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Adenocarcinoma lung cancer is a type of non-small cell lung carcinoma (NSCLC), which accounts for 85% of lung cancer incidence globally. The therapies that are being applied, both conventional therapies and antibody-based treatments, are still found to have side effects. Several previous studies have demonstrated the ability of the ethanolic extract of Ocimum sanctum Linn. (EEOS) as an ethnomedicine with anti-tumor properties. The aim of this study was to determine the effect of Ocimum sanctum Linn. ethanolic extract in inhibiting the proliferation, angiogenesis, and migration of A549 cells (NSCLC). The adhesion as well as the migration assay was performed. Furthermore, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure the expression of αvβ3 integrins, α5β1 integrins, and VEGF. The cells were divided into the following treatment groups: control (non-treated/NT), positive control (AP3/inhibitor β3 80 µg/mL), cisplatin (9 µg/mL), and EEOS at concentrations of 50, 70, 100, and 200 µg/mL. The results showed that EEOS inhibits the adhesion ability and migration of A549 cells, with an optimal concentration of 200 µg/mL. ELISA testing showed that the group of A549 cells given EEOS 200 µg/mL presented a decrease in the optimal expression of integrin α5β1, integrin αvβ3, and VEGF.
Background
Ovarian cancer is mostly associated with pathologically regulated permeability of peritoneal vessels, leading to ascites. Here, we investigated the molecular regulation of endothelial permeability by the vascular endothelial growth factor (VEGF) and both tight and adherens junction proteins (VE-cadherin and claudin 5) with regards to the tumor biology of different ovarian cancer types.
Methods
Serum and ascites samples before and after surgery, as well as peritoneal biopsies of 68 ovarian cancer patients and 20 healthy controls were collected. In serum and ascites VEGF protein was measured by ELISA. In peritoneal biopsies co-localization of VE-cadherin and claudin 5 was investigated using immunohistochemical dual staining. In addition, the gene expression of VE-cadherin and claudin 5 was quantified by Real-time PCR. Differences in VEGF levels, VE-cadherin and claudin 5 gene expression were analyzed in relation to various tumor characteristics (tumor stage, grading, histological subtypes, resection status after surgery) and then compared to controls. Furthermore, human primary ovarian cancer cells were co-cultured with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and changes in VE-cadherin and claudin 5 were investigated after VEGF inhibition.
Results
VEGF was significantly increased in tumor patients in comparison to controls and accumulates in ascites. The highest VEGF levels were found in patients diagnosed with advanced tumor stages, with tumors of poor differentiation, or in the group of solid / cystic-solid tumors. Patients with residual tumor after operation showed significantly higher levels of VEGF both before and after surgery as compared to tumor-free resected patients. Results of an immunohistochemical double-staining experiment indicated co-localization of VE-cadherin and claudin 5 in the peritoneal vasculature. Compared to controls, expression of VE-cadherin and claudin 5 was significantly suppressed in peritoneal vessels of tumor patients, but there were no significant differences regarding VE-cadherin and claudin 5 expression in relation to different tumor characteristics. A significant positive correlation was found between VE-cadherin and claudin 5 expression. VEGF inhibition in vitro was associated with significant increase in VE-cadherin and claudin 5.
Conclusions
Our results indicate that increased peritoneal permeability in ovarian cancer is due to down-regulation of adhesion proteins via tumor derived VEGF. Advanced ovarian cancer with aggressive tumor biology may be associated with early dysregulation of vascular permeability leading to ascites. These patients may benefit from therapeutic VEGF inhibition.
Nectin‐2 is an adhesion molecule that has been reported to play a role in tumor growth, metastasis and tumor angiogenesis. Herein, we investigated Nectin‐2 in ovarian cancer patients and in cell culture. Tumor as well as peritoneal biopsies of 60 ovarian cancer patients and 22 controls were dual stained for Nectin‐2 and CD31 using immunohistochemistry. Gene expression of Nectin‐2 was quantified by real‐time PCR and differences analyzed in relation to various tumor characteristics. In the serum of patients, vascular endothelial growth factor (VEGF) was quantified by ELISA. Effect of VEGF on Nectin‐2 expression as well as permeability was investigated in HUVEC. In tumor biopsies, Nectin‐2 protein was mainly localized in tumor cells, whereas in peritoneal biopsies, clear colocalization was found in the vasculature. T3 patients had a significantly higher percentage of positive lymph nodes and this correlated with survival. Nectin‐2 was significantly upregulated in tumor biopsies in patients with lymph node metastasis and with residual tumor >1 cm after surgery. Nectin‐2 expression was significantly suppressed in the peritoneal endothelium of patients associated with significantly increased VEGF serum levels. In cell culture, VEGF stimulation led to a significant downregulation of Nectin‐2 which was reversed by VEGF‐inhibition. In addition, Nectin‐2 knockdown in endothelial cells was associated with significantly increased endothelial permeability. Nectin‐2 expression in ovarian cancer may support tumor cell adhesion, leading to growth and lymph node metastasis. In addition, VEGF‐induced Nectin‐2 suppression in peritoneal endothelium may support an increase in vascular permeability leading to ascites production.
Background
Incontinentia Pigmenti is a rare disease affecting multiple organs. Fifty of patients show affection of the eye with retinopathy and possible amaurosis being the worst outcome. Treatment has commonly been panretinal laser coagulation but intravitreal application of bevacizumab as VEGF-inhibitor has shown to effectively suppress retinal neovascularization.
Case presentation
A six-week-old female infant with Incontinentia Pigmenti developed a foudroyant necrotizing enterocolitis shortly after intravitreal injection of bevazicumab due to a retinopathy with impending tractional detachment of the left eye. Since the onset of abdominal symptoms occurred immediately after the intravitreal application, a link between the two events seemed likely. Sequential analyses of the VEGF serum concentrations showed a massive suppression of endogenous VEGF with only a very slow recovery over weeks. Such a severe systemic adverse event has not been reported after intravitreal treatment with bevacizumab in an infant.
Conclusion
This case report shows a relevant systemic uptake of bevacizumab after intravitreal application as suppressed VEGF levels show. There seems to be a connection between suppressed VEGF levels and the onset of necrotizing enterocolitis. Therefore, treatment with bevacizumab should be carefully considered and further research is needed to assess this drug’s safety profile.
Hintergrund: Die Überexpression von Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1) wird mit Tumorprogression und schlechter Prognose in Zusammenhang gebracht. Wir untersuchten, ob die pharmakologische Hemmung des Transkriptionsfaktors HIF-1 mittels Chetomin, einem Inhibitor der Interaktion von HIF-1 mit dem Koaktivator Protein p300, die Hypoxie-induzierte Strahlenresistenz menschlicher Fibrosarkomzellen vom Typ HT 1080 beeinflusst.
Methoden: Die optimale Dosis von Chetomin wurde durch Versuchsreihen mit Hypoxie-sensiblem Promotor in mit destabilisiertem EGFP-Vektor transfizierten HT 1080 HRE-Zellen bestimmt. HT 1080 Zellen wurden mittels RT-PCR sowie Western Blot auf die Transkription der HIF-1-regulierten Gene Carboanhydrase IX (CA9) und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) untersucht. Außerdem wurden sie zur Erstellung klonogener Assays unter normoxischen sowie hypoxischen (0,1% O2, 12 Stunden) Bedingungen in vitro mit 0, 2, 5 oder 10 Gy bestrahlt mit oder ohne Chetominbehandlung (150 nM, 12 Stunden, Vorbehandlung 4 Stunden).
Ergebnisse: In der RT-PCR zeigte sich eine signifikante Reduktion (Signifikanzniveau p<0,05) der mRNS-Expression von CA9 und VEGF unter Chetomin und Hypoxie auf 44,4 +/- 7,2% beziehungsweise 39,6 +/- 16,0%, im Western Blot supprimierte Chetomin auch die Downstream-Genprodukte von CA9 und VEGF. In den Überlebenskurven erhöhte Chetomin die Wirksamkeit der Bestrahlung wesentlich, der modifizierte Sauerstoffeffekt (modified Oxygen Enhancement Ratio, OER') war mit Ausnahme der 50% SF in Bezug auf die Kontrollen bei 50%, 37% und 10% Relativem Überleben (SF) von 1,57 auf 1,58, von 1,56 auf 1,42 und von 1,38 auf 1,22 reduziert.
Schlussfolgerung: Die HIF-1-Hemmung durch Chetomin reduziert effektiv die Hypoxie-abhängige Transkription und verstärkt die Strahlensensibilität von hypoxischen HT 1080 Fibrosarkomzellen in vitro.
Background
Malignant pleural effusion (MPE) is associated with advanced stages of lung cancer and is mainly dependent on invasion of the pleura and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) by cancer cells. As MPE indicates an incurable disease with limited palliative treatment options and poor outcome, there is an urgent need for new and efficient treatment options.
Methods
In this study, we used subcutaneously generated PC14PE6 lung adenocarcinoma xenografts in athymic mice that developed subcutaneous malignant effusions (ME) which mimic pleural effusions of the orthotopic model. Using this approach monitoring of therapeutic intervention was facilitated by direct observation of subcutaneous ME formation without the need of sacrificing mice or special imaging equipment as in case of MPE. Further, we tested oncolytic virotherapy using Vaccinia virus as a novel treatment modality against ME in this subcutaneous PC14PE6 xenograft model of advanced lung adenocarcinoma.
Results
We demonstrated significant therapeutic efficacy of Vaccinia virus treatment of both advanced lung adenocarcinoma and tumor-associated ME. We attribute the efficacy to the virus-mediated reduction of tumor cell-derived VEGF levels in tumors, decreased invasion of tumor cells into the peritumoral tissue, and to viral infection of the blood vessel-invading tumor cells. Moreover, we showed that the use of oncolytic Vaccinia virus encoding for a single-chain antibody (scAb) against VEGF (GLAF-1) significantly enhanced mono-therapy of oncolytic treatment.
Conclusions
Here, we demonstrate for the first time that oncolytic virotherapy using tumor-specific Vaccinia virus represents a novel and promising treatment modality for therapy of ME associated with advanced lung cancer.
Das Glioblastom ist mit einem Anteil von 20% an allen hirneigenen Tumoren der häufigste und bösartigste primäre intrakranielle Tumor. Trotz multimodalem Therapiekonzept, das operative Resektion, Strahlen- und Chemotherapie verbindet, haben Patienten eine Prognose von im Mittel nur 14,6 Monaten. Sein aggressives Wachstum zieht eine Vaskularisierung nach sich, die jedoch nicht in ausreichendem Maße die Sauerstoffversorgung des Tumorgewebes sicherstellen kann. Studien mit Messelektroden zeigten einen deutlich reduzierten Sauerstoffpartialdruck im Tumor im Vergleich zum umliegenden Hirngewebe. Dieses hypoxische Milieu löst genetische Alterationen und adaptive Veränderungen der Proteinexpression aus, die eine Selektion besonders aggressiver Tumorzellen bewirkt. Für eine bessere prognostische Einschätzung sowie als zukünftige therapeutische Ziele zur Erhöhung der Response auf Chemo- und Strahlentherapie ist es von großem Interesse, solche Faktoren als mögliche Hypoxiemarker aufzufinden. In dieser Arbeit wurden die Proteine HIF-1α, CAIX, VEGF, EPO und NDRG1 auf mRNA- und Proteinebene in den Glioblastomzelllinien GaMG, U251 und U373 auf eine Veränderung ihrer Expression unter hypoxischen Bedingungen untersucht. Ausmaß (5% O2, 1% O2 und 0,1% O2) und Dauer (1 h, 6 h und 24 h) der Hypoxie wurde variiert. Anschließend wurde über 24 h und 48 h eine Reoxygenierung durchgeführt. Auch wurden Expressionsuntersuchungen an Gewebeproben von Normalhirnen, Astrozytomen WHO Grad II und Glioblastomen vorgenommen. Die Verwendbarkeit von GAPDH als Marker für diese Analysen wurde durch Experimente sichergestellt, die dessen mRNA und das Protein als nicht durch Hypoxie oder Malignisierung reguliert nachwiesen. Wir bestätigten die Rolle von HIF-1α als Mediator der hypoxischen Zellantwort. Während die mRNA konstant blieb, wurde das Protein unter hypoxischen Bedingungen hochreguliert. Dies zeigte auch, dass unser experimentelles Setting funktionierte. NDRG1, CA-IX sowie EPO wurden unter Hypoxie sowohl auf mRNA-, als auch Proteinebene hochreguliert und blieben unter Reooxygenierung stabil. In Glioblastomen waren diese Gene auf mRNA-Ebene bedeutend stärker exprimiert als in niedriggradigen Astrozytomen. HIF-1α, NDRG1, CA-IX sowie EPO können also in humanen Glioblastomzellen als Hypoxiemarker dienen und möglicherweise auch eine prognostische und therapeutische Bedeutung haben.
Das Nebennierenrindenkarzinom ist ein seltener maligner, epithelialer Tumor mit einer jährlichen Inzidenz in Deutschland von 2 pro 1 Million Einwohnern. Es ist für etwa 0,2% aller Krebstodesfälle verantwortlich. Die Seltenheit der Erkrankung erschwert die Entwicklung wirksamer Therapieansätze erheblich. Erst in letzter Zeit gelang es, größere Patientenkohorten in kontrollierten Studien zu behandeln (Allolio et al. 2006) und größere Fallzahlen an Tumorgewebe wissenschaftlichen Untersuchungen zuzuführen. Erstmalig besteht damit auch die Möglichkeit, die Expression eventuell relevanter Proteine für moderne Therapiekonzepte auch an großen Fallzahlen zu untersuchen. Bislang liegen nur sehr lückenhafte diesbezügliche Studien vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression einiger möglicherweise therapeutisch relevanter Proteine mittels immunhistochemischer Analyse unter Zuhilfenahme der Tissue Microarray-(TMA)-Technik in einer großen Serie von 104 NNR-Ca untersucht und mit der von Nebennierenadenomen und normalem Nebennierengewebe verglichen. Insgesamt 9 verschiedene Proteine wurden immunhistochemisch dargestellt: Als wichtigster Befund wurde eine Überexpression der Alpha-methylacyl-CoA Racemase (AMACR) in 89% der untersuchten NNR-Ca festgestellt. Interessanterweise zeigte auch die Mehrzahl der untersuchten Nebennierenadenome (80%) zumindest eine schwache AMACR-Reaktivität, während die mituntersuchten normalen Nebennieren negativ blieben. Diese bislang nicht beschriebene Beobachtung gleicht den bekannten Befunden z.B. in der Prostata, in der sowohl die dort entstehenden Adenokarzinome, als auch deren Vorläuferläsionen (PIN) eine AMACR-Expression zeigen. EGFR, ein Tyrosinkinaserezeptor, auf den der bereits etablierte therapeutische Antikörper Cetuximab (Erbitux®) zielt, wurde in 49% der untersuchten NNR-Ca verstärkt exprimiert, so dass eine gegen den EGFR gerichtete Therapie in ausgewählten Fällen eine Behandlungsoption zu eröffnen scheint. Die Suche nach Mutationen in diesem potentiellen Zielprotein könnte weitere Ansatzpunkte für Wirkstoffe aufzeigen, Studien gibt es dazu bislang keine. Ähnliche Ergebnisse fanden sich in dieser Studie für VEGF, das von 19% der untersuchten NNR-Ca mäßig oder stark exprimiert wurde. Auch hier könnte eine entsprechende Therapie mit einem bereits kommerziell erhältlichen spezifischen Antikörper (Bevacizumab/Avastin®) in einem Teil der Fälle eine Behandlungsoption, ggf. auch als supportive Maßnahme, eröffnen. Angesichts der Expression von VEGF in nur rund einem Drittel der Fälle, wäre hier aber eine vorangehende Bestimmung des Expressionsstatus am Tumorgewebe unerläßlich. Weitere Untersuchungen sollten auch den VEGF-Rezeptor als möglichen Ansatzpunkt neuer Wirkstoffe, wie z.B. der Multi-Tyrosinkinase-Inhibitor Sunitinib [SU11248; SUTENTTM] (Le Tourneau et al., 2007), erforschen. Im Gegensatz dazu wurde eine wesentliche Expression weiterer untersuchter Proteine (CD117/C-kit, Her-2/neu, Östrogen- und Progesteronrezeptor) in NNR-Ca in dieser Studie nicht in einem Maße gefunden, welches in einer signifikanten Zahl von Fällen eine Therapieoption eröffnen würde. Eine immunhistochemisch bestimmbare Expression von p53, als Surrogatmarker für ein mutiertes p53-Gen wurde in 85% der untersuchten NNR-Ca nachgewiesen. Dies weist auf eine zentrale Bedeutung von p53-Mutationen in der Genese von NNR-Ca hin. (Reincke et al., 1994; Gicquel et al., 2001; Barzon et al.I, 2001; Soon et al., 2008) Auch die Proliferationsfraktion, bestimmt als Ki67-Index, war in den untersuchten Karzinomen gegenüber den Adenomen und den mitgeführten normalen Nebennieren deutlich erhöht, was das aggressive Wachstumspotential der Mehrzahl der NNR-Ca wiederspiegelt.
Steps involved in the progression of non-small cell lung cancer (NSCLC) to metastasis are poorly understood. Expression of oncogenic C-RAF in lung epithelial cells has yielded a model for non-small cell lung cancer (NSCLC). The induced adenomas are characterised by high genomic stability, a lack of tumor progression and pronounced cell-cell contacts raising the question whether disruption of E-cadherin complexes would promote progression to metastasis. Two genetic approaches were used to evaluate the role of adherens junctions in a C-RAF driven mouse model for NSCLC: conditional ablation of the Cdh1 gene and expression of dominant negative (dn) E-cadherin. Disruption of E-cadherin function caused massive formation of intratumoral vessels that was reversible in the early phase of induction. Vascularized tumors grew more rapidly, developed invasive fronts and gave rise to micrometastasis. ß-catenin was identified as a critical effector of E-cadherin disruption leading to up-regulation of angiogenic inducers (VEGF-A and VEGF-C) in mouse and human lung tumor cell lines. In vivo, lung tumor cells with disrupted E-cadherin expressed ß-catenin target genes of endodermal and other lineages suggesting that reprogramming may be involved in metastatic progression.
Grundlage dieser Arbeit war es die verschiedenartigen Effekte von Butyrat, unter anderem im Rahmen der Prävention von kolorektalen Karzinomen auf die bereits fortgeschrittenen Formen, zu erweitern. Hierzu erfolgte eine Unteruchung von Angiogenesefaktoren und deren Beeinflussung durch die kurzkettige Fettsäure Butyrat. Die untersuchten Faktoren umfassten VEGF, als potentes angiogenetisches Agens und dessen zugehörigen Rezeptor FLT-1. Zudem wurde das Tumorsuppressorgen p53, ein wichtiger Modulator der Tumorentstehung und Tumorprogression, mituntersucht. Ziel war es, die positiven Effekte im Rahmen der Prävention auf die metastasierten kolorektalen Karzinome bzw. derer Zelllinien aufzuzeigen. Die verwendeten Methoden stützten sich einerseits auf die Analyse der mRNA und der Proteine. Hierfür wurden die Zellkultur, die RNA-Isolation, ein RNase Protection Essay (RPA), der Westernblot und ein Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) durchgeführt. Die Analysen zeigten einen positiven Effekt auf die Supprimierbarkeit des Wachstumsfaktors VEGF und dessen Rezeptor FLT-1, sowie auch auf das Tumorsuppressorgen p53mut- in seiner mutierten Variante. Butyrat senkte somit die Expression von VEGF und FLT-1 sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene. Bezüglich der Expression von p53 konnte gezeigt werden, dass die RNA-Expression durch Butyrat ebenfalls eine Hemmung erfuhr. Ein weiteres Ergebnis der Arbeit bestand darin, den Stress, welcher sowohl die Zugabe von Butyrat als auch eine Episode mit Serumentzug auf das Verhalten des Wachstumsfaktors VEGF hatte. Hierbei zeigte sich eine sehr rasche Zunahme der Expression. Diese normalisierte sich im weiteren Verlauf und hatte somit keinen längerfristigen Einfluß auf die Ergebnisse. Zusammenfassend zeigt sich eine deutliche Beeinflussung der Angiogenese durch Butyrat, welche auch auf dem Hintergrund der aktuellen Studienlage bezüglich VEGF Antikörpern einen adjuvanten Behandlungsweg darstellen könnte. Kritisch anzumerken bleiben die Probleme der Applikation von Butyrat.