Refine
Has Fulltext
- yes (12)
Is part of the Bibliography
- yes (12)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (7)
- Journal article (5)
Keywords
- PCR (12) (remove)
Institute
- Medizinische Klinik und Poliklinik II (3)
- Institut für Humangenetik (2)
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (2)
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (1)
- Institut für Rechtsmedizin (1)
- Institut für Virologie und Immunbiologie (1)
- Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, Gefäß- und Kinderchirurgie (Chirurgische Klinik I) (1)
- Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie (ab 2004) (1)
- Medizinische Klinik und Poliklinik I (1)
Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Optimierung und Etablierung einer random amplified polymorphic DNA-PCR-Anwendung zum zweifelsfreien Nachweis der spurenverursachenden Spezies aus Blut- und Gewebespuren. Hierzu wurden verschiedene Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von DNA aus Spurenmaterial getestet. Die Kombination aus Chelex-100-Extraktion und DNA-Aufreinigung mittels Diatomeen erwies sich als besonders geeignet. Neben dem Hervorbringen einer ausreichend großen Menge an DNA-Material besticht diese Methodik durch einen sehr geringen Zeit- und Kostenaufwand, weshalb ein überaus ökonomisches Arbeiten gewährleistet werden kann. Der Ablauf der eingesetzten RAPD-PCR wurde nach verschiedenen Vorlagen aus der Literatur modifiziert und optimiert, so dass schlussendlich nahezu jede Amplifikation erfolgreich verlief. Im Laufe der Arbeit kamen verschiedene Primer zum Einsatz, wovon Primer I bei allen Spuren menschlicher bzw. tierischer Herkunft ein eindeutiges Ergebnis zu Tage brachte. Primer II konnte erfolgreich zur Differenzierung von verschiedenen Pflanzengeweben eingesetzt werden. Die Darstellung der Amplifizierungsprodukte erfolgte primär mittels einer horizontalen PAGE, woran sich eine hochauflösende Kapillarelektrophorese anschloss. In Einzelfällen kamen sowohl Agarosegelelektrophorese als auch Urea-PAGE zum Einsatz. Die aus der hochauflösenden Kapillarelektrophorese resultierenden Ergebnisse wurden in Datenmaterial umgewandelt und mittels der Software GeneScan ausgewertet. Es wurden Spuren von insgesamt 25 verschiedenen Tierarten, des Menschen sowie Pflanzengewebe untersucht. 22 der 25 untersuchten Tierarten konnte mittels der hochauflösenden Kapillarelektrophorese ein artspezifisches Fragmentmuster zugeordnet werden, ebenso dem Menschen und den unterschiedlichen Pflanzengeweben. Alle Tierarten konnten im Rahmen einer, mit unmarkiertem Primer I durchgeführten PAGE mit Hilfe einer Vergleichsprobe zweifelsfrei identifiziert bzw. differenziert werden. Im Rahmen eines aktuellen Falles von Pferdeschändung konnte die spurenverursachende Spezies mittels der angewendeten Methodik eindeutig als Pony identifiziert werden, womit die Anwendbarkeit des Verfahrens als erwiesen gilt.
Fanconi-Anämie gehört zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilität aus. Die genomische Instabilität ist auch Ursache häufiger Rückmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilität vor. Insbesondere gilt dies für das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilität aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als häufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplementär einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. Für die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine höhere Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase.