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- Research Center for Infectious Diseases, University of Wuerzburg, Wuerzburg 97080, Germany (1)
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Um der ungehinderten Vermehrung maligne entarteter Zellen vorzubeugen, besitzt der Organismus Tumorsuppressorgene. Die Blockade von tumorsuppressiven Signalwegen ist Voraussetzung für die neoplastische Transformation von Zellen. Während die tumorsuppressive Funktion von p53 bestens untersucht ist, war die Bedeutung des p53-Familienmitglieds p73 als Tumorsuppressor umstritten. Komplizierend war hierbei, dass das p73-Gen sowohl ein p53-ähnliches, putativ tumorsuppressives Protein (TAp73) als auch ein funktionell antagonistisches, potentiell onkogenes Protein (ΔNp73) exprimiert. Die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen zeigen, dass TAp73 tatsächlich tumorsuppressiv agiert: zum einen verhindert es zusammen mit p53 und TAp63 durch Induktion von myogener Differenzierung die Entstehung von Rhabdomyosarkomen - zum anderen unterdrückt es substratunabhängiges Wachstum als Charakteristikum von Tumorzellen und bildet so eine Barriere auf dem Weg der malignen Transformation. Eine Inaktivierung der tumorsuppressiven Aktivitäten von TAp73 erfolgt bei Tumorpatienten – anders als bei p53 – entweder durch eine Reduktion der p73-Expression aufgrund von Gendeletion bzw. Promotormethylierung oder durch eine verstärkte Expression von Inhibitoren wie ΔNp73. Eine reduzierte p73-Expression wird z.B. bei einigen hämatologischen Neoplasien beobachet. Entsprechend beobachteten wir in einem Myc-induzierten Lymphommodell der Maus eine geringfügig aber signifikant beschleunigte Lymphomentstehung nach Deletion eines p73-Allels. Eine verstärkte Expression von ΔNp73 ist dagegen die charakteristische Expressionsveränderung von p73 in soliden Tumoren. Entsprechend beobachteten wir in >85% aller Rhabdomyosarkome stark erhöhte ΔNp73-Spiegel, die sich als essentiell für Tumorentstehung und Tumorprogression erwiesen. Diese Ergebnisse in unterschiedlichen in vitro und in vivo Modellen belegen mechanistisch, dass TAp73 als Tumorsuppressor wirkt, dessen Funktion in Tumoren häufig inaktiviert ist. Proof-of-principle Experimente in dieser Arbeit unterstreichen ferner, dass eine Reaktivierung der Tumorsuppressorfunktion von TAp73, z.B. durch Blockade von ΔNp73, eine Möglichkeit darstellt, um Tumore auf molekularer Ebene zu therapieren.
The prototyical tumor suppressor p53 is able to arrest cells after DNA damage or as a response to oncogene expression. The transactivation-competent (TA) isoforms of the more recently discovered p53 family member p73 also prevent tumors, but the underlying mechanisms are less well understood. The work presented here addressed this issue by using a cell culture model of tumorigenesis in which normal human diploid fibroblasts are stepwise transduced with oncogenes. Cells in pretransformed stages were shown to harbour high levels of TAp73 mRNA and protein. This positive regulation was probably a result of pRB inactivation and derepression of E2F1, a key activator of TAp73. Consequences for such cells included an increased sensitivity to the cytostatic drug adriamycin, slower proliferation and reduced survival at high cell density, as demonstrated by rescue experiments using siRNA-mediated knockdown of TAp73. In order to identify potential effector pathways, the gene expression profile of siRNA treated, matched fibroblast cell lines with high and low TAp73 levels were compared in DNA microarrays. These findings support the notion of TAp73 up-regulation as an anti-proliferative defense mechanism, blocking the progress towards full transformation. This barrier could be overcome by the introduction of a constitutively active form of Ras which caused a switch from TAp73 to oncogenic DeltaNp73 expression, presumably through the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway. In summary, the results presented emphasize the tumor-suppressive function of TAp73 and indicate that its downregulation is a decisive event during the transformation of human cells by oncogenic Ras mutants.
The Transforming Growth Factor (TGF) superfamily of cytokines and their serine/threonine kinase receptors play an important role in the regulation of cell division, differentiation, adhesion, migration, organization, and death. Smad proteins are the major intracellular signal transducers for the TGF receptor superfamily that mediate the signal from the membrane into the nucleus. Bone Morphogenetic Protein-4 (BMP-4) is a representative of the TGF superfamily, which regulates the formation of teeth, limbs and bone, and also plays a role in fracture repair. Binding of BMP-4 to its receptor stimulates phosphorylation of Smad1, which subsequently recruits Smad4. A hetero-oligomeric complex consisting of Smad1 and Smad4 then translocates into the nucleus and regulates transcription of target genes by interacting with transcription factors. Although the individual steps of the signaling cascade from the receptor to the nucleus have been identified, the exact kinetics and the rate limiting step(s) have remained elusive. Standard biochemical techniques are not suitable for resolving these issues, as they do not offer sufficiently high sensitivity and temporal resolution. In this study, advanced optical techniques were used for direct visualization of Smad signaling in live mammalian cells. Novel fluorescent biosensors were developed by fusing cyan and yellow fluorescent proteins to the signaling molecules Smad1 and Smad4. By measuring Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) between the two fluorescent proteins, the kinetics of BMP/Smad signaling was unraveled. A rate-limiting delay of 2 - 5 minutes occurred between BMP receptor stimulation and Smad1 activation. A similar delay was observed in the complex formation between Smad1 and Smad4. Further experimentation indicated that the delay is dependent on the Mad homology 1 (MH1) domain of Smad1. These results give new insights into the dynamics of the BMP receptor – Smad1/4 signaling process and provide a new tool for studying Smads and for testing inhibitory drugs.
Platelets are crucial to inhibit extensive blood loss at sites of vascular injury. However, under pathological conditions such as rupture of an atherosclerotic plaque, activated platelets form aggregates that may occlude the vessel. This can lead to heart attack and stroke. Various and complex signaling pathways in the cell are involved in the steps of platelet adhesion, activation and aggregation. Single aspects of these processes were studied in three different subprojects in this work. The Glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex is responsible for the first contact of platelets with the vessel wall. Subsequently, GPVI can bind to collagen of the subendothelium, which initiates a signaling cascade leading to platelet activation, aggregation, characterized by integrin activation and granule secretion and platelet procoagulant activity. The latter is characterized by exposed phosphatidylserine (PS) on the platelet surface, which enhances thrombin generation and thereby the coagulation cascade. A controlled regulation of GP receptors on the platelet surface is vital for an intact response of the cell to platelet agonists. In the first subproject described here the regulation of GPV and GPVI on mouse platelets was investigated and it was found that both receptors are shed from the platelet surface in a metalloproteinase dependent manner. However, GPVI is shed upon mitochondrial injury, while GPV cleavage could be observed upon platelet stimulation. The metalloproteinase responsible for GPVI shedding remains unknown whereas the metallproteinase that sheds GPV was identified in this work as being ADAM17. This shows that the expression of both receptors underlies a controlled mechanism regulated through distinct metalloproteinases. In the second subproject the role of protein kinase C (PKC) in platelet activation and procoagulant response was investigated using PKC specific inhibitors. It was found that PKC blockage reduced platelet activation but enhanced platelet procoagulant activity. This is the first time that a dual role in platelet activation and procoagulant activity is defined for PKC. In the third project the role of the small GTPase Rac1 in platelet signaling was studied using conditional Rac1 knock out mice. It is reported here that Rac1 lies downstream of GPVI and is involved in integrin activation and cytsolic Ca2+ changes in vitro and platelet adhesion and thrombus formation in vivo. This is the first time that Rac1 is demonstrated to have a pivotal role in GPVI signaling and furthermore points to a novel, unknown pathway downstream of GPVI.
Krebserkrankungen zeichnen sich häufig durch Störungen zellulärer Differenzierungsprozesse aus. So weisen Rhabdomyosarkome, die aus Muskelvorläuferzellen hervorgehen, Differenzierungsdefekte auf, die zur unkontrollierten Proliferation der Tumorzellen führen. Bislang ist ungeklärt, ob die Differenzierungsdefekte auf der verstärkten Expression von Inhibitoren, der defekten Funktion von Aktivatoren oder einer Kombination von beidem beruht. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass im Unterschied zu normalen Muskelzellen RMS-Zellen verstärkt DeltaNp73, einen Pan-Inhibitor der p53-Tumorsuppressorfamilie, exprimieren. Die experimentelle Überexpression von DeltaNp73 in normalen Myoblasten blockierte die Muskeldifferenzierung und förderte in Kombination mit klassischen RMS-Onkogenen wie IGF2 oder PAX3/FKHR die maligne Transformation. Umgekehrt führte die Hemmung von DeltaNp73 durch RNAi zur Reduktion der Tumorigenität von RMS-Tumorzellen. Da DeltaNp73 als dominant-negativer Inhibitor der p53-Familie wirkt, lies die Hemmung von Differenzierungsprozessen durch DeltaNp73 vermuten, dass die p53-Familienmitglieder (p53, p63, und p73) an der Regulation der Muskeldifferenzierung beteiligt sind. Tatsächlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die drei p53-Familienmitglieder bei der Induktion später Differenzierungsstadien kooperieren, indem sie die Aktivität des Retinoblastoma-Proteins RB regulieren. Die Funktion von RB ist bekanntermassen sowohl für den permanenten Zellzyklusarrest als auch für die Aktivierung Muskel-spezifischer Gene notwendig. Während p53 die Proteinspiegel von RB reguliert, kontrollieren p63 und p73 den Aktivierungsgrad von RB, indem sie dessen Phoshphorylierungszustand über den Zyklin-abhängigen Kinaseinhibitor p57KIP2 modifizieren. Eine Hemmung dieser Funktionen blockiert das Differenzierungsprogramm und fördert die Tumorentstehung. Die Aktivierung zellulärer Differenzierungsprozesse stellt somit einen entscheidenden Bestandteil der Tumorsuppressoraktivität der p53-Familie dar und liefert eine Erklärung für die Häufigkeit von Mutationen im p53-Signalweg bei Rhabdomyosarkom-Patienten.
Human cytomegalovirus (HCMV) infection causes clinical symptoms in immunocompromised individuals such as transplantant recipients and AIDS patients. The virus is also responsible for severe complications in unborn children and young infants. The species specificity of HCMV prevents the direct study of mechanisms controlling the infection in animal models. Instead, the murine cytomegalovirus (MCMV) is used as a model system. Human and murine CMVs have large double-stranded DNA genomes, encoding nearly 170 genes. About 30% of the genes are committed to essential tasks of the virus. The remaining genes are involved in virus pathogenesis or host interaction and are dispensable for virus replication. The CMV genes are classified in gene families, based on sequence homology. In the present work, the function of two genes of the US22 gene family was analyzed. The MCMV genes m142 and m143 are the only members of this family that are essential for virus replication. These genes also differ from the remaining ten US22 gene family members in that they lack 1 of 4 conserved sequence motifs that are characteristic of this family. The same conserved motif is missing in the HCMV US22 family members TRS1 and IRS1, suggesting a possible functional homology. To demonstrate an essential role of m142 and m143, the genes were deleted from the MCMV genome, and the mutants were reconstituted on complementing cells. Infection of non-complementing cells with the deletion mutants did not result in virus replication. Virus growth was rescued by reinsertion of the corresponding genes. Cells infected with the viral deletion mutants synthesized reduced amounts of viral DNA, and viral late genes were not expressed. However, RNA analyses showed that late transcripts were present, excluding a role of m142 and m143 in regulation of gene transcription. Metabolic labelling experiments showed that total protein synthesis at late times postinfection was impaired in cells infected with deletion mutants. Moreover, the dsRNA-dependent protein kinase R (PKR) and its target protein, the translation initiation factor 2α (eIF2α) were phosphorylated in these cells. This suggested that the m142 and m143 are required for blocking the PKR-mediated shut-down of protein synthesis. Expression of the HCMV gene TRS1, a known inhibitor of PKR activation, rescued the replication of the deletion mutants, supporting the observation that m142 and m143 are required to inhibit this innate immune response of the host cell.
Viren durchliefen eine gemeinsame Evolution mit ihren Wirtsorganismen, die zu einer spezifischen Anpassung der Viren an ihren jeweiligen Wirt führte. Als Folge dessen verfügen viele Viren über ein eng begrenztes Wirtsspektrum. Gelegentlich machen Viren Veränderungen durch, die es ihnen erlauben, einen neuen Wirt zu infizieren und in ihm zu replizieren, wie dies in jüngster Vergangenheit beim humanen Immundefizienz-Virus oder beim Grippevirus geschehen ist. Spezies-übergreifende Infektionen sind für die meisten neuen und wiederauftauchenden Viruserkrankungen verantwortlich. Allerdings ist bisher wenig über die Mechanismen bekannt, die Viren auf einen bestimmten Wirt beschränken, und welche Faktoren Viren zur Überwindung der Spezies-Barriere und zur Vermehrung in einer neuen Wirtsspezies benötigen. Cytomegaloviren sind Prototypen der beta-Herpesvirus Unterfamilie und verfügen über eine ausgeprägte Spezies-Spezifität. Sie vermehren sich nur in Zellen der eigenen oder einer eng verwandten Wirtsspezies. Der molekulare Mechanismus, der dieser Spezies-Spezifität zugrunde liegt, ist noch weitgehend unbekannt und stellt deshalb das Thema dieser Arbeit dar. Initiale Beobachtungen zeigten, dass sich das Maus-Cytomegalovirus (MCMV) ausschließlich in menschlichen 293 und 911 Zellen, aber keiner anderen getesteten menschlichen Zelle vermehren ließ. Diese beiden Zelllinien sind mit Adenovirus E1-Genen transformiert, die den Transkriptions-Transaktivator E1A sowie zwei Apoptose-Inhibitoren (E1B-55k und E1B-19k) kodieren. Daher lag die Hypothese nahe, dass diese Funktionen benötigt werden, um eine MCMV-Replikation in menschlichen Zellen zu ermöglichen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass normale menschliche Zellen nach Infektion rapide absterben, und zwar durch eine Caspase-9-vermittelte Apoptose. Die Induktion der Apoptose durch MCMV lässt sich durch Caspase-Inhibitoren unterdrücken, wodurch die virale Replikation wiederhergestellt wird. Dies deutet auf eine Schlüsselfunktion der Caspasen für diesen Prozess hin. Durch Überexpression eines mitochondrialen Apoptose-Inhibitors, d.h. eines Bcl-2-ähnlichen Proteins, in menschlichen Zellen ließ sich die Virus-induzierte Apoptose verhindern. Diese Zellen erlaubten ebenfalls eine effiziente MCMV-Replikation. Die Bedeutung Bcl-2-ähnlicher Proteine für die Spezies-übergreifende Cytomegalovirus-Infektion wurde sowohl durch die Integration korrespondierender Gene, alsauch durch die Integration anderer Inhibitioren der Apoptose oder von Kontroll-Genen in das MCMV Genom bestätigt. Nur rekombinante Viren, die ein Bcl-2-ähnliches Protein kodieren, konnten in menschlichen Zellen vermehrt werden. Ein einziges Gen des humanen Cytomegalovirus, das einen mitochondrialen Apoptose-Inhibitor kodiert, reichte aus, um eine MCMV-Replikation in menschlichen Zellen zu ermöglichen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass dieselben Prinzipien für eine Replikation des Ratten-Cytomegalovirus in menschlichen Zellen gelten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Induktion der Apoptose eine Spezies-übergreifende Infektion bei den Nagetier-Cytomegaloviren einschränkt.
Das Ribonukleoprotein, Telomerase wird vor allem für die Aufrechterhaltung der Telomerlänge benötigt und ist normalerweise nur in Keimbahnzellen, Stammzellen und anderen Zellen mit erhöhter Regenerationsfähigkeit aktiv. Die Aktivierung der Telomerase ist darüber hinaus ein wichtiger Faktor während der Krebsentstehung. Fast das komplette Spektrum humaner Tumore zeichnet sich durch hohe Telomerase-Aktivität aus. Vor allem maligne Tumore besitzen eine sehr aktive Telomerase, unlimitiertes Wachstum und Immortalität ermöglicht. Die Aktivität der Telomerase wird vor allem über die Expression der katalytischen Untereinheit hTERT reguliert, die unter der strikten Kontrolle verschiedener Tumorsuppressorgene liegt. Zu den wichtigsten Regulatoren der hTERT-Expression gehört auch der bekannte Tumorsuppressor p53. Über die Rolle des p53-Familienmitglieds p73 in der Regulation der Telomerase-Aktivität war bisher nur wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein regulatorischer Einfluss von p73 nachgewiesen werden. Dabei wurden deutliche Unterschiede in der Funktion der N-terminalen Isoformen TAp73 und DeltaNp73 beobachtet. TAp73 erwies sich sowohl nach Überexpression als auch nach Induktion des endogenen TAp73 als ein effizienter Repressor der hTERT-Expression. Im Gegensatz dazu konnte durch die Hemmung des endogenen TAp73 mittels RNAi die Expression von hTERT in verschiedenen Zelllinen induziert werden. Zusätzlich zu der Funktion als Tumorsuppressor scheint p73 auch in verschiedene Differenzierungsprozesse involviert zu sein. Die Expression von p73 korreliert zwar mit der Hemmung der Telomerase-Aktivität während der myeloischen Differenzierung von HL60-Zellen, hat hier aber keine Bedeutung für die Repression von hTERT. Die N-terminal verkürzte Isoform DeltaNp73 wirkt im Gegensatz zu TAp73 als effizienter Aktivator der hTERT-Expression. DeltaNp73 induziert die hTERT-Expression einerseits über seine dominant-negative Funktion auf die pro-apoptotischen p53-Familienmitglieder und andererseits über die Hemmung repressiver RB-E2F-Komplexe. Im Rahmen dieser Studie erwies sich p73 somit als ein wichtiger Regulator der Telomerase Aktivität, wobei sich eine duale Rolle als negativer (TAp73) und auch als positiver (DeltaNp73) Regulator der Telomerase Aktivität herausstellte.
Platelet activation and adhesion resulting in thrombus growth is essential for normal hemostasis, but can lead to irreversible, life-threatening vessel occlusion. In the current study, the contribution of platelet integrins, activation receptors and the contact system of blood coagulation in such pathological conditions was investigated in mice.