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Erweiterte Diagnostik bei neuromuskulären Erkrankungen: vom Genpanel zum Whole Genome Sequencing
(2019)
Muskeln und Nerven bilden eine essentielle funktionelle Einheit für den Bewegungsapparat. Neuromuskuläre Erkrankungen lassen sich unterteilen in Krankheiten, denen ein muskuläres Problem zu Grunde liegt, wie zum Beispiel Muskeldystrophien (Muskeldystrophie Duchenne, DMD) und Myopathien (Myofibrilläre Myopathie, MFM), und in Erkrankungen aufgrund von Nervenschädigungen, wie zum Beispiel Neuropathien und spastische Paraplegien (SPG).
In den vier Teilen der vorliegenden Arbeit konnte sowohl das genetische wie auch das phänotypische Spektrum von neuromuskulären Krankheiten erweitert werden. Die dafür verwendeten Methoden reichen von der Sanger-Sequenzierung einzelner Gene über Next-Generation Sequencing (NGS)-Panel-Diagnostik, zu Whole Exome Sequencing (WES) und schließlich zu Whole Genome Sequencing (WGS). Zusätzlich wurde cDNA zur Detektion von Veränderungen im Transkriptom sequenziert.
Im ersten Teil wurde der klinische Phänotyp der Seipinopathien erweitert, der jetzt auch amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und multifokale motorische Neuropathie (MMN) beinhaltet. Dafür wurde eine Panel-Analyse durchgeführt, die eine bekannte Mutation in BSCL2 aufdeckte. Aufgrund des hiermit erweiterten Phänotyps der Seipinopathien sollten Mutationen in BSCL2 auch bei anderen Verdachtsdiagnosen, wie ALS oder MMN, berücksichtigt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass in der Diagnostik SPGs und Charcot-Marie-Tooth Erkrankungen (CMTs) eine Überlappung zeigen und bei der Diagnose von Verdachtsfällen Gene aus beiden Krankheitsbereichen berücksichtigt werden sollten. Die Suche mit Hilfe eines Phänotyp-Filters hat sich dabei als erfolgreich erwiesen. Ungelöste Fälle sollten aber in regelmäßigen Abständen neu analysiert werden, da immer neue Gene mit den Phänotypen assoziiert werden.
Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung von DMD-Patienten mit bisher ungeklärtem Genotyp. Durch eine RNA-Analyse des gesamten DMD-Transkripts wurden tief-intronische Mutationen aufgedeckt, die Einfluss auf das Spleißen haben. Durch diese Mutationen wurden intronische Sequenzen als Pseudoexons in die mRNA eingefügt. Diese Mutationsart scheint häufig unter ungeklärten DMD-Fällen zu sein, in unserer Kohorte von 5 DMD-Patienten wurden in zwei Fällen Pseudoexons entdeckt. Eine Besonderheit besteht darin, dass in der RNA-Analyse immer noch ein Rest Wildtyp-Transkript vorhanden war, wodurch die Patienten vermutlich einen milderen Becker-Phänotyp aufweisen. Ein weiterer ungeklärter DMD-Fall konnte durch die Sequenzierung der gesamten genomischen Sequenz aufgeklärt werden. Es wurde eine perizentrische Inversion entdeckt (46,Y,inv(X)(p21.1q13.3). Dies zeigt, dass WGS auch zur Detektion von großen Strukturvariationen geeignet ist.
Im dritten Teil wurden Spleißmutationen untersucht. Spleißmutationen wurden bisher nicht in TMEM5-assoziierter alpha-Dystroglykanopathie beschrieben und somit als neue Mutationsart für diese Erkrankung nachgewiesen. Dabei wurde auch die funktionelle Exostosin-Domäne in TMEM5 bestätigt. Eine RNA-Untersuchung verschiedener Spleißmutationen zeigte, dass Spleißmutationen häufig zu einem veränderten Transkript führen, auch wenn diese Mutationen weiter von der Konsensussequenz entfernt sind. Spleißmutation sollten daher häufiger in der Diagnostik berücksichtig und überprüft werden.
Im letzten Teil wurde eine strukturierte Diagnostik von MFM-Patienten beschrieben und neue Kandidaten-Gene für MFM vorgestellt. Es ist zu vermuten, dass auch Mutationen in Genen, die bisher für Kardiomyopathien, Kollagen Typ VI-Myopathien und Neuropathien beschrieben sind, einen MFM-Phänotyp verursachen können. Diese Ergebnisse erweitern das genetische Spektrum der MFM, was sich auf die Diagnostik dieser Erkrankungen auswirken sollte.
Im Laufe dieser Arbeit konnten damit die neuromuskulären Erkrankungen vieler Patienten genetisch geklärt werden. Neue Phänotypen und genetische Ursachen wurden beschrieben und es wurde gezeigt, dass sich WGS technisch für die Diagnostik, auch zur Detektion von großen Strukturvarianten, eignet.
Bei einer Vielzahl neuromuskulärer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, können Mutationen in beiden Genomen die Auslöser dieser Erkrankungen darstellen. Veränderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Auslöser behandelt werden können. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste grün fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsfähigkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielführend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung für die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden können. Durch eine Ansäuerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigsäure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Größe des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen für die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig grün fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt für die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor müssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine höhere Transfektionseffizienz zu erreichen.
Das menschliche MHS2 Gen ist eine sehr gut charakterisierte Komponente des Mismatch-Reparatur-Systems (MMR) und häufig mit der HNPCC Erkrankung assoziiert. Der Mechanismus über den MSH2 an der Karzinomentwicklung beteiligt ist, sind Defekte in der DNA-Reparatur. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen in den kodierenden Regionen dieses Gens direkt in die Mikrosatelliteninstabilität involviert sind. Generell ist MSH2 ein Teil des postreplikativen Reparatursystems der Zellen, und schützt so vor der Akkumulation von Mutationen. Dadurch wird die genetische Stabilität und Integrität gewährleistet. Ein anderer Teil der zellulären Krebsabwehr ist das p53 Tumorsuppressorgen. Ein möglicher DNA Schaden, der in der Lage ist, p53 zu aktivieren, ist UV-Licht. Eine weitere gut charakterisierte Komponente der zellulären UV Reaktion ist der Transkriptionsfaktor c-Jun. Ziel der Arbeit war es die Regulation und Signalfunktion von MSH2 näher zu charakterisieren. Dazu wurde der Promotor des Gens in ein Luziferase Promotorgenkonstrukt kloniert. Dieses Konstrukt wurde in menschliche Keratinozyten transfiziert, die nachfolgend mit UV bestrahlt wurden. Es konnte eine zeit- und dosisabhängige Hochregulation von MSH2 gezeigt werden. Diese Transkriptionserhöhung wurde von p53 initiiert, denn durch eine gezielte Mutation der p53-Bindungsstelle im MSH2 Promotor war dieser Effekt vollkommen aufgehoben. Interessanterweise war dieser Effekt von einem zusätzlichen Faktor abhängig, ohne den keine Hochregulation erkennbar war. Verantwortlich hierfür war der Transkriptionsfaktor c-Jun. Dadurch konnte eine funktionelle Interaktion von p53 und c-Jun in der transkriptionellen Aktivierung von hMSH2 gezeigt werden. Dieser zeit- und dosisabhängige Effekt war sowohl auf RNA als auch auf Proteinebene nachvollziehbar. Der größte Anstieg war bei 50 J/m2 zu verzeichnen, wohin gegen bei Verwendung von 75 J/m2 die Transkriptmenge geringer wurde, um bei 100 J/m2 erneut anzusteigen. Um diesen erneuten Anstieg des Proteins näher zu beschreiben wurden bei den stark bestrahlten Zellen TUNEL-Untersuchungen durchgeführt. Hierbei zeigte sich eine positive Korrelation zwischen der Menge an MSH2 Protein und an TUNEL-positiven apoptotischen Zellen. Um weiter zu zeigen, dass der zweite Anstieg des Proteins nicht mit einer Reparaturfunktion verbunden ist, wurde ein biochemisch basierter Test durchgeführt, welcher die Reparaturkapazität semiquantitativ beschreibt. Dabei konnte klar gezeigt werden, dass die mit 100 J/m2 bestrahlten Zellen keine Reparaturfunktion mehr erfüllen. FACS-Analysen und Zellfärbungen gegen Annexin V und mit Propidiumiodid bestätigten die stattfindende Apoptose in den Zellen. Eine weitere Komponente des MMR-Systems ist MSH6. MSH6 bildet mit MSH2 ein Dimer, welches den Fehler in der DNA erkennt und das weitere Reparaturprogramm einleitet. Die Expression dieses Proteins konnte nur bis zu einer Dosis von 50-75 J/m2 UV nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu MSH2 war MSH6 nicht in 100 J/m2 bestrahlten Keratinozyten detektierbar. Um über die Lokalisation dieser Proteine mehr zu erfahren wurden Immunfärbungen gegen MSH2 durchgeführt. Es zeigte sich eine Translokation des Proteins vom Kern in das Zytoplasma in Korrelation zum zunehmenden DNA-Schaden durch höhere Dosen an UV-Licht. Dies stellt eine mögliche Verbindung zwischen dem Mismatch-Reparatursystem und apoptotischen Signalwegen dar.
Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt.
Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird.
Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen.
Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern.
Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war.
Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos.
Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen.
Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet.
Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren.
In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert.
Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war.
Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben.
Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren.
Neben der Frage nach dem Lebensalter als Kriterium zur Identifizierung unbekannter Leichen und menschlicher Überreste, wird der Bedarf einer Altersschätzung an lebenden Personen derzeit immer größer. Hinzu kommt die Hoffnung, aus Spuren Rückschlüsse auf das Alter des Spurenlegers ziehen zu können. Ziel dieser Arbeit war es, aus verschiedenen biologischen Materialien das Alter anhand der 4.977 bp-Deletion in menschlicher mitochondrialer DNA abschätzen zu können, wobei der Schwerpunkt auf Material von lebenden Personen lag. Hierzu wurde mit Hilfe geeigneter DNA-Extraktionsmethoden aus verschiedenen Gewebearten, venösem Vollblut, Mundschleimhautabstrichen und Haarwurzeln ausreichend DNA guter Qualität gewonnen. Die Schwierigkeit dieser Untersuchung lag in der Ermöglichung einer Quantifizierungsmethode zur Erfassung der 4.977 bp-Deletion. Dieses Problem wurde, nach der Wahl optimaler Primer und Amplifizierung spezifischer DNA-Fragmente, für die deletierte und die normale mtDNA unter optimierten PCR-Bedingungen im Multi-plex-Ansatz, mit Hilfe der Kapillarelektrophorese gelöst. Mit ihr konnte der Anteil der 4.977 bp-deletierten und der normalen mtDNA durch die computeranalysierten Peakflächen der beiden Fragmente bestimmt und miteinander in Verhältnis gesetzt werden. Dieses Verhältnis wurde durch den Quotienten IDel/INorm ausgedrückt. Die gewonnenen Ergebnisse wurden anschließend ausgedehnten statistischen Erhebungen unterzogen. Die 4.977 bp-Deletion zeigte in allen untersuchten Materialien eine eindeutige Altersabhängigkeit. Dies wurde an der Zunahme des Quotienten IDel/INorm mit steigendem Alter ersichtlich. Für die verschiedenen Gewebearten war die Abhängigkeit dieser Deletion vom Alter bereits aus der Literatur bekannt. Im Blut wurde diese jedoch erstmalig gezeigt, ebenso wie in den Mundschleimhautabstrichen, die bisher noch nie für Untersuchungen der 4.977 bp-Deletion herangezogen wurden. In den Haarwurzeln konnte die Deletion nicht nachgewiesen werden. Auffällig war hierbei, dass die Altersabhängigkeit von Material zu Material unterschiedlich ausgeprägt war. Der größte Anteil deletierter mtDNA fand sich im Gehirngewebe, gefolgt von Skelettmuskulatur, Herz, Lunge, Milz, Niere Leber und Haut. Für diese unterschiedliche Akkumulierung der 4.977 bp-Deletion finden sich zwei mögliche Erklärungsansätze, die Theorie einer unterschiedlichen Mitoserate und die einer unterschiedlichen Stoffwechselaktivität, die beide die gewonnene Rangfolge bestätigen. Des Weiteren wurde eine Abhängigkeit der 4.977 bp-Deletion von der in die PCR eingesetzten DNA-Menge festgestellt. Dieser Effekt muss im Zusammenhang mit der unterschiedlichen Amplifizierungseffizienz der beiden relevanten DNA-Fragmente gesehen werden, wodurch jedoch die Einschränkungen der angewandten unkontrollierten Multiplex-PCR mit anschließender semi-quantitativer Detektion der Amplifikations- produkte deutlich werden. Unter Berücksichtigung der Einschränkungen gelang anhand von Perzentilentabellen eine Altersschätzung mit der Angabe einer Altersspanne von ungefähr 30 Jahren. Um eine genauere Altersschätzung zu erreichen, wäre eine Optimierung der Methode, z. B. durch Anwendung einer real-time quantitativen PCR, und eine Einbeziehung einer noch größeren Probenzahl nötig.
In die Region p13 des menschlichen Chromosoms 11 kartieren mehrere krankheitsrelevante Gene wie das Wilms' Tumor Gen WT1 oder das für die Aniridie verantwortliche Gen PAX6. Beide Gene können bei Patienten mit dem WAGR-Syndrom deletiert sein, was das Auftreten von Wilms' Tumoren oder Aniridie bei diesen Patienten erklärt. Die genetische Ursache für weitere Symptome des WAGR-Syndroms, wie beispielsweise die geistige Retardierung, ist bisher nicht geklärt. Des weiteren wurden Allelverluste auf 11p13 in Verbindung mit verschiedenen Tumoren (Lunge, Blase, Brust, Ovar) beobachtet, ohne daß die ursächlichen Gene hierfür beschrieben werden konnten. Eine Kartierung und anschließende Sequenzierung dieser Region dient als Grundlage für die Identifizierung neuer Gene, die möglicherweise im Zusammenhang mit diesen Krankheiten stehen. Mit dem Ziel der Sequenzierung dieser Region wurde ausgehend von einem YAC-Contig, das 8 Mb des Chromosoms 11p13-14.1 abdeckt, eine Feinkartierung der Region 11p13 durchgeführt. Über ein Screening einer humanen PAC-Bibliothek mit 11p13-spezifischen Proben, wurden PAC-Klone erhalten, die aus dieser Region stammen. Mit einem Teil dieser Klone konnte mittels "chromosome walking" ein 4,5 Mb großes PAC-Contig erstellt werden. Zur Sequenzierung des Chromosomenabschnitts 11p13 am Sanger Centre/UK wurden die PAC-Klone des "minimal tiling path" gewählt. Auf der Grundlage des PAC-Contigs wurden auf experimentellem Weg mit Hilfe des Exontrappings neue Transkripte isoliert. Hierfür wurden sechs PAC-Klone, die etwa 700 kb des Chromosoms 11p13 abdecken, herangezogen. Zusätzlich wurden erste Sequenzabschnitte (insgesamt ca. 640 kb) der PAC-Klone über eine computergestütze Auswertung mit dem Programmpaket NIX/HGMP analysiert. Insgesamt konnten mit Hilfe des Exontrappings und der in silico Analyse fünf neue potentielle Transkripte identifiziert werden. Eine erste Untersuchung dieser Transkripte wurde mit Hilfe von Datenbankvergleichen und Expressionsstudien auf Northern Blots und in situ Hybridisierungen durchgeführt. Aussagen über eine mögliche Funktion konnten bei zwei der identifizierten Transkripte anhand von Datenbankvergleichen getroffen werden. Es handelt sich zum einen um ein Transkript mit Homologien zum Gen cca3 aus der Ratte, für das aufgrund der enthaltenen BTB-Domäne eine regulatorische Funktion auf DNA-Ebene postuliert werden kann. Zum anderen wurde ein Gen mit Ähnlichkeiten zu einem Transkript aus Achlya ambisexualis isoliert. Letzteres besitzt möglicherweise die Funktion eines Steroidrezeptors. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Transkripten, können aus dem erstellten PAC-Contig neue Gene auf der Basis von cDNA-Selektion, Exontrapping oder, nach Fertigstellung der gesamten Sequenz, über in silico Analysen identifiziert werden.
Das humane MLC1 (auch als KIAA0027 oder WKL1 benannt) ist ein 377 AS umfassendes Protein, welches vornehmlich in neuralen Geweben exprimiert wird. Aufgrund von Strukturanalysen und Homologievergleichen wurde eine Funktion als Ionenkanal mit acht Transmembrandomänen postuliert. Loss-of-function-Mutationen des MLC1-Gens lassen sich mit dem Auftreten der Megalenzephale Leukenzephalopathie mit subkortikalen Zysten korrelieren. Ferner konnte anhand einer Stammbaumanalyse gezeigt werden, dass die C1121A-Mutation in einer größeren Familie mit dem Auftreten der Periodischen Katatonie nach Leonhardt (PK) kosegregierte, wobei Folgeuntersuchungen zur Assoziation von MLC1-Mutationen und dem Auftreten der PK widersprüchliche Ergebnisse erbrachten.
Zur weiteren Aufklärung der biologischen Funktion von MLC1 war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, in zwei experimentellen Ansätzen nähere Kenntnisse zum transkriptionellen Expressionsmuster von MLC1 in vivo zu gewinnen, und anschließend durch Herstellung eines polyklonalen Antikörpers gegen das humane MLC1 den Grundstein für weitergehende Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung von MLC1 zu legen.
Mittels In Situ-Hybridisierung humaner und muriner Gewebeschnitte aus Hippocampus und Cerebellum konnte gezeigt werden, dass die MLC1/Mlc1-Transkription in diesen Geweben vornehmlich in den Bergmann-Gliazellen der Purkinjezellschicht des Cerebellums sowie – in schwächerem Umfang – in verstreut liegenden und in der subgranulären Zone des Gyrus dentatus gehäuften Astrozyten des murinen Hippocampus nachweisbar war. Im zweiten Schritt der Analyse wurden humane post-mortem cDNA-Proben aus verschiedenen Gehirnregionen und zusätzlich einigen nicht-neuralen Geweben von zwei Menschen gewonnen, mittels quantitativer Real-time-PCR die Genexpression von MLC1 bestimmt und mithilfe des Expressionsniveaus von ausgewählten Housekeeping-Genen (GAPDH, L13a, β-Aktin, ARP und Cyclophilin) normalisiert. Es zeigte sich, dass in allen getesteten Hirnregionen eine deutliche MLC1-Expression festzustellen war, deren Maxima im Cerebellum und Frontalhirn und deren Minima im Putamen bzw. im nicht-neuralen Plexus chorioideus lagen. Zudem konnte eine nicht-neurale Expression auf sehr geringem Niveau für Lunge und Milz nachgewiesen werden.
Zur Gewinnung eines polyklonalen Antikörpers gegen humanes MLC1 wurden mittels computergestützter Verfahren ein 117 AS langes Vakzinierungsprotein entworfen, welches immunogene Abschnitte des N-Terminus (61 AS) und C-Terminus (54 AS) enthielt. Die kodierende Sequenz wurde unter Verwendung des Impact-CN®-Expressionssystems in einen pTYB-Vektor kloniert, in ER2566-Zellen exprimiert, das Protein affinitätschromatographisch über Chitin-Säulen isoliert und aufgereinigt und mittels Bradford-Assay und SDS-Gelelektrophorese nachgewiesen.
Leider konnte trotz vielfältiger Variation der Versuchsparameter kein eindeutiger Nachweis einer ausreichenden Expression des MLC1-Proteins in den ER2566-Zellen erbracht werden, die für die anschließende Vakzinierung von Kaninchen zur Gewinnung des polyklonalen Antiserums erforderlich gewesen wäre. Die Gründe hierfür sind unklar, denkbar sind beispielsweise eine suboptimale Codon-Frequenz, eine schlechte Proteinlöslichkeit, intrazelluläre mRNA-Degradation, proteolytische Abbauvorgänge oder eine Hemmung der Proteinbiosynthese durch die biologische Funktion des Proteins.
Zusammenfassend konnten die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse einen Beitrag zur Erweiterung des Wissens zur MLC1-Expression leisten. Dabei entsprachen die Befunde zur humanen MLC1-Expression weitgehend den diesbezüglichen Beobachtungen zur regionalen und zellulären Expressionsstärkenverteilung aus dem Mausmodell, welche eine funktionelle Bedeutung von MLC1 im Rahmen von neuralen Schrankenstrukturen nahelegten (vgl. Schmitt et al. 2003). Mittels der zwischenzeitlich von anderen Arbeitsgruppen (über andere experimentelle Verfahren) erzeugten Antikörper gegen MLC1 konnte gezeigt werden, dass funktionelles MLC1 vermutlich als zellmembranständiges Dimer vorliegt und seine biologische Funktion u.a. durch Interaktion mit dem DGC (=Dystrophin-assoziierten Glykoprotein-Komplex) in den Caveolae ausübt. Es bleibt eine Aufgabe für die Zukunft, die genauen molekularen Mechanismen dieser Prozesse und ihre mögliche therapeutische Beeinflussbarkeit zur Behandlung der MLC zu erforschen. Auch die Frage der potenziellen extraneuralen MLC1-Expression, für die in dieser Arbeit Hinweise gefunden wurden, mag ein interessanter Ansatzpunkt für zukünftige Forschungsarbeiten sein.
Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger.
Ätherische Öle bzw. Ätherisch-Öl Komponenten sind etabliert in der Therapie der chronischen und akuten Bronchitis. Eine klinische Studie, die mit Thymianextrakt durchgeführt wurde, ließ auf die klinische Wirksamkeit bei akuter Bronchitis schließen. Zahlreiche pharmakodynamische Effekte konnten in vitro für Thymianextrakt bzw. das ätherische Thymianöl gezeigt werden, jedoch wurde bis jetzt die systemische Verfügbarkeit der betreffenden Verbindungen am Zielorgan noch nicht untersucht. Diesbezügliche Untersuchungen sind notwendig, um die Verknüpfung zwischen den in vitro beobachteten Effekten und der klinischen Wirksamkeit herstellen zu können. Eine pharmakokinetische Studie wurde nach Einnahme einer Einzeldosis BronchipretTP (Filmtabletten mit 60 mg Primelwurzelextrakt und 160 mg Thymianextrakt) durchgeführt, um festzustellen, ob Thymol, das den Hauptbestandteil des ätherischen Thymianöls darstellt, zur Wirksamkeit dieser Zubereitung beitragen kann. Dazu wurde eine Extraktionsmethode für die Bestimmung von Thymol nach enzymatischer Spaltung des Phase-II-Konjugates Thymolsulfat im Plasma sowie von Thymolsulfat und Thymolglucuronid im Urin entwickelt. Es wurde eine neuartige, automatisierte headspace Festphasenmikroextraktionsmethode (HS-SPME) entwickelt, die Extraktion, Anreicherung und Probenaufgabe in einem einzigen Schritt ermöglichte. Die Quantifizierung von Thymol im unteren ng.mL-1 Bereich wurde durch die Verwendung von Gaschromatographie in Kombination mit Flammenionisationsdetektion durchgeführt. Die Automatisierung der Methode war notwendig um sie nach internationalen Richtlinien zur Validierung bioanalytischer Methoden validieren zu können. Dies ist das erste Mal, dass eine Bioverfügbarkeitsstudie bzw. eine pharmakokinetische Studie mit Hilfe der HS-SPME durchgeführt wurde. Thymol selbst war nicht systemisch verfügbar. Es war kein freies Thymol oberhalb von 1,4 ng/mL im Plasma detektierbar. Der systemisch verfügbare Phase-II-Metabolit wurde per LC-MS/MS als Thymolsulfat identifiziert. Thymolsulfat wurde nur im Plasma detektiert, wohingegen sowohl Thymolsulfat als auch Thymolglucuronid im Urin nachgewiesen wurden. Im Urin wurde kein freies Thyxmol oberhalb von 2,1 ng/mL detektiert. Da Thymol nur in Form von Thymolsulfat systemisch verfügbar war, wurde die pharmakokinetische Auswertung an Hand der sich nach enzymatischer Spaltung von Thymolsulfat ergebenden Daten vorgenommen. Die pharmakokinetische Studie wurde nach Verabreichung einer Einzeldosis BronchipretTP (1,08 mg Thymol) mit 12 Probanden durchgeführt. Die Resorption von Thymol war frühzeitig. Bereits nach 20 min konnte Thymol im hydrolisierten Plasma nachgewiesen werden. Maximale Plasmakonzentrationen (cmax) von 93,1±24,5 ng/mL (MW±SD) wurden nach 1,97±0,77 h (tmax) (MW±SD) erreicht. Die Plasmakonzentrationen zeigten einen biphasischen Verlauf und die terminale Eliminationphase setzte nach ca. 10 h ein. Die Eliminationshalbwertszeit errechnete sich zu 10,2 h. Dies betont die Wichtigkeit entsprechend langer Meßzeiträume in Verbindung mit einer hoch sensitiven Analytik, um die Elimination vollständig erfassen zu können. Bezogen auf die verabreichte Thymoldosis (1,08 mg) wurden 16,2±4,5 Prozent (MW±SD) mit unverändertem Thymolgrundgerüst renal eliminiert. Die renale Clearance von 271±156 mL/h (MW±SD) indiziert eine hohe Plasmaeiweißbindung und/oder tubuläre Reabsorption. Die Daten deuten darauf hin, dass die klinische Wirksamkeit nach Applikation einer thymianextrakthaltigen Zubereitung auf Thymolsulfat oder mögliche Phase-I-Metabolite zurückzuführen sein könnte. Die pharmakodynamischen Effekte dieser Verbindungen wurden bislang noch nicht untersucht. Andererseits könnte die Aktivität von Sulfatasen im Lungengewebe die pulmonale Elimination von Thymol erklären. Freies Thymol könnte somit am Respirationstrakt wirksam sein, obwohl es im Plasma nicht detektiert wurde.
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