Refine
Has Fulltext
- yes (28)
Is part of the Bibliography
- yes (28)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (28) (remove)
Keywords
- Proliferation (28) (remove)
Institute
- Medizinische Klinik und Poliklinik II (4)
- Medizinische Klinik (bis 2004) (3)
- Pathologisches Institut (3)
- Graduate School of Life Sciences (2)
- Institut für Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung (2)
- Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie (2)
- Institut für Virologie und Immunbiologie (2)
- Fakultät für Biologie (1)
- Institut für Hygiene und Mikrobiologie (1)
- Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie (1)
p8 ist ein erstmals im Zusammenhang mit akuter Pankreatitis beschriebenes Protein, das im exokrinen und endokrinen Pankreas mit vermehrtem Zellwachstum assoziiert ist. Bei der Analyse seiner Primärstruktur wurde ein speziesübergreifend hoch konservierter Abschnitt, eine sogenannte NLS, ausgemacht, der HMG-Y/I-Proteinen ähnelt. Da HMG-Proteine oft als Transkriptionsfaktoren wirken, wurde die Hypothese formuliert, auch p8 sei ein HMG-Y/I-Protein und wirke als Transkriptionsfaktor im Nukleus. Um die Bedeutung der rp8-NLS näher zu charakterisieren, wurde in INS-1 beta-Zellen ein rp8(NLS-)-EGFP Fusionsprotein ektopisch exprimiert, um dessen subzelluläre Lokalisation zu untersuchen. Es zeigte sich, ähnlich wie bei Kontrollzellen mit ektoper Expression von EGFP allein, eine gleichmäßige Verteilung von rp8(NLS-)-EGFP zwischen Zytoplasma und Nukleus. Da rp8(NLS-) trotz fehlender NLS dennoch in den Kern translozieren kann, scheint die NLS für diesen Vorgang nicht essentiell zu sein. Diese Annahme wird gestützt durch die Beobachtung, dass einzeln exprimiertes rp8(NLS-) seine Proliferation induzierende Wirkung nicht verliert. In Zellzählungsexperimenten zeigte sich, dass ein rp8- bzw. p8(NLS-)-EGFP Fusionsprotein keinen proliferationsfördernden Einfluss in INS-1 und hMSC-TERT Zellen hat. Bei ektoper Expression von rp8 bzw. rp8(NLS-) und hrGFP als Einzelproteine konnte jedoch eine zwischen beiden rp8-Varianten ähnliche und insgesamt signifikante Stimulation der Zellvermehrung beobachtet werden. Dies belegt, dass die Fusion von rp8 an EGFP dessen biologische Funktion inhibiert, während die Deletion der NLS keinen Einfluß darauf hat. Da der proliferative Stimulus von p8 in menschlichen hMSC-TERT Zellen unabhängig von der Herkunft von p8 aus Ratte oder Mensch ist, scheint p8 bei Säugern hoch konserviert zu sein und speziesübergreifend zu wirken. Aus der hier vorgestellten Arbeit geht hervor, dass der molekulare Mechanismus, über den p8 glukoseabhängig proliferationsinduzierend in INS-1 beta-Zellen wirkt, nicht über die NLS vermittelt wird. Weitere Untersuchungen der Wirkungsweise von p8 auf molekularer Ebene könnten in Zukunft einen Ansatz zur in vitro-Generierung ausreichender Mengen an beta-Zellen zur Zelltherapie des Diabetes mellitus bilden.
Ein möglicher Ansatz neuer Therapiestrategien für Diabetes mellitus besteht zum einen in der Differenzierung von Stammzellen zu insulinproduzierenden Zellen und zum anderen in der Beschleunigung der Zellproliferation ebensolcher Zellen. In zahlreichen Studien wurden bereits mitogene Signaltransduktionswege in beta-Zellen des endokrinen Pankreas unter dem Einfluss diverser Nährstoffe untersucht. Das Protein p8, ursprünglich im Umfeld einer experimentell induzierten akuten Pankreatitis im Rattenmodell als Stressantwort beschrieben, ist an einem glukoseabhängigen Zellwachstum in der insulinproduzierenden beta-Zelle des endokrinen Pankreas beteiligt. Insofern ist es nur schlüssig, die Rolle des Proteins p8 im Rahmen der proliferationsassoziierten Signaltransduktion zu untersuchen. Zur näheren Charakterisierung von p8 wurden von unserer Arbeitsgruppe Wildtyp-INS-1-Zellen (WT-INS-1), als Modell für die beta-Zelle des endokrinen Pankreas, mit einem durch IPTG induzierbaren, p8-exprimierenden System ausgestattet (p8-INS-1). Dieses System wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst auf seine Funktionalität hin überprüft. Unter anderem konnte p8-cDNA in den stabil transfizierten p8-INS-1-Zellen und in den mit obigem Plasmid transient transfizierten WT-INS-1-Zellen dargestellt werden, wobei letztere WT-INS-1-Zellen stärker signalisierten und somit ein höheres „output“ an p8 zu generieren scheinen. In Immunoblotanalysen ergab sich ein ähnliches Bild. Durch p8-Überexpression kommt es zu einem zunehmenden Signal des Proteins p8 innerhalb der p8-INS-1-Zellen. Jedoch erscheint dieses Signal in WT-INS-1-Zellen noch stärker. Ebenso ließen sich mehrfach Doppelbanden sowohl bei p8-INS-1-Zellen als auch bei WT-INS-1-Zellen bei 14 kDa und 22 kDa darstellen. Das differenzierte Expressionsmuster beider Zelllinien im Rahmen dieser Immunoblotanalysen legt den Schluss nahe, dass eine Erhöhung des p8-Levels, sei es nun durch Induktion per IPTG-Gabe oder durch Wachstumsfaktoren, zu einem veränderten Molekulargewicht des Proteins p8 führt. Das Protein p8 unterliegt somit ständigen Veränderungen im Rahmen der Protein-Protein-Interaktion. Im Vordergrund stehen Phosphorylierungen als Aktivierungsinitiatoren und Ubiquitinierung mit synergistischer Proliferationszunahme unter p8-Überexpression und gleichzeitiger Proteasomhemmung. Gerade in Phasen erhöhten Zellstresses (Hypo- und Hypernutrition) lassen sich durch p8-Überexpression erhöhte Wachstumsraten nachweisen, während im physiologischen Bereich nur bei gleichzeitiger Proteasomhemmung Wachstumssteigerungen durch p8-Überexpression erreicht werden können. Dies unterstreicht einmal mehr die Rolle von p8 als Stressprotein. Nichtsdestotrotz übertreffen die Proliferationsraten der p8-INS-1-Zellen die der WT-INS-1-Zellen unter den verschiedensten Stimulationsbedingungen bei weitem. So konnte gezeigt werden, dass in den p8-INS-1-Zellen eine progrediente, glukoseabhängige Proliferation vorliegt, welche sich durch Gabe von IGF-1 oder foetalem Kälberserum (FBS) zu einem signifikanten synergistischen Wachstum ausweiten lässt. Und auch hier erzeugt p8 als Stressprotein bei p8-INS-1-Zellen im glukosefreiem Medium bei alleiniger Stimulation mit Wachstumsfaktoren signifikante Wachstumsraten im Vergleich zu WT-INS-1-Zellen. Die Umsetzung der Stimulation durch Glukose und Wachstumsfaktoren auf die p8-vermittelte Proliferation vollzieht sich innerhalb der Signaltransduktion. Mit Phosphatidylinositol-3´-Kinase (PI3´K) als Schlüsselprotein innerhalb der mitogenen Signaltransduktion und Proteinkinase C (PKC alpha, beta, gamma) konnten durch Co-Immuno-präzipitationen, GST-Pull-Downs, Immunoblotanalysen aber auch Inhibitionsversuche wichtige Interaktionspartner von p8 identifiziert werden. Weitere Bindungspartner des Proteins p8 resultierten durch Inhibitionsversuche mit Proteinkinasen wie PKCzeta und PKA, aber auch p38 MAPK als Vertreter des MAPK-Signalweges. Dabei zeigt sich ein relativ gleiches Bild mit tendenziell eher mäßigen Proliferationshemmung im niedrigen bis normalen Glukosebereich, welche sich unter p8-Überexpression verstärkt. Verschiedene Regelkreise zur Feinsteuerung der p8-vermittelten Proliferation scheinen hier denkbar. Sollte p8 neben der Zellproliferation auch zu einer Aktivierung der genannten Proteine führen, könnte die Inhibition dieser Proteine ihrerseits die p8-vermittelte Proliferation hemmen. Auf Proteinebene ließ sich die Verbindung zwischen p8 und MAPK p38, PKCzeta, PKA und PKB nicht nachweisen, erscheint aber wegen der Primärstrukturen der Proteine, sowie Erkenntnissen aus der bisherigen Literatur und auch aufgrund der Versuche mit Proteininhibitoren im Rahmen dieser Arbeit wahrscheinlich. Weitergehende Untersuchungen sollten daher noch erfolgen. Die vorgestellten Ergebnisse sind ein Beitrag zum besseren Verständnis der Rolle des Proteins p8 innerhalb der mitogenen Signaltransduktion als eine Voraussetzung für einen kurativen Ansatz des Diabetes mellitus Typ I.
In dieser Arbeit wurde in humanen CD34-positiven Stammzellen die PK-G, PK-A sowie ihr Substratprotein VASP nachgewiesen. Dabei liegt VASP in unstimulierten Zellen in nicht-phosphorylierter Form vor. Die VASP-Phosphorylierung kann durch die aus anderen Zellsystemen bekannten cAMP- und cGMP- abhängigen Signalkaskaden auch im Zellkultursystem von humanen CD34-positiven Stammzellen reguliert werden. Ein weiterer Teilaspekt war der Einfluss des cGMP-erhöhenden Stickstoffmonoxyd-Donors DEA/NO auf das Proliferations,- und Differenzierungsverhalten humaner CD34-positiver Stammzellen. Hierbei fand sich ein dualer konzentrationsabhängiger Effekt von cGMP: niedrige Konzentrationen zeigten einen hemmenden Einfluss auf die Proliferation undgleichzeitig einen aktivierenden Effekt auf die Differenzierung der hämatopeotischen Zellen zu CD41-positiven Megakaryozyten. Die höhere Konzentration von DEA/NO beinflusst zwar das Zellwachstum positiv, die Differenzierung der CD34-positiven Zellen hingegen wird gehemmt. Eine Zelldifferenzierung von humanen CD34-positiven Stammzellen zu CD15-positiven Granulozyten /Monozyten unter DEA/NO war nicht zu beobachten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Signalwege, die über zyklische Nukleotide reguliert werden, eine wichtige Rolle in Proliferations- und Differenzierungsvorgängen humaner hämatopoetischer Progenitorzellen spielen. Damit stehen diese Signalwege prinzipiell als Grundlage für neue pharmakologische Therapieoptionen zu Verfügung.
Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a life-threatening disease with limited options of chemotherapeutic treatment. Anti-AE chemotherapy is currently based on a single class of drugs, the benzimidazoles. Although acting parasitocidic in vitro, benzimidazoles are merely parasitostatic during in vivo treatment of AE and cause severe site effects. In the case of operable lesions, the resection of parasite tissue needs to be supported by a prolonged chemotherapy. Thus, the current treatment options for AE are inadequate and require alternatives. In the present work, the flatworm signaling pathways were analyzed to establish potential targets for novel therapeutic approaches. I focused on factors that are involved in development and proliferation of E. multilocularis using molecular, biochemical and cell biological methods. Among the analysed factors were three MAP kinases of the parasite, EmMPK1, an Erk-1/2 orthologue, EmMPK2, a p38 orthologue and EmMPK3, an Erk7/8 orthologue. Further, I identified and characterized EmMKK2, a MEK1/2 orthologue of the parasite, which, together with the known kinases EmRaf and EmMPK1, forms an Erk1/2-like MAPK module. Moreover, I was able to demonstrate several influences of host growth factors such as EGF (epidermal growth factor) and insulin on worm signaling mechanisms and larval growth, including the phosphorylation of Elp, an ezrin-radixin-moesin like protein, EmMPK1, EmMPK3 and increased mitotic activity of Echinococcus cells. In addition, several substances were examined for their efficacy against the parasite including (i) general tyrosine kinase inhibitors (PP2, leflunamide), (ii) compounds designed to inhibit the activity of receptor tyrosine kinases, (iii) anti-neoplastic agents (miltefosine, perifosine), (iv) serine/threonine kinase inhibitors that have been designed to block the Erk1/2 MAPK cascade and (v) inhibitors of p38 MAPKs. In these studies, EmMPK2 proved to be a promising drug target for the following reasons. Amino acid sequence analysis disclosed several differences to human p38 MAPKs, which is likely to be the reason for the observed enhanced basal activity of recombinant EmMPK2 towards myelin basic protein in comparison to human recombinant p38 MAPK-α. In addition, the prominent auto-phosphorylation activity of the recombinant EmMPK2 protein together with the absence of an interaction with the Echinococcus MKKs suggest a different mechanism of regulation compared to the human enzyme. EmMPK2 activity could be effectively inhibited in vitro and in cultivated metacestode vesicles by treatment with SB202190 and ML3403, two ATP-competitive pyridinyl imidazole inhibitors of p38 MAPKs, in a concentration-dependent manner. Moreover, both compounds, in particular ML3403, caused parasite vesicle inactivation at concentrations which did not affect cultured mammalian cells. Likewise, during the cultivation of Echinococcus primary cells, the presence of ML3403 prevented the generation of new vesicles. Targeting members of the EGF signaling pathway, particulary of the Erk1/2-like MAPK cascade, with Raf and MEK inhibitors prevented the phosphorylation of EmMPK1 in metacestodes cultivated in vitro. However, although parasite growth was prevented under these conditions, the structural integrity of the metacestode vesicles maintained during long-term cultivation in the presence of the MAPK cascade inhibitors. Similar results were obtained when studying the effects of other drugs mentioned above. Taken together, several targets could be identified that reacted with high sensitivity to the presence of inhibitory substances, but did not cause the parasite’s death with one exception, the pyridinyl imidazoles. Based on the presented data, I suggest pyridinyl imidazoles as a novel class of anti-Echinococcus drugs and imply EmMPK2 as survival signal mediating factor, the inhibition of which could be used for the treatment of AE.
Primäre Nestin-positive adulte Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Phänotypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Primärzellen in Kultur begründet, das in der vorliegenden Arbeit ausführlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und führt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorläuferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen könnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile Überex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 fördernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-überexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zurückzuführen. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und Überlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zellähnlichen Phänotypen differenzierbarer Vorläuferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur Lösung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie für den Diabetes mellitus leisten.
Hintergrund:Die Aktivierung naiver T-Zellen ist Folge eines Kontaktes zu Antigen präsentierenden Zellen (APC), die auf ihrer Oberfläche Antigene im MHC-Peptid-Komplex präsentieren. Bisherige Daten zur Kontaktdauer und -dynamik sowie zur nachfolgenden Aktivierung und Proliferation naiver T-Zellen beruhen meist auf Ergebnissen von Experimenten, die in Flüssigkulturmodellen gemacht wurden. Aus diesen resultierte die Beschreibung des sog. statischen Interaktionskonzeptes. Die T-Zell-Aktivierung wird überwiegend als Folge eines einzelnen lang dauernden und statischen Kontaktes zwischen T-Zelle und APC beschrieben (single encounter model), der zu einer kontinuierlichen Stimulation des T-Zell-Rezeptors über mehrere Stunden führt. Dem gegenüber steht das Konzept dynamischer Interaktionen, in dem T-Zell-Aktivierung und -Proliferation als Folge dynamischer, kurz dauernder und sequentieller Kontakte zu einer oder zu verschiedenen DC beschrieben werden (serielles Kontaktmodell). Methode: Da Flüssigkeitskulturen jedoch nicht annähernd das dreidimensionale Netzwerk lymphatischer Organe widerspiegeln, in dem der Kontakt zwischen T-Zellen und APC in vivo stattfindet, sollten in der vorliegenden Arbeit naive T-Zellen und dendritische Zellen (DC) in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung kokultiviert und auf Interaktionsdynamik und Mitoseaktivität untersucht werden. Im Verlauf der oxidativen Mitogenese mit autologen DC in einer 3D Kollagenmatrix über 56 Stunden wurden humane naive T-Zellen auf Dauer und Dynamik der Zell-Zell-Interaktionen videomikroskopisch sowie die nachfolgende Aktivierung und Proliferation mittels Durchflusszytometrie untersucht. Ergebnisse: Sowohl während der Oxidativen Mitogenese als auch in nicht stimulierten Kontrollkulturen wurden bei naiven T-Zellen fast ausschließlich kurz dauernde, wenige Minuten anhaltende Kontakte zwischen T-Zellen und DC beobachtet. Die mediane Dauer der Kontakte der Kontroll-T-Zellen zu DC war dagegen während aller Beobachtungsintervalle kürzer als die der naiven T-Zellen unter Oxidative Mitogenese-Bedingungen. Es ergaben sich in der Gesamtpopulation der naiven T-Zellen in allen Beobachtungszeiträumen signifikante Unterschiede bezüglich der medianen Interaktionszeiten unter Oxidative Mitogenese-Bedingungen und Kontrollbedingungen Die mediane Interaktionszeit unter Oxidative Mitogenese-Bedingungen lag in allen Beobachtungszeiträumen bei über fünf bis zehn Minuten, unter Kontrollbedingungen jeweils zwischen drei und sechs Minuten (p jeweils < 0,001). Lediglich in der Gruppe der anfangs DC adhärenten T-Zellen nach 24 – 32 Stunden konnten keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Dauer der Kontakte festgestellt werden (p = 0,461). Sowohl die Oxidative Mitogenese - wie auch die Kontrollkulturen zeigten nahezu ausschließlich dynamische und serielle Kontakte zu DC, multizelluläre Aggregate und statische Kontakte traten dagegen nur sehr selten auf. Infolge der Oxidativen Mitogenese, nicht jedoch in Kontrollkulturen, traten 40 %der T-Zellen in den Zellzyklus und durchliefen bis zu sechs Mitosen innerhalb von 96 h. Ausblick: Die Oxidative Mitogenese ist ein suffizientes Modell der vollständigen Aktivierung humaner peripherer naiver T-Lymphozyten in Kokultivierung mit DC. Passend zu in vivo Befunden sowie in vitro Daten muriner TCR-transgener T-Zellen erfolgt die Aktivierung und nachfolgende Proliferation überwiegend durch dynamische und kurzlebige Interaktionen. Die vorliegende Arbeit bestätigt das serielle Kontaktmodell für die Aktivierung naiver humaner T-Zellen.
Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen.
Der intrazelluläre Hormonrezeptor PPARgamma spielt eine Rolle in vielen Differenzierungsprozessen. Zudem konnte in multiplen malignen Tumoren verschiedenen Ursprungsgewebe gezeigt werden, dass sowohl Proliferation als auch Apoptose beeinflusst werden können und so eine neuartige antiproliferative Therapieoption bestehen könnte. Im Barrettadenokarzinom des distalen Ösophagus, einer malignen Neoplasie auf dem Boden von Magensäure- und Dünndarmsekretreflux, sind diese Zusammenhänge bisher nicht ausreichend untersucht. Ziel dieser Studie sollte eine Untersuchung von Proliferation und Apoptose des Barrettadenokarzinoms unter dem Einfluss von einer PPARgamma-Aktivierung durch den synthetischen Agonisten Pioglitazon sein. Dazu wurden in vitro Zelllinien von Barrettadenokarzinomen und von Plattenepithelkarzinomen sowie humane Barrettgewebeproben auf Expression von PPARgamma untersucht. Zudem wurde nach Stimulation mit Pioglitazon die Wirkung auf Proliferation und Apoptose gemessen. Nach Generierung von soliden Tumoren in immundepletierten balb/c nu/nu Mäusen wurden diese mit Pioglitazon-haltigem Actos® stimuliert und das Tumorwachstum mit einer Kontrollgruppe verglichen. Zudem wurden nach Explantation der Tumore histologisch Apoptose- und Proliferationsverhalten bestimmt. Wir konnten zeigen, dass PPARgamma in humaner Barrettmukosa und in der humanen Barrettadenokarzinomzelllinie OE33 überexprimiert ist. PPARgamma-Aktivierung inhibiert das Wachstum von OE33-Barrett-Adenokarzinomzellen in vitro durch eine Induktion von Apoptose, während das Wachstum von transplantierten Tumoren, die von OE33-Zellen abgeleitet wurden, in vivo durch systemische PPARgamma-Aktivierung auf dem Boden einer gesteigerten Proliferation und einer Hemmung der Apoptose verstärkt wurde. Diese Ergebnisse charakterisieren PPARgamma als einen potentiellen molekularen Mediator, der in die Entwicklung eines Barrettepithels mit Metaplasie aus normalem Plattenepithel in dem gastro-ösophagealen Übergang involviert ist.
Im Fokus dieser Studien standen mit Indicaxanthin und Betanin die beiden wichtigsten Vertreter der Betalaine sowie Kaktusfeigen- (Opuntia ficus indica) Extrakt. Die Durchführung der Studien erfolgte in folgenden Schritten: - Isolierung der Referenzsubstanzen Betanin und Indicaxanthin sowie Herstellung von Kaktusfeigen-Extrakt und daraus gewonnener Fraktionen, - Untersuchung der Cytotoxizität von Betanin, Indicaxanthin und Kaktusfeigen-Extrakt in humanen permanent Zell-Linien, - Beeinflussung der Apoptose und des Zellzyklus durch Betanin, Indicaxanthin und Kaktusfeigen-Extrakt in humanen permanent Zell-Linien, - Beeinflussung von Enzymen des Fremdstoffmetabolismus durch Betanin, Indica-xanthin und Kaktusfeigen-Extrakt in humanen permanent Zell-Linien. Die Gewinnung von Indicaxanthin (aus Kaktusfeigen), Betanin (aus Rote Beete-Konzentrat) sowie Kaktusfeigen-Extrakt erfolgte anhand literaturbekannter Methoden. Zur Bestimung der Cytotoxizität wurde untersucht, ob die Testsubstanzen die Proliferation von Caco2-, HT29- und HepG2-Zellen hemmen können. Als Ergebnis wurden EC50-Werte für die antiproliferative Wirkung von Betanin in Caco2-Zellen sowie für Kaktusfeigen-Extrakt in Caco2-, HT29- und HepG2-Zellen gefunden. Ein Einfluss der Testsubstanzen auf den Zellzyklus von Caco2- und HT29-Zellen wurde nicht beobachtet. Weiterhin induzierten die Testsubstanzen keine Apoptose in Caco2- oder HT29-Zellen. In den Studien zum Fremdstoffmetabolismus wurde beobachtet, dass vor allem Kaktusfeigen-Extrakt den Substratumsatz von Phase II-Enzyme wie UDP-Glucuronosyltransferase und Glutathion-S-Transferase steigern kann.
Hintergrund: Atherogene Lipoproteine und Angiotensin II sind an der Entstehung von Athe-rosklerose und Glomerulosklerose maßgeblich beteiligt. Sowohl klinische Studien als auch experimentelle Beobachtungen weisen auf eine Interaktion beider Substanzen im Sinne ei-ner Potenzierung ihrer Einzeleffekte hin. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Auswirkun-gen von Angiotensin II und nativen und oxidierten Low Density Lipoproteinen (natLDL bzw. oxLDL) auf den Zellzyklus von kultivierten vaskulären Gefäßmuskelzellen (BSMC) und Me-sangiumzellen (NHMC) im Sinne einer Proliferationsänderung unter anderem durch eine Beeinflussung der beteiligten Rezeptoren. Ebenso wurde die Interaktion von oxidierten LDL mit der Zelle sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmt. Methoden: Die Proliferation wurde sowohl mittels radioaktiv markiertem 3H-Thymidin-Einbau als auch durch den MTT-Assay, der auf der photometrisch messbaren Umwandlung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazoliumbromid beruht, quantifiziert. Die Rezepto-ren wurden auf Proteinebene durch Western Blot Analysen nachgewiesen. Zum Nachweis der Interaktion von oxidierten LDL mit den inkubierten Zellen wurden die oxidierten LDL mit-tels 3,3’-Dioctadecyclindocarbocyanin (DiI) fluoreszenzmarkiert. Visualisiert werden konnte die Interaktion in der Histochemie, die quantitative Bestimmung der DiI-oxLDL-Aufnahme erfolgte durch fluorometische Messung. Ergebnisse: Sowohl native als auch oxidierte LDL steigerten die Proliferation in BSMC und NHMC. In Myozyten lag das Maximum im Tritiumeinbau bei ca. 450% bezogen auf die Kon-trollzellen bei 10 µg/ml natLDL, und bei ca. 350% bei 20 µg/ml oxLDL. In NHMC fiel der An-stieg der Proliferation weniger stark aus, ca. 150% bei 30 µg/ml natLDL und ca. 180% bei 3 µg/ml oxLDL. Im MTT-Assay konnten signifikante Dosis-Wirkungs-Beziehungen erstellt wer-den, die absolute Proliferationssteigerung war jedoch geringer: BSMC 120%, NHMC 140%. Fluoreszenzmarkierte oxLDL wurden über Endozytose in einem konzentrations- und zeitab-hängigen Prozess mit einer Sättigung nach ca. 14 Stunden in die Zellen aufgenommen. Der oxLDL-spezifische LOX-1-Rezeptor konnte jederzeit nachgewiesen werden. Durch Angiotensin II alleine und in Co-Inkubation mit atherogenen Lipoproteinen konnte kei-ne Proliferationsänderung gezeigt werden. Die spezifische Hemmung des AT1-Rezeptors mit Losartan bewirkte ebenfalls keine signifikanten Änderungen. Auch die Inkubation der Zellen mit Agenzien, die die AT1-Rezeptordichte erhöhen sollten, erbrachte im Western Blot keine Veränderungen. Im Vergleich unterschiedlich alter Zellpopulationen ließ sich in höheren Passagen der proliferationsvermittelnde AT1-Rezeptor kaum nachweisen, jedoch war in die-sen Zellpopulationen der antagonistisch wirkende AT2-Rezeptor stark exprimiert. Zusammenfassung: Atherogene Lipoproteine beeinflussen zeit- und konzentrationsabhängig möglicherweise über eine LOX-1 vermittelte Endozytose den Zellzyklus von kultivierten glat-ten Muskelzellen und Mesangiumzellen im Sinne einer Proliferationssteigerung. Die uneinheitlichen Effekte von Angiotensin II auf die Proliferationsrate können durch die starken Expressionsschwankungen der antagonistisch wirkenden Angiotensin II-Rezeptor-Subtypen (AT1 und AT2) vor allem in unterschiedlich alten Zellpopulationen erklärt werden. Wodurch diese Expressionsveränderungen verursacht sind, ist gegenwärtig noch unklar, ebenso, ob diese Effekte im atherosklerotischen Plaque in vivo nachweisbar und pathophy-siologisch bedeutsam.