte durch In-vitro- Translationsexperimente bestätigt werden. Es zeigte sich, dass durch diese Mutationen die Leserasterverschiebungsrate von 50 % in der wildtypischen Situation auf 65 - 70 % angehoben wurde. Diese relative Überexpression von ORF1b-Proteinen scheint zur Kompensation funktioneller Defekte, die durch die Fremdproteine nsp7 und nsp8 verursacht wurden, beizutragen. Obwohl bei den meisten chimären Klonen eine RNA-Synthese auf nahezu wildtypischem Niveau beobachtet werden konnte, wiesen Reduktionen im Virustiter um 60 - 90 % auf verbliebene funktionelle Defekte im Replikationszyklus dieser Viren hin.
Der Killer cell lectin-like receptor G1 ist ein inhibitorischer Rezeptor, der auf 40-50% der NK- Zellen sowie 1-3% der CD8+ T-Zellen der Maus exprimiert wird. In dieser Arbeit konnte KLRG1 erstmals auf einer Untergruppe von ca. 1-2% der peripheren CD4 Zellen der Maus mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen nachgewiesen werden. Diese Population ist polyklonal und weist den Phänotyp „regulatorischer“ d.h. für die Aufrechterhaltung der Toleranz essentieller T-Zellen auf. Die Anzahl dieser Zellen bleibt im Laufe des Lebens einer Maus konstant. Nur einer kleiner Teil der Zellen nämlich etwa 5% gehört zu den NKT-Zellen, wie die 4 Farbenfluoreszenzanalyse belegt hat. KLRG1+CD4+ Zellen werden im Gegensatz zu den regulatorischen CD25+CD4+ Lymphozyten nicht im Thymus gebildet, befinden sich aber in allen anderen lymphatischen Kompartimenten. T-Lymphozytenfunktionstests zeigten, dass KLRG1 eine Untergruppe von CD4+ Zellen markiert, welche die Proliferation anderer CD4+T-Zellen inhibieren kann und damit funktionelle Eigenschaften regulatorischer T-Zellen aufweist. KLRG1 ist also ein neuer nützlicher Marker zur Identifikation einer Subpopulation von regulatorischen T-Zellen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von MV auf die Expression und Nutzung verschiedener Rezeptoren auf Dendritischen Zellen (DC) untersucht. Dazu wurden DC in vitro aus Monozyten gewonnen und mit IL- 4 und GM-CSF ausdifferenziert. In der Arbeit wurden das Wildtypvirus WTF und der Vakzinestamm ED eingesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Expression der Chemokinrezeptoren 5 (CCR5) und 7 (CCR7) auf MV-infizierten DC-Kulturen sowie das Migrationsverhalten der DC untersucht. Die Expression von CCR5 ist abhängig vom Reifungszustand der DC. Während unreife DC CCR5 exprimieren, verringert sich die Expression im Zuge der Ausreifung, während die Expression von CCR7 induziert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die MV-Infektion einer DC-Kultur die Expression von CCR5 nicht beeinflusst, obwohl die Expression anderer charakteristischer Reifungsmarker erhöht wird. Weiterhin konnte die Expression von CCR7 durch eine Infektion der DC-Kulturen mit MV nicht induziert werden. Die Ergebnisse der durchgeführten durchflusszytometrischen Analysen zur Rezeptorexpression wurden in Chemotaxis-Assays eingehender untersucht. DC aus MV-infizierten Kulturen zeigten trotz anhaltender CCR5-Expression nur eine geringe Migration in Richtung des CCR5-Liganden CCL-3. Aufgrund der fehlenden CCR7- Expression konnte erwartungsgemäß keine Migration der eingesetzten DC gegenüber dem CCR7-Liganden CCL-19 beobachtet werden. Weiterhin konnten Unterschiede im induzierten Chemokinmuster in MV-infizierten DCKulturen im Vergleich zu LPS-ausgereiften oder mit einer Mockpräparation behandelten DC nachgewiesen werden. Kurz nach der Infektion konnte in MVinfizierten DC-Kulturen eine reduzierte Menge CXCL-8 und CCL-20 sowohl auf mRNA Ebene als auch auf Proteinebene detektiert werden. In weiteren Experimenten konnte eine verminderte Migration von T-Zellen auf Zusammenfassung 152 Zellkulturüberstände aus infizierten DC-Kulturen im Vergleich zu Überständen aus LPS-behandelten DC-Kulturen festgestellt werden. Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit konnte MV als Ligand für das DCspezifische Oberflächenmolekül DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule (ICAM)-3 grabbing non-integrin) identifiziert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass beide verwendeten Virusstämme an DC-SIGN binden können, DC-SIGN jedoch keinen Eintrittsrezeptor für MV darstellt. Weitere Analysen zeigten, dass DC-SIGN die Infektion, besonders bei geringen Viruskonzentrationen, verstärkt. In erster Linie zeigt die MV-Infektion unreifer DC die Bedeutung von DC-SIGN als Bindungsrezeptor für MV. Die hohe Expression von DC-SIGN auf unreifen DC ermöglicht eine effiziente effektive Infektion dieser Zellen. Auf reifen DC ist der Einfluss von DC-SIGN auf die Effektivität der Infektion der DC deutlich verringert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die Kontaktzeiten zwischen DC und TZellen in dreidimensionalen Kollagenmatrices untersucht. Dabei wurde eine in etwa doppelt so lange Kontaktzeit zwischen MV-infizierten DC und durch Oxidative Mitogenese veränderten T-Zellen gegenüber LPS-behandelten DC bzw. MV-infizierten und nicht-modifizierten T-Zellen festgestellt. In den parallel durchgeführten Proliferationstests wurde eine reduzierte Proliferation der TZellen beobachtet, die mit MV-infizierten DC kokultiviert wurden. Im Gegensatz zu den kürzeren Kontakten zwischen LPS-behandelten DC und modifizierten TZellen waren die Kontakte zwischen MV-infizierten DC und modifizierten TZellen nicht-stimulatorisch.
Coronaviren können sowohl den Menschen als auch zahlreiche Tierspezies infizieren und verursachen vor allem respiratorische und enterale Erkrankungen. Die Replikation des etwa 27-32 kb großen, einzelsträngigen RNA-Genoms positiver Polarität und die Synthese zahlreicher subgenomischer RNAs erfolgt durch einen Multi-Enzym-Komplex, der bis zu 16 virale nichtstrukturelle Proteine (nsp) und einige zelluläre Proteine umfaßt. Die einzelnen nichtstrukturellen Proteine werden durch proteolytische Prozessierung der vom Replikasegen kodierten Vorläufer-Polyproteine (pp1a/pp1ab) unter Beteiligung viraler Proteasen freigesetzt. Das größte replikative Protein, nsp3, befindet sich im aminoterminalen Bereich der Polyproteine pp1a/pp1ab. Trotz des geringen Konservierungsgrades dieser Region wurden bestimmte funktionelle Domänen, die in allen coronaviralen nsp3 konserviert sind, identifiziert. Dazu gehören: eine saure Domäne, zwei Papain-ähnliche Proteasen (PL1pro und PL2pro) sowie zwei weitere konservierte Domänen (X- bzw. Y-Domäne). Frühere Studien konzentrierten sich vor allem auf die PLpro-Domänen, während die Funktionen der anderen nsp3-Domänen bisher nicht untersucht wurden. Um weitere Einblicke in die nsp3-vermittelten Aktivitäten und ihre Funktionen im coronaviralen Lebenszyklus zu gewinnen, wurden im Rahmen dieser Arbeit die enzymatischen Aktivitäten von zwei nsp3-Domänen, PLpro und X, näher charakterisiert. Coronavirale Papain-ähnliche Proteasen spalten den aminoproximalen Bereich der Polyproteine pp1a/pp1ab und sind somit an der Freisetzung von nsp1, nsp2 und nsp3 beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde die durch die PLpro vermittelte proteolytische Prozessierung des N-terminalen Endes von nsp3 bei TGEV und SARS-CoV analysiert. Übereinstimmend mit früheren Vorhersagen ergaben In-vitro-Translationsexperimente und Proteinsequenzierungen, dass die TGEV-PL1pro die Peptidbindung zwischen Gly879 und Gly880 spaltet, wodurch das aminoterminale Ende von nsp3 bzw. das carboxyterminale Ende von nsp2 freigesetzt werden. Diese Schnittstelle entpricht bei SARS-CoV der Sequenz Gly818|Ala819, die jedoch bei diesem Virus von der PL2pro prozessiert wird. Mutationsanalysen ergaben weiterhin, dass die Reste Cys1093 (TGEV-PL1pro) und Cys1651 (SARS-CoV-PL2pro) für die proteolytische Aktivität essentiell sind. Diese Daten stützen Vorhersagen zu möglichen katalytischen (nukleophilen) Funktionen dieser beiden Reste. Darüber hinaus wurde das stromaufwärts gelegene nsp2 in TGEV-infizierten Zellen identifiziert. Diese Daten, zusammen mit vorherigen Studien, legen den Schluss nahe, dass die Coronavirus-PLpro-vermittelte proteolytische Prozessierung –trotz der geringen Konservierung des Polyproteinsubstrates und bestehender Unterschiede hinsichtlich der Anzahl konservierter PLpro-Domänen– weitgehend konserviert ist. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die enzymatische Aktivität einer weiteren konservierten Domäne im coronaviralen nsp3, der sogenannten X-Domäne, untersucht werden. Für diese Domäne war eine ADP-Ribose-1"-Monophosphatase-Aktivität (Appr-1"-pase) vorhergesagt worden. Um die Eigenschaften dieser Proteine näher zu bestimmen und möglicherweise existierende Gemeinsamkeiten zwischen coronaviralen Enzymen, die den viralen Lebenszyklus steuern und/oder kontrollieren, zu identifizieren, wurden die X-Domänen von drei verschiedenen Coronaviren, HCoV-229E, TGEV und SARS-CoV, die unterschiedlichen serologischen Coronavirus-Gruppen angehören, in vitro untersucht und miteinander verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass bakteriell (E.coli-) exprimierte X-Domänen aller drei untersuchten Viren ADP-Ribose-1"-Phosphat, ein Nebenprodukt des zellulären tRNA-Splicings, zu ADP-Ribose dephosphorylieren können. Diese Daten beweisen zweifelsfrei die Appr-1"-pase-Aktivität coronaviraler X-Domänen und lassen vermuten, dass diese Aktivität bei allen Coronaviren konserviert ist. Weitere Untersuchungen zur Substratspezifität und zu möglichen katalytischen Resten des Enzyms wurden mit Hilfe bakteriell exprimierter, mutierter Formen der HCoV-229E-X-Domäne durchgeführt. Die gewonnenen Daten legen die Vermutung nahe, dass die Phosphohydrolaseaktivität hochspezifisch für das Substrat Appr-1"-p ist und die HCoV-229E-pp1a/pp1ab-Reste Asn1302, Asn1305, His1310, Gly1312 und Gly1313 an der Ausbildung des aktiven Zentrum des Enzyms beteiligt sind. Abschließend wurde die Funktion der Appr-1"-pase-Aktivität mit Hilfe einer HCoV-229E-Mutante, in der die Appr-1"-pase-Aktivität durch ortsspezifische Mutagenese ausgeschaltet wurde, in Zellkultur analysiert. Überraschenderweise hatte die Mutation keine nachweisbare Auswirkung auf die virale RNA-Synthese oder den Virustiter, und sie erwies sich auch nach sechs Passagen in Zellkultur als stabil. Die Tatsache, dass die Appr-1"-pase-Aktivität für die Replikation und Transkription von HCoV-229E entbehrlich ist, zeigt, dass Coronavirus-Replikasegene auch nichtessentielle Funktionen kodieren, die möglicherweise akzessorische und/oder regulatorische Funktionen besitzen und nur unter bestimmten Bedingungen (z.B. im infizierten Wirt) einen Selektionsvorteil bieten bzw. essentiell sind. Weitere Studien sind erforderlich, um die biologische Funktion der X-Domäne im Detail zu bestimmen.