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Das zeitgleiche Auftreten eines ischämischen Schlaganfalls sowie eines Takotsubo-Syndroms (TTS) scheint eine relevante, bisher nicht ausreichend verstandene klinische Konstellation zu sein. Die Pathologien können als über die Hirn-Herz-Achse gekoppelt verstanden werden, in die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) als funktionale Komponente integriert ist. Das klinisch-neurologische Outcome dieses Patient:innen-Kollektivs scheint signifikant schlechter zu sein als nach solitärem ischämischen Insult. Es wurde hypothetisiert, dass die BHS in besonderem Maße kompromittiert sein könnte. Das vorwiegend weibliche, postmenopausale Patient:innenkollektiv präsentierte laborchemisch elevierte Katecholaminspiegel sowie Entzündungsparameter. Diese Konditionen wurden unter Sauerstoff-Glucose-Entzug (OGD) in vitro simuliert und resultierende Alterationen eines etablierten BHS-Modells aus murinen cEND-Zellen der cerebralen Mikrozirkulation untersucht. Die Evaluation der BHS-Integrität erfolgte anhand von spezifischen Junktionsproteinen sowie Integrinuntereinheiten. Alle Versuche wurden parallel unter Östrogen-Applikation (E2) durchgeführt, um die mögliche BHS-Protektion durch das weibliche Sexualhormon zu untersuchen. Die getrennte Applikation von Katecholaminen (KAT) sowie Entzündungsmediatoren (INF) führte gegenüber der simultanen Applikation zu einem geringeren BHS-Schaden. Dieser erschien zeitgebunden, wobei sich das Ausmaß gewissermaßen proportional zur Einwirkdauer verhielt. Auswirkungen von OGD sowie einer Reoxygenierung, im Sinne einer simulierten Reperfusion, potenzierten sich mit den Effekten von KAT/INF. Überwiegend kompromittierten OGD und KAT/INF die BHS-Integrität, wobei nach Reoxygenierung eine „Erholung“ oder ein „Reperfusionsschaden“ vorlag. Eine Protektion durch E2 war morphologisch nachweisbar, speziell gegenüber OGD, KAT/INF sowie einem „Reperfusionsschaden“. Auf Ebene der Gen- sowie Proteinexpression konnte dies nicht gezeigt werden. Die Homöostase des ZNS würde in vivo beeinträchtigt, Katecholamine sowie Entzündungsmediatoren könnten ungehindert das bereits durch die Ischämie geschädigte neuronale Gewebe erreichen. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem Verständnis der molekularen BHS-Veränderungen im Kontext des zeitgleichen Auftretens von TTS und einem ischämischem Insult bei. Es wurde eine experimentelle Grundlage geschaffen, um zukünftig pathogenetische Hintergründe weiter erforschen zu können. Darauf aufbauend könnten, nach weiterer in vitro- sowie in vivo-Forschung, klinische Therapiekonzepte optimiert werden.
Mit fortschreitender chronischer Niereninsuffizienz kommt es zur Akkumulation von Urämietoxinen und im Endstadium unbehandelt zum Tod im sogenannten Urämischen Syndrom. Die Blutreinigung erfolgt bei der am häufigsten verwendeten Form der Nierenersatztherapie, der Hämodialyse, nur unzureichend. Die Folge ist eine erhöhte Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten. Bei der Hämodialyse werden nur Urämietoxine bis zu einer Größe von 20 kDa über die im Dialysator eingesetzten Hohlfaserdialysemembranen diffusiv und konvektiv semiselektiv nach Größenausschluss entfernt. Proteingebundene Urämietoxine, deren effektive Größe durch die Bindung an Transportproteine wie beispielsweise Albumin die Trennschärfe der Dialysemembranen übersteigt, werden retiniert. In-vivo werden proteingebundene Urämietoxine im proximalen Tubulus, einem Teil des tubulären Systems des Nephrons, sekretorisch eliminiert.
Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden die ersten Entwicklungsschritte auf dem Weg zu einem sogenannten bio-artifiziellen Tubulus evaluiert. Der angedachte biohybride Filter sollte aus einer Ko-Kultur funktionaler humaner proximaler Tubuluszellen und humaner Endothelzellen (HUVEC) auf synthetischen Hohlfasermembranen bestehen und könnte während der Hämodialyse als zusätzlicher Reinigungsschritt angewendet werden, um unter anderem proteingebundene Urämietoxine effektiv durch aktiven Transport aus dem Blut der Patienten zu entfernen. Die Differenzierung der proximalen Tubuluszellen erfolgte dabei aus adulten adipozytären mesenchymalen Stammzellen (ASC), deren Herkunft eine spätere autologe Behandlung ermöglicht. Die Ko-Kultur mit Endothelzellen wurde zur potentiellen Steigerung der Sekretion proteingebundener Urämietoxine verwendet.
In der vorliegenden Arbeit konnten ASCs durch eine Kombination der löslichen Differenzierungsfaktoren All-Trans-Retinoinsäure (ATRA), Aktivin A und BMP-7 erfolgreich in Zytokeratin 18-exprimierende Zellen differenziert werden, wodurch die erwünschte epitheliale Differenzierung bestätigt wurde. Die Expression funktionaler Proteine, wie das für den Wassertransport relevante Aquaporin 1 oder auch der Na+-/K+-ATPase, konnte in dieser Arbeit bereits vor der Differenzierung nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurde erfolgreich gezeigt, dass eine simultane, qualitativ hochwertige Ko-Kultur von ASCs und HUVECs auf der mit dem extrazellulären Matrixprotein Fibronektin modifizierten Innen- bzw. Außenseite von synthetischen Hohlfasermembranen aus Polypropylen bzw. Polyethersulfon möglich ist. Die Viabilität beider Zelltypen wurde dabei durch die Verwendung eines für die Ko-Kultur entwickelten Nährmediums erreicht, in welchem die Proliferation von ASCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Stammzelleigenschaften deutlich erhöht war.
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stellen eine aussichtsreiche Basis für einen bio-artifiziellen renalen Tubulus dar. Weitere Entwicklungsschritte, wie die Differenzierung der ASCs zu proximalen Tubuluszellen im 3D-Bioreaktor einschließlich ihrer funktionalen Charakterisierung anhand Tubulusepithel-spezifischer Transporter, sind erforderlich, be-vor erste funktionale Experimente vor dem „Upscaling“ auf klinisch verwendbare Module möglich sind.
Auswirkungen physiologischer Konzentrationen von Beta-Hydroxybutyrat auf vaskuläre Endothelzellen
(2018)
Die endotheliale Dysfunktion beatmeter Intensivpatienten stellt ein signifikantes klinisches Problem dar. Flüssigkeitsaustritte durch die Gefäßwand können zur Bildung von lebensbedrohlichen Ödemen führen. Forschungsergebnisse zeigen einen Einfluss der lokalen Sauerstoffkonzentration sowie der Stoffwechsellage auf die endotheliale Zellhomöostase sowie die Angiogenesekapazität.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen sowie der Exposition gegenüber Ketonkörpern auf die Expression zentraler Stoffwechselenzyme, die Freisetzung von Zytokinen, die endotheliale Migrations- und Angiogenesekapazität sowie die Freisetzung von Angiogenesefaktoren an kultivierten humanen Nabelschnurendothelien (HUVEC) untersucht.
Unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen führten zu keiner wesentlichen Änderung der mRNA- oder Proteinexpression von Stoffwechselenzymen. Im Hinblick auf die Zytokinfreisetzung zeigten sich hingegen deutliche Expressionsänderungen unter Hypoxie bzw. Hyperoxie, welche jedoch in der Zusammenschau kein eindeutig proangiogenetisches Profil zeigten. Hypoxie und Hyperoxie sowie die Exposition gegenüber Ketonkörpern (β-Hydroxybutyrat) verlangsamten die endotheliale Zellmigration; im Gegensatz hierzu führte die Ketose im Angiogeneseassay zu einer signifikant erhöhten Gefäßdichte und Anzahl an Verzweigungspunkten, einhergehend mit erhöhter Freisetzung des potenten Angiogenesefaktors Angiopoietin-1.
Somit zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass eine ketogene Stoffwechsellage – mutmaßlich über eine gesteigerte endotheliale Zellproliferation – zu einer gesteigerten Angiogenese führt, wogegen eine Änderung der Sauerstoffkonzentration im Modell keine eindeutig positiven Effekte zeigte. Eine physiologische Ketose könnte somit bei Intensivpatienten der Entstehung einer endothelialen Dysfunktion mit Entwicklung eines Capillary-leak-Syndroms entgegenwirken.
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005).
Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen.
Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter
Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist
über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER)
unter 150
· cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte
von mehr als 1500
· cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die
Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick
auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial
von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier
das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der
BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann.
Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten
Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren
Bedingungen bereitzustellen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden
in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A)
zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit
Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen
TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die
Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt
wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten
Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente
NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs
für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt.
Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren,
wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs
und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen.
Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der
neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten
die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten
Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte
von bis zu 2500
· cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter
Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für
weiterführende Studien ausgewählt.
Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin,
Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller
Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden.
Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von
FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die
BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung
der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit
Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt.
Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten:
Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac
werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie
Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen
wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer
Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt.
Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen
an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen.
Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke
konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen
ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening
von Medikamenten denkbar.
Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro-
Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die
Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse,
eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen
einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt.
Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten
eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung
genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen
und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen
zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden.
Natalizumab ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper gegen das Oberflächenadhäsionsmolekül Integrin α-4, der zur Therapie von schweren Verlaufsformen der Multiplen Sklerose (MS) zugelassen ist. Integrin α-4/β-1 wird durch Leukozyten exprimiert und steuert deren Extravasation über die Bindung an VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) auf Endothelzellen. Natalizumab wirkt über eine Blockade der Leukozytenadhäsion. In einigen Publikationen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass Integrin α-4 auch auf zerebralen Endothelzellen von Mäusen und Ratten exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression und Funktion von Integrin α-4 in kultivierten primären humanen zerebralen Endothelzellen untersucht.
Die im Rahmen dieser Arbeit an verschiedenen Einzelspenderpräparationen durchgeführten FACS-Analysen zeigten, dass Integrin α-4 in unterschiedlicher Ausprägung auf primären zerebralen Endothelzellisolationen nachzuweisen war. Mit Hilfe immunzytochemischer Färbungen konnte ein spezifisches Verteilungsmuster des Integrin α-4 in Form eines feinen, granulären Musters im Bereich des Zellleibes dokumentiert werden.
In Adhäsionsversuchen zeigten Integrin α-4-exprimierende Endothelzellen nach Zugabe von Natalizumab in niedriger Konzentration eine verminderte Fähigkeit zur Haftung an Fibronectin, einem Bindungspartner in der extrazellulären Matrix. In hohen Konzentrationen dominierte im eingesetzten experimentellen System ein unspezifischer Blockadeeffekt, der auch mit Kontrollantikörpern zu beobachten war.
In MS-Läsionen findet sich auch die lösliche Form des VCAM-1 (sVCAM-1), die möglicherweise mit endothelialem Integrin α-4 interagiert. Daher wurde mit Hilfe von Western-Blot-Untersuchungen die intrazelluläre Signaltransduktion unter Stimulation mit sVCAM-1 untersucht. Es zeigte sich wie in anderen Endothelarten vorbeschrieben eine Aktivierung des p38-MAP-Kinase-Signalweges.
Zusammenfassend wurde demonstriert, dass primäre humane zerebrale Endothelzellen Integrin α-4 exprimieren und dass dieses wahrscheinlich nicht nur für die mechanische Verankerung in der Extrazellulärmatrix eine Bedeutung besitzt, sondern auch als Induktor intrazellulärer Signaltransduktion fungiert, welche die Schrankeneigenschaften zerebraler Endothelzellen beeinflussen könnte.
Cystein rich protein 61 (CYR61/CCN1) und Connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) stellen aufgrund ihrer Multifunktionalität zwei sehr interessante Vertreter aus der derzeit sechs Mitglieder umfassenden Familie der CCN-Proteine (CCN- CYR61/CCN1, CTGF/CCN2, NOV/CCN3, WISP1-3/CCN4-6) dar. Seit der Entdeckung von CYR61 und CTGF konnten die überlappenden, aber meist nicht redundanten zellspezifischen Effekte in verschiedenen Zellsystemen nachgewiesen werden. Die Einflüsse auf zahlreiche Prozesse wie Proliferation und Migration, aber auch Angiogenese und das Überleben von Zellen lassen eine weitreichende Bedeutung im Zusammenhang mit vielen Entwicklungsprozessen vermuten, so auch der des muskuloskelettalen Systems und der Entwicklung der Lunge.
In der vorliegenden Arbeit wurden für die nähere Charakterisierung von CYR61 und CTGF humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) und die humane primäre Lungenendothelzelllinie HPMEC-ST1.6R (human pulmonary microvascular endothelial cells) gewählt. Beide Zellsysteme sind für die Untersuchung der Funktionsfähigkeit in den verschiedenen Kompartimenten bestens geeignet. So ist die Zelllinie HPMEC-ST1.6R den primären Endothelzellen, im Vergleich mit anderen in der Forschung eingesetzten Zelllinien, in Bezug auf spezifische Oberflächenmarker am nächsten. Mesenchymale Stammzellen bilden als multipotente Zellen das Rückrat des muskuloskelettalen Systems und sind an der Homöostase des menschlichen Stütz- und Bewegungsapparates maßgeblich beteiligt.
Um experimentell nutzbare Konzentrationen an rekombinanten Proteinen zu erhalten, wurde ein Baculovirus-Expressionsystems gewählt. Nach der erfolgreichen Klonierung der CTGF/Fc-Tag Sequenz in einen Expressionsvektor konnte dies auch durch Produktion in SF21-Insektenzellen erreicht und erstmalig rekombinantes CTGF/Fc von hoher Reinheit gewonnen werden. Allerdings konnte eine beständige Funktionsfähigkeit der aufgereinigten Proteine mittels eines Proliferationstestes nachfolgend nur bedingt bestätigt werden.
Für die weitere Versuchsplanung, einer Untersuchung der Auswirkung von rekombinantem CTGF (rCTGF) bzw. CYR61 (rCYR61) auf die Zielzellen, musste zunächst die zelleigene ctgf bzw. cyr61 Expression herunterreguliert werden, um einen endogenen Störeffekt auszuschließen. Durch den Einsatz spezifischer shRNAs konnte ctgf/CTGF sowohl in den hMSC-, wie auch den HPMEC-ST1.6R-Zielzellen deutlich herunterreguliert und nachfolgend eine markant reduzierte Proliferation beobachtet werden. Ein Effekt für die Regulation von cyr61 blieb aus.
In dieser Arbeit wurden anschließend erstmals mittels Microarray-Analysen Veränderungen im Genexpressionsmuster der ctgf herunterregulierten hMSC- bzw. Lungenendothelzellen gegenüber Kontrollzellen untersucht. Des Weiteren war die Auswirkung einer Behandlung von ctgf herunterregulierten Zielzellen mit rCTGF gegenüber unbehandelten Kontrollzellen von Interesse. Für beide Zellsysteme konnten signifikante Genregulationen nach der Behandlung mit CTGF spezifischen shRNAs gegenüber den Kontrollzellen detektiert werden, mit interessanten Genclustern im Bereich der TGF-beta (transforming growth factor ß) Signalgebung, sowie der fokalen Adhäsion (z.B. VEGF). Eine Behandlung mit rCTGF hingegen zeigte gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen in der Auswertung der Microarray-Analyse keine signifikante Veränderung im Genexpressionsmuster.
In dieser Arbeit wurden, neben einer effektiven Gewinnung von rekombinantem CTGF und der Herunterregulation der endogenen ctgf Expression, wichtige Erkenntnisse zur Biologie von CTGF (und CYR61) in mesenchymalen Stammzellen hMSC und der Lungenendothelzelllinie HPMEC-ST1.6R erlangt. Die erhaltenen Microarray-Daten bieten eine fundierte Grundlage für zahlreiche fortführende Untersuchungen.
Die endotheliale Dysfunktion stellt eine der Hauptursachen für die Entstehung von Atherosklerose an humanen Gefäßwänden dar und ist somit auch wesentlich an der Entstehung von kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt. Das proinflammatorische Zytokin Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) gilt als einer der Hauptinduktoren der endothelialen Dysfunktion. Da bei der Endothelzellapoptose unter TNF-α diverse rezeptorvermittelte oxidative Prozesse innerhalb der Zelle ablaufen, sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, inwiefern das Multidrug Resistance Associated Protein-1 (MRP-1) bei diesen oxidativen Prozessen und bei der Modulation der TNF-α-Signalkaskade involviert ist.
Zerebrovaskuläre kavernöse Malformationen (CCM) sind Blutgefäßfehlbildungen, welche hauptsächlich im Gehirn vorkommen. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte kapillarähnliche Gefäße mit niedriger Flussrate („slow-flow lesions“). Intervenierendes Gehirnparenchym fehlt ebenso wie Perizyten oder glatte Gefäßmuskelzellen. Die klinischen Symptome reichen von starken Kopfschmerzen über Epilepsie bis hin zum Schlaganfall. Dennoch bleiben viele Kavernomträger aufgrund unvollständiger Penetranz ihr Leben lang asymptomatisch. Die Prävalenz beträgt ca. 0,5% in der Gesamtbevölkerung. Es gibt sowohl sporadische als auch dominant vererbte Krankheitsformen. In den letzten Jahren konnten 3 Gene ursächlich mit der Krankheit in Verbindung gebracht werden. Mutationen in CCM1, CCM2 oder CCM3 führen zu einem nicht unterscheidbaren klinischen Phänotyp. Alle drei Proteine bilden einen ternären Komplex in vitro, was eine Beteiligung an einem gemeinsamen molekularen Signalweg bekräftigt. Während die Proteine CCM1 und CCM2 in den letzten Jahren umfangreich erforscht wurden, ist über das CCM3-Protein bis heute wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CCM3 eine wichtige Rolle in der Angiogenese spielt und diese bei Überexpression in humanen Endothelzellen stark negativ reguliert: die Migration, die Proliferation und die Fähigkeit, kapillarähnliche Strukturen in Matrix-Gelen zu bilden kommt nahezu zum Erliegen. Ein gegenläufiger Effekt nach siRNA induziertem Knock-down von CCM3 war weniger stark ausgeprägt. Einzig die Fähigkeit, gefäßähnliche Strukturen in Matrigelen zu bilden, war erhöht. Um weiterhin Klarheit über die intrazellulären, von CCM3 beeinflussten Signalwege zu schaffen, wurden Tyrosin Kinase Arrays durchgeführt, bei welchen CCM3-überexprimierende HUVEC Lysate mit Kontrolllysaten verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass 5 Substrate signifikant erhöht phosphoryliert wurden: der Discoidin Domänen Rezeptor 1 (discoidin domain receptor; DDR1), die duale spezifitätstyrosinphosphorylierungsregulierte Kinase 1A (dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A; DYR1A), die Protoonkogen Tyrosin- Protein Kinase FER (proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER; FER), die fynbezogene Kinase (Fyn-related kinase; FRK) und die phosphoinositolabhängige Kinase 1 (Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDPK-1). Im Folgenden bestätigten Western Blot, dass die Überexpression von CCM3 in Endothelzellen die phosphoinositolabhängige Kinase 1 und die nachgeschaltete Serin-Threonin Kinase Akt/PBK aktiviert, welche ein bedeutsames Überlebenssignal der Zelle darstellt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass CCM3 nicht nur antiangiogen, sondern auch antiapoptotisch wirkt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass CCM3 für die Integrität des ruhenden, adulten Endothelbettes wichtig ist.
Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchlässigkeit entscheidend durch die sekundären Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. Während Ca2+ durch eine verstärkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilität erhöht, fördert cAMP die Adhäsion der Zellen und unterstützt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilitätserhöhung führt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte Änderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierfür wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps führt zu einer Konformationsänderung des Sensors und damit zu einer Abschwächung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener β-Rezeptoren erhöht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abhängig die cAMP-Konzentration um ca. 30 %. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verzögert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollständig aufgehoben. Dies bestätigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne β-adrenerge Stimulation führte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abhängigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidonsäure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat für die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration führte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gefäß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der Änderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener Mäuse mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene Mäuse generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmonären Endothelzellen konnte die Funktionalität des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten Änderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen ermöglicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten Änderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilität innerhalb eines intakten Gefäßes.
Endothelzellen sind ein aktiver Bestandteil der angeborenen Immunabwehr des Menschen gegen mikrobielle Pathogene. Unter ungünstigen Bedingungen kann die Abwehrreaktion sogar zu einer lebensbedrohlichen Sepsis führen. Hier wurde die bislang wenig bekannte Endothelantwort auf den fakultativ humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, einem der häufigsten Verursacher von letaler Sepsis beim Menschen, näher untersucht. Mittels Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse von HUVEC nach Exposition mit C. albicans konnten 56 hochregulierte Gene identifiziert werden, während 69 Gene herunterreguliert wurden. Ein bedeutender Anteil der regulierten Gene ist an Prozessen der angeborenen Immunantwort beteiligt und dient hauptsächlich der Rekrutierung von Neutrophilen. Weitere Untersuchungen ergaben eine zentrale Rolle des proinflammatorischen NF-kappaB-Weges bei der Regulation des Candida-induzierten Transkriptoms von Endothelzellen. Es konnte gezeigt werden, dass C. albicans diesen Signalweg sequenziell aktiviert. Zusätzlich konnte durch die Expression einer dominant-negativen Mutante einer Signalkomponente des NF-kappaB-Signalwegs die Candida-vermittelte Induktion von kappaB-abhängigen Genen gehemmt werden. Mit einem pharmakologischen Ansatz wurde der p38 MAP Kinase-Signalweg als weiterer bedeutsamer Signalweg identifiziert, der die Expression einzelner Candida-Zielgene wie CXCL8/IL-8 moduliert. Schließlich wurde gezeigt, dass die Candida-induzierte NF-kappaB-Aktivierung im untersuchten endothelialen Zellsystem unabhängig von den Toll-like Rezeptoren TLR2 und TLR4 geschieht, die üblicherweise an der Erkennung mikrobieller Pathogene beteiligt sind. Durch RNA-Interferenz-Experimente konnte jedoch dargelegt werden, dass das Adaptermolekül MyD88 und die Kinase IRAK1, die beide entscheidend an der TLR-vermittelten Signaltransduktion beteiligt sind, essentiell für die Weiterleitung des Signals in Endothelzellen sind. Nachfolgend konnte mit TLR3 zumindest einer der signaltransduzierenden Rezeptoren identifiziert werden. Als erste umfassende Untersuchung der endothelialen Antwort auf Candida albicans erlaubt die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die komplexen Signalmuster von Endothelzellen, die dieser klinisch bedeutende Krankheitserreger auslöst.