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Deregulierte Überaktivierung von Tyrosinkinasen der Abl-Familie spielen eine wesentliche Rolle in verschiedenen Leukämieformen beim Menschen. Neben der schon seit vielen Jahren für die CML als ursächlich anerkannten Fusionskinase p210Bcr-Abl sind weitere Fusionskinasen unter Beteiligung der Abl-Kinase in Formen der sowohl CML als auch der ALL und CMML beschrieben worden. Diese seltener auftretenden Abl-Fusionskinasen umfassen sowohl Bcr-Abl Proteine anderer Größe (p165Bcr-Abl, p190Bcr-Abl und p230Bcr-Abl) als auch die Tel-Abl Fusionskinasen, die anstelle von Teilen des Bcr-Proteins Teile des Tel-Proteins beinhalten. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kinasespezifität der onkongenen Fusionstyrosinkinasen Bcr-Abl und Tel-Abl mit der der physiologischen Kinasen c-Abl und Arg verglichen. Mittels kurzer Peptide, deren Aminosäuresequenzen Phosphorylierungsepitopen in Substratproteinen der Kinasen der Abl-Famile entsprechen, konnte eine verminderte katalytische Spezifität der onkogenen Kinasen Bcr-Abl und Tel-Abl gezeigt werden. Der zweiten Teil der hier dargestellten Ergebnisse fokussiert auf Signaltransduktionsereignisse, die in Tel-Abl exprimierenden Zellen auftreten, und vergleicht diese mit der für Bcr-Abl bekannten Signaltransduktion. Ähnlich wie Bcr-Abl konnte auch Tel-Abl in Proteinkomplexen mit dem Adapterprotein CRKL, ein Protein, das in Bcr-Abl-transformierten Zellen konstitutiv Tyrosin-phosphoryliert ist, nachgewiesen werden. Des weiteren wurde gezeigt, daß in den Tel-Abl exprimierenden Zellen die Adapterproteinen c-CrkII und CRKL phosphoryliert sind und mit vielen anderen tyrosinphosphorylierten Proteinen Komplexe bilden. Schließlich wurden einige Signaltransduktionsschritte beschrieben, die sowohl in Zellen, die Tel-Abl exprimieren, als auch in Zellen mit Bcr-Abl-Expression aktiviert sind. Mittels eines Ras×GPT-spezifischen Präzipitationsassys konnte eine konstitutive Anhebung des GTP-belandenen Anteils des GTPase Ras in den Zellen mit Expression der leukämischen Abl-Formen gezeigt werden. Sowohl die mitogene Kinase MAPK/Erk als auch die Kinase Akt/PKB, welche die Apotptose blockiert, werden ebenfalls durch Tel-Abl aktiviert. Die Ergebnisse der hier dargestellten Arbeit zeigen, daß die leukämischen Abl-Fusionsproteine eine katalytische Spezifität aufweisen, die sich von der der physiologischen Abl-Kinasen unterscheidet und daß Tel-Abl zumindest einige der Signaltransduktionswege zu aktivieren vermag, welche auch durch das onkogene Protein Bcr-Abl aktiviert werden.
Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten.
Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält.
Bei c-Jun N-terminalen Kinasen (JNKs) (auch als Stress-aktivierte Proteinkinasen SAPKs bezeichnet), handelt es sich um Mitglieder der Mitogen-aktivierten Proteinkinase Familie (MAPK), die die Genexpression als eine Antwort auf eine Vielzahl von physiologischen und nicht-physiologischen Stimuli regulieren. Gendeletionsexperimente (knockout) und der Einsatz von dominant-negativen Mutanten wiesen auf eine Funktion von SAPK/JNKs bei Prozessen der zellulären Differenzierung, dem Überleben und/oder Apoptose sowie onkogener Transformation hin. Direkte Analysen des transformierenden Potentials von SAPK/JNKs wurden bislang durch das Fehlen von konstitutiv-aktiven Mutanten verhindert. Erst unlängst konnte durch die Fusion der MAP Kinase mit seiner direkten, in der Kaskade vorgeschalteten, Aktivatorkinase solche Mutanten bereitgestellt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein SAPKb-MKK7 Hybridprotein generiert, mit dessen Hilfe das transformierende Potential von aktiviertem SAPKb charakterisiert werden konnte. Die induzierte Expression von SAPKb-MKK7 führte zur morphologischen Transformation von NIH 3T3 Fibroblasten. Darüber hinaus bildeten diese Zellen kleine Foci aus transformierten Zellen, wuchsen in Soft-Agar und vergleichbar mit onkogenem Ras oder Raf, resultierte auch die Expression von aktiviertem SAPKb in der Zerstörung des F-Aktins. Des Weiteren steigerte die Expression von SAPKb-MKK7 die Proliferationsraten von NIH 3T3 Zellen. Im Gegensatz zu den akut transformierenden Onkogenen wie ras oder raf, ist SAPKb-MKK7 jedoch nicht in der Lage, das Überleben der transformierten Zellen zu bewirken. Unsere Daten schlagen daher vor, das konstitutiv-aktives SAPK/JNK zwar die Hauptaspekte zellulärer Transformation verursacht, aber nicht imstande ist, alle Veränderungen zu induzieren, die benötigt werden, um einen vollständig transformierten Phänotypen zu etablieren, weshalb insgesamt gesehen, sein transformierendes Potential deutlich schwächer ausgeprägt ist. Wir haben zusätzlich damit begonnen, dass tumorgene Potential von SAPKb-MKK7 direkt im Nacktmausmodell zu verifizieren. Die Injektion von SAPKb-MKK7 exprimierenden Fibroblasten resultierte in der Etablierung eines gut definierten Fibrosarkoms, wobei die Latenzzeit länger war als bei v-Raf transformierten Zellen. Somit ist die Expression von aktiviertem SAPK/JNK ausreichend, um die Tumorentwicklung in vivo zu initieren, auch wenn die lange Latenzzeit auf die Notwendigkeit zusätzlicher genetischer Veränderungen hinweist.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die vollständige cDNA-Sequenz des Proteinkinase A-Ankerproteins-2 (AKAP-2, 7,5kB) ermittelt. Zu diesem neuen humanen Gen sind bis dato außer einem unvollständigem Datenbankeintrag noch keine experimentellen Daten zur cDNA, mRNA oder zum Protein veröffentlicht. Mittels Northernblot wurde die Regulation der Expression der mRNA von AKAP-2 in humanem osteoblastären hFOB-Zellen sowie ihre Expression in unterschiedlichen Geweben untersucht: In hFOB-Zellen wird die mRNA bereits basal in geringem Maße exprimiert und kann schnell und transient induziert werden.Das Maximum der Induktion sowohl durch TNFa als auch durch TPA erfolgt nach fünf Stunde, v.a. durch veränderte Transskription. Dies entspricht der Kinetik eines sogenannten schnell induzierbaren Gens. Beide Stoffe wirken u.a. über den Transkriptionsfaktor NFkB. Andere Faktoren wie die Phosphatidylinositol-3-Kinase und cAMP dagegen scheinen keine Relevanz für die Expressionsinduktion der mRNA zu haben. TNFa spielt im Knochenstoffwechsel eine wichtige Rolle bei Osteoklastenaktivierung, Knochenresorption und bei der Entstehung von Osteoporose. AKAP-2 wird in Osteoblasten, aber auch in undifferenzierten monozytären Zellen, Vorläufern von Osteoklasten, exprimiert. AKAP-2 könnte also bei der interzellulären Kommunikation zwischen Osteoblasten und Osteoklasten von Bedeutung sein. Bisher wurden Vertreter der Familie der Proteinkinase A-Ankerproteine noch nicht in Knochengewebe nachgewiesen. Ihre Bedeutung für die Organfunktion ist vielfältig. Auf zellulärem Niveau kommt es durch Bindung der PKA in der Nähe der Adenylatzyklase und des hier entstehenden cAMP zu einer lokal erhöhten Wirkung von cAMP-vermittelten Signalen. Da die Expression der mRNA von AKAP-2 selbst unabhängig von cAMP ist, scheint es sich hier um eine Kreuzungsstelle verschiedener Signaltransduktionswege zu handeln, bei der von TNFa aktivierte zweite Botenstoffe bzw. Transkriptionsfaktoren (z.B. NFkB), die PKC und möglicherweise weitere, hier jedoch nicht weiter identifizierte Zytokine und Wachstumsfaktoren zur vermehrten Bereitstellung eines Ankerproteins der PKA führen.
Einleitung: Die Plasmamembran Ca2+-ATPase (PMCA) ist ein ubiquitär in eukaryonten Zellen vorkommendes Enzym, das Kalziumionen aus der Zelle transportiert. In Myokardzellen ist ihre Funktion trotz eingehender biochemischer Charakterisierung unklar. Die frühere Hypothese einer Zuständigkeit für die Feinabstimmung der [Ca2+]iz wurde in neuerer Zeit ergänzt durch die vermutete Rolle der PMCA in der Regulation von Zellparametern wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Unterstützt wird dies durch die Lokalisation der ATPase in Caveolae, spezifischen Membraninvaginationen, in denen wichtige Zentren der zellulären Signalverarbeitung gesehen werden. Ziel: Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion der Plasmamembran Ca2+-ATPase, insbesondere eine mögliche Beteiligung des Enzyms an der Übermittlung zellulärer Signale im Rahmen von Apoptose und Wachstum, weiter aufgeklärt werden. Methoden: Die Experimente zur Apoptose in dUTP-nick-end-labeling (TUNEL)-Technik wurden zum einen an einer Myoblastenlinie, zum anderen an transgenen Ratten mit hPMCA 4CI-Überexpression durchgeführt. Die Proteinsyntheseraten neonataler Kardiomyozyten wildtypischer bzw. überexprimierender Tiere mittels 3H-Leucin-Inkorporation in Ruhe und unter Stimulation mit hypertrophieinduzierenden Substanzen wurden verglichen. Ergänzend zu diesen funktionellen Versuchen fanden Immunfluoreszenzanalysen an neonatalen Kardiomyozyten der hPMCA 4CI-überexprimierenden Rattenlinie 1142 statt. Ergebnisse: In der L6-Myoblastenlinie beeinflußte die Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase die Apoptose nicht, ebenso in ruhenden neonatalen Kardiomyozyten. Phenylephrin und Isoproterenol steigerten die Syntheseaktivität in den überexprimierenden Herzmuskelzellen signifikant gegenüber Wildtypkontrollen. NOS-Inhibition mit L-NAME induzierte in den neonatalen Kardiomyozyten Hypertrophie. Die Kombination von L-NAME und Isoproterenol ergab in beiden Zellgruppen gegenüber dem Einzelstimulus verdoppelte Proteinsyntheseraten, wobei die Myozyten der Linie 1142 signifikant stärker ansprachen. Zusammenfassung: Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase moduliert myozytäres Wachstum, wobei ein Einfluß auf den b-adrenergen und NO Signalweg vorliegt. Die mittels Immunfluoreszenz nachgewiesene Lokalisation der PMCA in Caveolae läßt eine Interaktion des Enzyms mit anderen Signaltransduktionsmolekülen in diesen Subkompartimenten vermuten.
In dieser Doktorarbeit wurden zwei intrazelluläre Anteile des IL-4 Rezeptors als GST-Fusionsproteine exprimiert. GST-E1, in dem das cytoplasmatische membranproximale 1/3 von IL-4Ralpha (173 AS) einschließlich des Box 1 Motivs an GST fusioniert ist, konnte nach differenzierter De- und Renaturierung und Bindung an Glutathion-Sepharose Matrix in elektrophoretisch reiner Form aufgereinigt werden. GST-gammainP5D4, in dem die intrazelluläre Domäne von gamma c an GST gebunden vorliegt, konnte nur als heterogenes Gemisch mit 4 C-terminal verkürzten Fraktionen erhalten werden. Mit diesen rekombinanten Fusionsproteinen wurden Immunpräzipitationsversuche in Lysaten IL-4R-transfizierter Ba/F3 Zellen vor und nach Stimulation mit IL-4 durchgeführt. Für GST-E1 wurde eine Wechselwirkung mit Jak1 nachgewiesen, die dem bisherigen Kenntnisstand entspricht; für GST-ginP5D4 hingegen konnte eine Wechselwirkung mit Jak3 nicht gezeigt werden. Beide Proteine sind in der Lage, STAT5 zu präzipitieren; diese Bindung erscheint unabhängig von der IL-4 Stimulation der Zellen und läßt neue Spekulationen über den Mechanismus der Signaltransduktion durch STAT5 zu. Danach könnten nach den hier gewonnenen Informationen beide IL-4-Rezeptorketten jeweils ein STAT5 Molekül zur STAT5-Dimerisirerung nach Rezeptoraktivierung beitragen. Es ist somit gelungen, ein in-vitro-Modell zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen am IL-4 Rezeptor zu etablieren, welches für weitere Untersuchungen eingesetzt werden kann.
Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden.
Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR.
Das zentrale Paradigma der Systembiologie zielt auf ein möglichst umfassendes Ver-ständnis der komplexen Zusammenhänge biologischer Systeme. Die in dieser Arbeit angewandten Methoden folgen diesem Grundsatz.
Am Beispiel von drei auf Basis von Datenbanken und aktueller Literatur rekonstruier-ten Netzwerkmodellen konnte in der hier vorliegenden Arbeit die Gültigkeit analyti-scher und prädiktiver Algorithmen nachgewiesen werden, die in Form der Analy-sesoftware Jimena angewandt wurden. Die daraus resultierenden Ergebnisse sowohl für die Berechnung von stabilen Systemzuständen, der dynamischen Simulation, als auch der Identifikation zentraler Kontrollknoten konnten experimentell validiert wer-den. Die Ergebnisse wurden in einem iterativen Prozess verwendet werden um das entsprechende Netzwerkmodell zu optimieren.
Beim Vergleich des Verhaltens des semiquantitativ ausgewerteten regulatorischen Netzwerks zur Kontrolle der Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Chondrozyten (Knorpelbildung), Osteoblasten (Knochenbildung) und Adipozyten (Fett-zellbildung) konnten 12 wichtige Faktoren (darunter: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) mit Hilfe der Berechnung der Bedeutung (Kontrollzentralität der Netzwerkknoten identifi-ziert werden). Der Abgleich des simulierten Verhaltens dieses Netzwerkes ergab eine Übereinstimmung mit experimentellen Daten von 47,2%, bei einem widersprüchlichen Verhalten von ca. 25%, dass unter anderem durch die temporäre Natur experimentel-ler Messungen im Vergleich zu den terminalen Bedingungen des Berechnung der stabilen Systemzustände erklärt werden kann.
Bei der Analyse des Netzwerkmodells der menschlichen Immunantwort auf eine Infek-tion durch A. fumigatus konnten vier Hauptregulatoren identifiziert werden (A. fumi-gatus, Blutplättchen, hier Platelets genannt, und TNF), die im Zusammenspiel mit wei-teren Faktoren mit hohen Zentralitätswerten (CCL5, IL1, IL6, Dectin-1, TLR2 und TLR4) fähig sind das gesamte Netzwerkverhalten zu beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Aktivitätsverhalten von IL6 in Reaktion auf A. fumigatus und die regulato-rische Wirkung von Blutplättchen mit den entsprechenden experimentellen Resultaten deckt.
Die Simulation, sowie die Berechnung der stabilen Systemzustände der Immunantwort von A. thaliana auf eine Infektion durch Pseudomonas syringae konnte zeigen, dass die in silico Ergebnisse mit den experimentellen Ergebnissen übereinstimmen. Zusätzlich konnten mit Hilfe der Analyse der Zentralitätswerte des Netzwerkmodells fünf Master-regulatoren identifiziert werden: TGA Transkriptionsfaktor, Jasmonsäure, Ent-Kaurenoate-Oxidase, Ent-kaurene-Synthase und Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase.
Während die ersteren beiden bereits lange als wichtige Regulatoren für die Gib-berellin-Synthese bekannt sind, ist die immunregulatorische Funktion von Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase bisher weitgehend unbekannt.