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Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Tumor Nekrose Faktor-α (TNF- α) (TNF-α) in pathophysiologisch relevanten Konzentrationen neben seiner bekannten negativ inotropen Wirkung einen deutlichen Effekt auf die myokardiale Energetik im Myokard der Ratte besitzt. Dieser wurde anhand des Sauerstoffverbrauchs an rechtsventrikulären Muskelstreifenpräparaten quantifiziert. Der erhöhte Energieumsatz bei gleichzeitig reduzierter myokardialer Arbeit, d.h. der gesteigerte spezifische Sauerstoffverbrauch, basiert auf einer verschlechterten Ökonomie des Kontraktionsprozesses. Diese schnelle Wirkung auf die myokardiale Energetik ist durch einen Sphingolipid Signaltransduktionsweg vermittelt. Dagegen spielt wohl für den mechanischen Effekt von TNF-α sowohl NO, als auch Sphingosin eine Rolle.
Heutzutage existieren verschiedene immunsuppressive Protokolle, die bei Patienten nach Nierentransplantation mit dem Ziel der Unterdrückung der immunologischen Abstoßungs-reaktion eingesetzt werden. Welche von diesen Protokollen aber seine Aufgabe am besten verwirklicht, ist bis jetzt noch offen geblieben. Das relativ neue Präparat MMF findet zu-nehmend im klinischen Alltag im Rahmen dieser Therapie seine Verwendung. In dieser Arbeit wurden die Funktionen regulatorischer T-Zellen aus Patienten nach Nierentrans-plantationen unter MMF basierter Immunsuppression untersucht. Sie wurden mit Hilfe verschiedener Verfahren mit dem Ziel charakterisiert, die günstigste immunsuppressive Kombination zu finden und ihre Wirkungen auf zellulärer Ebene zu analysieren. Insgesamt wurde festgestellt, dass die T-Zelllinien aus Patienten mit chronischer Abstoßung vom Th1-Zytokin-Profil und die aus stabilen Patienten vom Th2-Muster geprägt waren. Dies verdeutlicht die Rolle der Th1-Zellen bei der Induktion und Aufrechterhaltung der chroni-schen Abstoßung und die immunregulatorischen Eigenschaften der Th2-Zellen. Alle T-Zelllinien wiesen Spender-Peptid spezifische und signifikante Proliferationsaktivität, wo-bei die Antwort bei den Zelllinien aus chronischen Patienten viel höher ausfiel. Diese Tat-sache weist auf die besondere immunologische Aktivität der Th1-Zellen. Unter den T-Zelllinien aus stabilen Patienten unter Tacrolimus, MMF und Prednisolon wurden viel mehr CD4+CD25+ Zellen mit regulatorischen Eigenschaften beobachtet als bei stabilen Patienten unter anderen therapeutischen Kombinationen, was darauf hinweist, dass dieses Regime insbesondere die regulatorischen T-Zellen fördert. Tatsächlich hat die statistische Analyse des längerfristigen Verlaufs der Transplantatsituation von den Patienten aus dieser Studie gezeigt, dass unter Tacrolimus, MMF und Prednisolon der geringste Anteil an chro-nischen Abstoßungsreaktionen vorkam. Diese Tatsache könnte enorme Bedeutung für die Klinik haben, denn unsere Arbeit beweist erstmals auf zellulärer Ebene, dass gerade diese immunsuppressive Kombination die Toleranzmechanismen am stärksten fördert und somit am besten zum langzeitigen Transplantatüberleben beiträgt, wodurch sie in näherer Zu-kunft das Therapieregime der Wahl werden kann.
Die Wundheilung im Kolon ist ein wichtiges Thema in der Medizin, da sich dieser Prozess durch die besonderen Ausgangsbedingungen, wie etwa hohe Bakterienlast, ein hoher intraluminaler Druck und niedrigere Sauerstoffspannung von der viel untersuchten kutanen Wundheilung unterscheidet. Auch sind die Folgen einer Dehiszenz im Anastomosenbereich ungleich gravierender, besteht doch das Risiko einer Peritonitis, die mit hoher Letalität verbunden ist. Ziel dieser Arbeit war es, die komplikationslose Wundheilung über einen langen Zeitraum zu beobachten. Anhand des Verlaufs einer Vielzahl von für die Wundheilung wesentlichen Zytokinen sollte die Wundheilung am Kolon möglichst ausführlich untersucht werden. Im Rahmen meiner Fragestellung wurden 100 männliche Wistarratten unter anderem mit einer Anastomose am Übergang von Kolon sigmoideum zum Rektum versehen. Die Tiere waren in verschiedene Gruppen aufgeteilt und wurden je nach Gruppe zu einem der sechs verschiedenen Zeitpunkte (0, 3, 7, 14, 30 und 90 Tage post Operationem) getötet und die Anastomose wurde entnommen. Das Anastomosengewebe wurde für immunhistologische und ELISA Untersuchungen verwendet. Durch den langen Untersuchungszeitraum konnten nicht nur die initialen Phasen der Wundheilung, sondern auch die Phase der Bindegewebsbildung erfasst werden. Es wurden immunhistochemische Färbungen und ELISA-Analysen von verschiedenen proinflammatorischen (TNF-alfa, IFN-gamma), chemotaktischen (RANTES, MIP-2, MCP-1), angiogenetischen (VEGF, PDGF-B, FGF-2) und antiinflammatorischen (IL-10, IL-13) Zytokinen und TGF-beta1 durchgeführt. Dabei wurde eine insgesamt verzögerte Wundheilung festgestellt. Es zeigte sich eine wesentlich verlängerte inflammatorische Phase sowie eine verlängerte proliferative Phase. Erst von Tag 30 bis 90 kehrten die meisten Parameter wieder auf ein mehr oder minder normales Niveau zurück. Erwartungsgemäß waren die meisten histologisch positiven Zellen in der Anastomose selbst zu finden. Die Zellzahlen der Zellmarker ließen sich gut mit den Zytokinen in Einklang bringen. Jedoch ließen sich Zellzahlen und Zytokinkonzentration meist nicht korrelieren. Es traten mit IFN-gamma und RANTES zwei Zytokine auf, die im kutanen Modell nicht beobachtet wurden. IFN-gamma hemmt die meisten Zellen, die im Rahmen der proliferativen Phase benötigt werden und könnte ein Grund für die verlängerte inflammatorische Phase sein. Aus diesen Untersuchungen lässt sich schließen, dass die komplikationslose kolonische Wundheilung grundsätzlich mit der kutanen vergleichbar ist. Die Ergebnisse und Erkenntnisse aus dieser Arbeit werden jetzt als Grundlage für ein Modell mit erhöhter Dehiszenzwahrscheinlichkeit verwendet. Damit soll ein besseres und systematisches Verständnis für die Pathogenese der Anastomoseninsuffizienz gewonnen werden. So wird es möglich, auf histologischer Ebene und auf Proteinebene die Unterschiede zwischen komplikationsloser und komplikationsbehafteter Anastomosenheilung zu beobachten, sind die klinischen Folgen bei einer Leckage doch in vielen Fällen verheerend. Zudem wird es dann möglich sein, systematischer zu ergründen, wie etwa intraoperativ eingebrachte Zytokine oder zytokingetränkte Fäden das Wundmilieu verändern und beeinflussen.
Visualization of type I immunity using bicistronic IFN-gamma reporter mice in vitro and in vivo
(2006)
IFN-γ is the signature cytokine of Th1 and CD8+ effector cells generated in type I immune responses against pathogens, such as Influenza virus, Sendai virus and the intracellular protozoan parasite Toxoplasma gondii. Understanding the regulation of IFN-γ is critical for the manipulation of immune responses, prevention of immunopathology and for vaccine design. In the present thesis, IFN-γ expression by CD4+ and CD8+ T cells was characterized in detail and the requirement of IFN-γ receptor mediated functions for IFN-γ expression was assessed. Bicistronic IFN-γ-eYFP reporter mice, which allow direct identification and isolation of live IFN-γ expressing cells, were used to visualize IFN-γ expression in vitro and in vivo after infection with the afore mentioned pathogens. Expression of the IFN-γ-eYFP reporter by CD4+ and CD8+ T cells was broadly heterogeneous in vitro and in vivo after infection. Increased expression of the reporter correlated positively with the abundance of IFN-γ transcripts and IFN-γ protein production upon stimulation. eYFP reporter brightness reflected the potential for IFN-γ production, but actual secretion was largely dependent on antigenic stimulation. Increased expression of the reporter also correlated with enhanced secretion of additional proinflammatory cytokines and chemokines and cell surface expression of markers that indicate recent activation. Highly eYFP fluorescent cells were generally more differentiated and their anatomical distribution was restricted to certain tissues. The anatomical restriction depended on the pathogen. IFN-γ expressing CD4+ and CD8+ T cells were generated in IFN-γ receptor deficient reporter mice after infection with Sendai virus or Toxoplasma gondii. However, in the absence of IFN-γ receptor mediated functions, the frequency and brightness of the eYFP reporter expression was altered. Dual BM chimeric mice, reconstituted with wild-type and IFN-γ receptor deficient reporter BM, revealed a T cell-intrinsic requirement for the IFN-γ receptor for optimal IFN-γ expression. Reporter fluorescence intensities were regulated independently of IFN-γ receptor mediated functions. Finally, we propose a model for IFN-γ expression by CD4+ and CD8+ T cells. 2. SUMMARY 10 In summary, the expression of IFN-γ is differentially regulated in CD4+ and CD8+ T cells and after viral or protozoan infections. Additionally, the role of IFN-γ receptor mediated functions for the expression of IFN-γ was determined.
Die Leber verfügt über einzigartige immunologische Eigenschaften, wobei die Lebertransplantat-Spontantoleranz eine der beeindruckensten ist. Dies steht im Gegensatz zum zentralen Dogma der Transplantationsimmunologie, wonach MHC-differente Transplantate ohne Immunsuppression abgestoßen werden. Die Spontantoleranz entwickelt sich aus der vom Lebertransplantat ausgelösten Immunantwort, während andere MHC-differente Organ-transplantate im Rahmen einer solchen Immunantwort irreversibel zerstört werden. Zielsetzung dieser Arbeit war, die immunologischen Vorgänge im Lebertransplantat bei Abstoßung und Spontantoleranz näher zu untersuchen. Deshalb wurden die intrahepatischen T-Lymphozyten auf ihr Zytokinprofil (Th1/Th2 Zytokine) und ihre CD45RC Expression hin untersucht. Dies geschah in der Frühphase bis Tag 7 und in der Spätphase bis Tag 100 nach Lebertransplantation. Mit diesem experimentellen Design wurde überprüft, ob aus der frühen Aktivierung nach Lebertransplantation je nach Präsenz von Th1- oder Th2-Zytokinen entweder Abstoßung oder Spontantoleranz entsteht. Das Phänomen der Lebertransplantat-Spontantoleranz wurde in der Ratte mit der Zuchtlinie Dark Agouti (DA) nach Übertragung von Lebertransplantaten aus Lewis-Spendertieren (LEW) untersucht. Andere vaskularisierte Organe aus LEW Spendertieren wurden dagegen von ihren DA-Empfängern abgestoßen. Dienten DA-Tiere als Leberspender und LEW-Tiere als Empfänger, so war ebenso eine akute Transplantatabstoßung zu beobachten. Die Quantifizierung und Phänotypisierung der Leukozyten aus den Lebertransplantaten der Spontantoleranzgruppe und der Abstoßungsgruppe zeigten, dass es bereits in der Frühphase nach Transplantation zu einer starken Infiltration mit Leukozyten des Empfängers kam. Bereits am Tag 3 p.op. waren in diesen Lebertransplantaten nahezu nur noch Leukozyten der Empfänger nachzuweisen. Auch in spontantolerierten LEW Lebertransplantaten wurde dies beobachtet. Weiter wurde die Expression des Oberflächenmoleküls CD45RC auf den CD4+ T-Lymphozyten untersucht, da sich hierdurch naive von aktivierten Zellen unterscheiden lassen. Während der Frühphase zeigte sich ein dynamisches Verhältnis von CD45RCpos (naive T-Lymphozyten) und CD45RCneg (aktivierte T-Lymphozyten). In beiden allogenen Gruppen stieg dieses Verhältnis innerhalb von 3 Tagen nach Transplantation von 0,5 auf über 3 an. Bereits zwischen Tag 5 und 7 p.op. verringert sich dieses Verhältnis wieder in beiden Gruppen. In der Spätphase um den Tag 30 nach Lebertransplantation erhöhte sich in der Spontantoleranzgruppe das Verhältnis von aktivierten zu naiven T-Lymphozyten noch einmal, bevor es sich schließlich dem Niveau der Syngenen Kontrollgruppe annäherte. Für die intrahepatischen CD4+ T-Lymphozyten beider allogener Gruppen wurde in der Frühphase nach Transplantation eine deutliche Anwesenheit von IL-2 und IL-2 mRNA nachgewiesen. In dieser Phase sezernierten sie auch die Th2- Zytokine IL-4 und IL-10. Dies war unabhängig davon, ob die T-Lymphozyten aus Lebertransplantaten der Abstoßungs- oder Spontantoleranzgruppe stammten. Somit konnte nicht eindeutig gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Th2-Zytokinen für die Induktion von Spontantoleranz notwendig ist bzw. ihre Abwesenheit zur Transplantatabstoßung führt. In der Spätphase nach Transplantation wurden aus den spontantoleranten Lebertransplantaten CD4+ T-Lymphozyten isoliert, für die nach einer in vitro- Stimulierung IL-13 mRNA nachzuweisen war. Diese Fähigkeit ließ sich bis zum Versuchsende am Tag 100 verfolgen. Hingegen brachten Analysen von CD4+ TLymphozyten, die zum gleichen Zeitpunkt aus den Milzen dieser Tiere isoliert wurden, für dieses Zytokin kein Ergebnis. Auch in der Syngenen Kontrollgruppe waren die CD4+ T-Lymphozyten, die aus den Lebertransplantaten und Milzen isoliert wurden, nicht in der Lage, dieses Zytokin zu produzieren. IL-13 zählt zu den Th2-Zytokinen, das regulierend auf immunkompetente Zellen wirkt und die Produktion verschiedener inflammatorischer Zytokine hemmt. Diese IL-13-positiven CD4+ T-Lymphozyten stellen somit attraktive Kandidaten für Zellen mit einem regulatorischen Potential dar, die zur Erhaltung der Langzeitfunktion von Lebertransplantaten entscheidend sein könnten. Die Leber mit ihren einzigartigen immunologischen Fähigkeiten verbirgt noch zahlreiche Geheimnisse. Unstrittig ist, dass weiterführende Untersuchungen zu neuen Erkenntnissen über die Immunbiologie IL-13-positiver T-Lymphozyten im Besonderen und zur Leberimmunologie im Allgemeinen führen werden.