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In this study, murine ES cells and DT40 B cells were used in parallel to disrupt the Nfatc1 gene and to study the function of individual 6 Nfatc1 isoforms, especially the function of highly inducible NFATc1/aA.We found that the short isoform NFATc1/aA protects DT40 B cells against apoptosis while the long isoform NFATc1/aC appears to enforce apoptosis. DNA microarray studies have shown that in NFATc1" DT40 B cells expressing ectopically human NFATc1/aA, the pkc-theta gene is several fold stronger expressed as in wild type cells. Our results of EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays) and ChIP (chromatin immuno-precipitation) experiments demonstrated the binding of NFATc1/aA to the pkc-theta promoter in vitro and in vivo. NF-kappa B was also found to bind to the NFATc1 P1-promoter in vitro and in vivo. These data suggest and further prove that NF-kappa B contributes to the induction of the NFATc1 P1 promoter upon activation of T cells. So, NFATc1/aA and NF-kappa B were found to cross-talk in the transcriptional upregulation of their target genes, such as the IL-2 gene and the Nfatc1 gene itself, at multiple steps upon induction of apoptosis. While the pro-apoptotic mechanism of NFATc1s long isoform(s) remains unclear, its corresponding “death partners” are worth further studies. The elucidation of functional roles of NFATc1s short or long isoforms in the control of apoptosis of lymphocytes helps to understand apoptosis regulation, and thereby, the fate of lymphocytes.
Sowohl NFAT- (Nukleäre Faktoren aktivierter T-Zellen) als auch MEF2- (’myosin-enhancer factor 2’) Transkriptionsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung, Proliferation oder Apoptose vieler eukaryotischer Zellen. Sie sind in einer Vielzahl von Zellen aktiv und können dort die Transkription ihrer Zielgene nach Stimulation der Zellen mit anschließendem Calcium-Einstrom aktivieren. Dabei kooperieren sie oft mit anderen Transkriptionsfaktoren. Kurz vor Beginn dieser Arbeit erschienen zwei Veröffentlichungen, die eine Kooperation von MEF2D mit NFATc2 bei der Aktivierung des nur77-Promotors, der bei der negativen Selektion von T-Zellen aktiv ist, beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit sollte nun das Bindungsverhalten verschiedener NFAT-Proteine an den nur77-Promotor und ihre Kooperationsfähigkeit mit MEF2D bei der Aktivierung des nur77- und anderer Promotoren untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass verschiedene NFAT-Faktoren direkt an ein Oligonukleotid des nur77-Promotors (von Position -274 bis -247 bp reichend) binden. Diese Bindung wird zwar durch eine Bindung von MEF2-Faktoren an den Promotor unterstützt, ist jedoch nicht wesentlich beeinträchtigt, wenn MEF2-Faktoren aufgrund von einer Mutation in ihrer Bindungssequenz nicht binden können. Dagegen führt eine Mutation der NFAT-Bindungsstelle zu einer aufgehobenen Bindung von NFAT-Faktoren an den Promotor. Desweiteren zeigte sich, dass nicht nur endogenes NFATc2 sondern auch verschiedene NFATc1-Isoformen an den Promotor binden können. In ihrer Fähigkeit mit MEF2D zu kooperieren, zeigte sich kein Unterschied zwischen den getesteten NFAT-Isoformen NFATc1/αA, NFATc1/αC oder NFATc2. So aktivierten in Transfektionsversuchen in Jurkat T-Zellen und 293 T-Zellen alle NFAT-Proteine die Luciferase-Reporter-Gen-Konstrukte gemeinsam mit MEF2D in etwa additiver Weise. Dies konnte an verschiedenen Luciferase-Reporter-Genen (nur77-gesteuert, hFasL-gesteuert und desmin-gesteuert) nachgewiesen werden, was auf eine mögliche Kooperation der verschiedenen NFAT-Faktoren mit MEF2D (und evtl. auch anderen MEF2-Faktoren) nicht nur bei der Apoptose von T-Zellen sondern auch in anderen Zellen hinweist.
Bei T-Zell-Lymphomen sind im Gegensatz zu B-Zell-Lymphomen wenige spezifische genetische Aberrationen bekannt. In dieser Arbeit wurden 39 periphere T-Zell-Lymphome (30 PTCL NOS und 9 EATCL) mit der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung untersucht. Es wurde ein Screening auf Aberrationen vorgenommen, die zu einem Teil bei B-Zell-Lymphomen eine Rolle spielen, zum anderen bereits für T-Zell-Lymphome beschrieben wurden. Alle untersuchten EATCL wiesen Zugewinne in 9q34 auf. Diese waren signifikant häufiger bei EATCL als bei PTCL NOS. Diese Ergebnisse decken sich mit den CGH-Untersuchungen von Zettl et al.(2002,2004). Ein Vergleich mit Daten aus der Literatur zeigt, daß diese Zugewinne unter peripheren T-Zell-Lymphomen gegenwärtig als spezifisch für EATCL anzusehen sind. Dies ist die erste beschriebene spezifische Aberration bei EATCL. Das Philadelphiachromosom mit der Translokation t(9;22)(q34;q11), das bei der chronisch myeloischen Leukämie gefunden wird, wurde bei EATCL nicht nachgewiesen. Welches das relevante Gen in der Region 9q34 ist, ist noch nicht geklärt. Inwiefern Amplifikationen des NOTCH1-Gen für die Pathogenese der EATCL eine Rolle spielen, müssen weitere Untersuchungen zeigen. Bei PTCL NOS fand sich in 30% der Fälle eine Deletion im langen Arm von Chromosom 5. Dabei war in jedem Fall die Bande 5q21/22 betroffen. Es zeigte sich eine Tendenz zu häufigeren Deletionen von 81c5 als vom proximal gelegenen APC-Gen und in 5q31. Bei den diploiden Fällen war dieser Unterschied statistisch signifikant. Es ist somit anzunehmen, daß der Genlocus distal des APC-Gens und proximal von 5q31 in der Nähe von 81c5 liegt. Verluste in 5q21/22 sind bislang bei T-Zell-Lymphomen nur im Rahmen einer CGH-Studie für PTCL NOS beschrieben worden. Nach unseren Daten scheinen sie bei EATCL keine Rolle zu spielen. Deletionen in 6q21 und von TP53 spielen als sekundäre Aberrationen sowohl bei PTCL NOS als auch bei EATCL eine Rolle. Bei PTCL NOS waren sie signifikant häufiger bei den tetraploiden Fällen zu finden. So waren Deletionen von TP53 bei allen tetraploiden Fällen nachzuweisen. Ein Zusammenhang mit der Progression der Tumoren kann vermuten werden. Dieser Unterschied zwischen diploiden und tetraploiden Fällen fand sich bei EATCL nicht. Aberrationen von ATM, die bei B-Zell-Lymphomen beschrieben wurden, haben bei PTCL NOS und EATCL nach den vorliegenden Daten keine Bedeutung. Bezüglich Deletionen von ATM unterscheiden sich PTCL NOS und EATCL signifikant von T-PLL, bei denen Deletionen von ATM beschrieben wurden. Deletionen von D13S25 wurden zwar sowohl bei PTCL NOS als auch bei EATCL gefunden. Allerdings zeigt ein Vergleich mit der Literatur, dass die minimale überlappende Region der Deletionen eher distal in Bande 13q21 zu suchen ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals mit der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung spezifische Aberrationen bei PTCL NOS und EATCL beschrieben werden. Zudem konnten weitere Aberrationen nachgewiesen werden, die bei diesen Entitäten eine Rolle in der Pathogenese zu spielen scheinen. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um ihre Bedeutung in der Diagnostik und Therapie der Malignome zu klären.
Angeborene Immunität des Menschen : Kreuzreaktionen tumorspezifischer monoklonaler IgM-Antikörper
(2007)
Die von CD5-positiven B-Zellen produzierten natürlichen Antikörper sind humorale Bestandteile des angeborenen Immunsystems. Sie kommen im Körper bereits vor, ohne dass ein Antigen-Kontakt stattgefunden hat und dienen dazu, den Organismus schnell und effektiv vor eindringenden Pathogenen zu schützen, möglichst noch bevor die erworbene Immunabwehr aktiviert werden muss. Zudem werden körpereigene Moleküle erkannt, die normalerweise geschützt intrazellulär vorliegen und erst bei Zellnekrose freigesetzt und so dem Immunsystem zugänglich gemacht werden. Außerdem konnten mit Hilfe der humanen Hybridoma Technologie aus Krebspatienten und gesunden Probanden natürliche Antikörper isoliert werden, die transformierte Zellen erkennen und beseitigen. Die natürlichen Antikörper sind keimbahncodiert und erhöhen im Gegensatz zu Antikörpern der erworbenen Immunabwehr nicht ihre Variabilität durch Mutationsereignisse und Reifung. In früheren Studien wurde beobachtet, dass natürliche Antikörper nicht spezifisch ein Antigen binden, sondern dass bestimmte häufig vorkommende und in der Evolution konservierte Antigen-Muster erkannt werden. Daraus folgerte man, dass natürliche Antikörper ihre Antigene „unspezifisch“ binden, so dass sich eine Vielzahl von Kreuzreaktionen mit verschiedenen Antigenen ergibt. Derartige Kreuzreaktionen der natürlichen Antikörper wurden bereits 1986 beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war zu zeigen, dass es innerhalb der natürlichen Antikörper verschiedene Pools mit unterschiedlichen Aufgaben gibt und dass natürliche Antikörper nicht wahllos beliebige Antigene binden, sondern dass sich ihr Reaktionsmuster aus ihrer Aufgabe innerhalb des menschlichen Immunsystems ergibt. Es wurden anhand des ELISA-Verfahrens Kreuzreaktionen der natürlichen Antikörper mit humaner DNA, körpereigenen Zytoskelettproteinen (Actin, Myosin, Keratin, Desmin, Vimentin) und Molekülen untersucht, die die innate Immunabwehr über Toll-like-Rezeptoren aktivieren können (LPS, LTS, PGN, Flagellin, HSP 70, bakterielle DNA, H.pylori-CagA und -VacA). Es konnte gezeigt werden, dass den 17 untersuchten Antikörpern CM-1, CM-2, LM-1, M6, NORM-1, NORM-2, NORM-3, NORM-4, PAM-1, PM-1, PM-2, SAM-1, SAM-3, SAM-4, SAM-5, SAM-6, SC-1 hauptsächlich die Aufgabe zukommt, transformierte Zellen zu beseitigen. Ihre Reaktionsweise ist also nicht „unspezifisch“, sondern „oligospezifisch“ innerhalb ihres Aufgabenbereichs. Zudem fiel in früheren Studien eine deutliche Korrelation zwischen der Anzahl durchgemachter Mutationen und dem Reaktionsmuster der Antikörper mit Tumorzellen auf: keimbahncodierte Antikörper ohne Mutationen reagierten immer mit einem breiten Spektrum verschiedener Tumore oder sogar Vorläuferläsionen, wohingegen das Spektrum der Reaktionen mit steigender Zahl von Mutationen abnahm. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Antigen-Antikörper-Reaktionen konnte kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Reaktionsweise und dem genetischen Ursprung oder der Anzahl durchgemachter Mutationen hergestellt werden.
Diffuse großzellige B-Zell Lymphome (DLBCL) gehören zu den häufigsten lymphatischen Tumoren. Die histologische Klassifikation dieser großen Gruppe von Tumoren ist dabei noch immer durch die mangelnde Reproduzierbarkeit in der Diagnostik geprägt. Außerdem verhalten sich DLBCL klinisch ausgesprochen heterogen. In der vorliegenden Arbeit wurden DLBCL mittels komparativer genomischer Hybridisierung (CGH) untersucht. Die DLBCL waren im Vorfeld von uns unabhängig mittels microarray-basierter Genexpressionsanalyse in solche vom Keimzentrumstyp (GCB-DLBCL) sowie solche vom aktivierten B-Zelltyp (ABC-DLBCL) eingeteilt worden. Weiterhin enthielt das untersuchte Kollektiv primär mediastinale DLBCL (PMBCL). Die CGH sollte hierbei Aufschluss über rekurrente chromosomale Aberrationen geben. Die drei Subtypen zeigten dabei für sie charakteristische genetische Veränderungen. So fanden sich für die GCB-DLBCL Zugewinne auf Chromosom 12, für die ABC-DLBCL Zugewinne auf den Chromosomen 3 und 18 sowie Verluste auf Chromosom 6, für die PMBCL Zugewinne auf den Chromosomen 2 und 9. Die mittels Genexpressionsanalyse definierten Subtypen der DLBCL unterscheiden sich somit eindeutig auf genetischer Ebene und zeigen für sie charakteristische chromosomale Aberrationen.
Die vorliegende Arbeit hatte zur Aufgabe, die EBV-infizierte Zelle bei infektiöser Mononukleose, Hodgkin Lymphom, Post-Transplantations-Lymphoproliferation(PTLD) und seniler Lymphoproliferation zu beschreiben. Da die Einordnung der senilen Lymphoproliferation als eigenständige Entität unbefriedigend ist, sollte der Bezug zu PTLD oder Hodgkin Lymphom untersucht werden.Sowohl bezüglich des Latenztyps des EBV, der Oberflächenantigen- und Transkriptionsfaktorenexpression als auch der fehlenden Immunglobulinsekretion entsprachen sich Hodgkin Lymphom und senile Lymphoproliferation. Zwischen seniler Lymphoproliferation und PTLD dagegen fanden sich diesbezüglich große Unterschiede. Daher sind die senilen Lymphoproliferationen im Ergebnis dieser Doktorarbeit als Hodgkin Lymphome des höheren Alters anzusehen. Als Nebenbeobachtung stellten sich die hier untersuchten Hodgkin Zellen als CD27 negativ dar, die im Unterschied stehen, zur CD27 und CD30 positiven Memoryzelle, welche als korrespondierende Normalzelle postuliert wurde. Der Vergleich EBV-negativer und EBV-positiver Hodgkin Lymphome erbrachte in dieser Hinsicht jedoch keine Unterschiede. Die CD27-Negativität der Hodgkin Zelle ist somit nicht als EBV-spezifisches Phänomen zu verstehen und bedarf weiterer Klärung.
The Nuclear Factors of Activated T cells (NFATs) are critical transcription factors that direct gene expression in immune and non-immune cells. Interaction of T cells with Ag-presenting cells results in the clustering of T-cell antigen receptor (TCR), co-receptors and integrins. Subsequent signal transduction resulting in NFAT activation leads to cytokine gene expression. Among the NFATs expressed in T cells, NFATc1 shows a unique induction property, which is essential for T cell differentiation and activation. It was revealed before that 3 major isoforms of NFATc1 are generated in activated T cells – the inducible short NFATc1/A, and the longer isoforms NFATc1/B and C. However, due to alternative splicing events and the existence of two different promoters and two alternative polyadenylation, we show here that 6 isoforms are synthesized in T cells which differ in their N-terminal and C-terminal peptides. In these experiments, we have identified these 6 isoforms by semi-quantitative long distance RT-PCR in several T cells subsets, and the inducible properties of 6 isoforms were investigated in those cells. The short NFATc1/A which is under control of the P1 promoter and the proximal pA1 polyadenylation site was the most prominent and inducible isoform in T effector cells. The transcription of the longer NFATc1/B and C isoforms is constitutive and even reduced in activated T lymphocytes. In addition to NFATc1 autoregulation, we tried to understand the NFATc1 gene regulation under the control of PKC pathways by microarray analysis. Compared to treatment of T cells with ionomycin alone (which enhances Ca++ flux), treatment of cells with the phorbolester TPA (leading to PKC activation) enhanced the induction of NFATc1. Microarray analysis revealed that PKC activation increased the transcription of NF-B1, Fos and JunB, which are important transcription factors binding to the regulatory regions of the NFATc1 gene. Besides the promoting effect of these transcription factors, we provided evidence that p53 and its targeting gene, Gadd45, exerted a negative effect on NFATc1 gene transcription. Summarizing all these results, we drew novel conclusions on NFATc1 expression, which provide a more detailed view on the regulatory mechanisms of NFATc1 transcription. Considering the high transcription and strong expression of NFATc1 in various human lymphomas, we propose that similar to NF-B, NFATc1/A plays a pivotal role in lymphomagenesis.
Risikostratifikation grosszelliger B-Zell Non-Hodgkin Lymphome anhand immunhistochemischer Parameter
(2007)
Die diffusen großzelligen B-Zell-Lymphome (DLBCL) stellen den häufigsten Typ aller Non-Hodgkin-Lymphome dar, sind aber morphologisch, immunologisch, genetisch und klinisch eine sehr heterogene Gruppe. Aufgrund dieser Heterogenität von DLBCL wurde in mehreren Studien untersucht, ob eine molekulare Heterogenität der Tumoren vorläge, bzw. versucht, eine molekulare Reklassifikation zu erreichen. Resultat dieser Bemühungen war eine Unterscheidung bzw. Definition einer Keimzentrums- ähnlichen (GCB-cell-like) Gruppe und einer aktivierten B-Zellen-ähnlichen (ABC-like) Gruppe, die sich in ihrem Ansprechen auf übliche Therapieschemata, mit einer deutlich besseren Prognose für die GCB-like-Gruppe, unterschieden. Die hierbei angewendete Microarray-Technologie hat den entscheidenden Nachteil, dass hierfür qualitativ hochwertige RNA zur Verfügung stehen muss. Neu ist der Ansatz, unterschiedliche Proteinexpressionsmuster am Paraffinmaterial zur Unterscheidung prognostisch relevanter Gruppen heranzuziehen. Die hierbei erzielten Daten sind allerdings in Ihren Aussagen hinsichtlich der prognostischen Wertigkeiten widersprüchlich. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst verschiedene biologische Parameter am Paraffinmaterial hinsichtlich ihrer prognostischen Wertigkeit in der Risikostratifikation von DLBCL untersucht. In einem ersten Schritt wurden klinische Daten von 99 de novo entstandenen großzelligen B-Zell-Lymphomen erhoben, bei denen es sich um 84 DLBCL und um elf DLBCL mit einer weiteren Komponente eines follikulären Lymphoms Grad 3B bzw. auch um vier Fälle mit ausschließlich follikulärem Wachstumsmuster handelte. Die Klassifikation der Fälle nach dem Internationalen Prognostischen Index (IPI) sowie der einzelnen klinischen Parameter des IPI zeigte eine deutliche prognostische Relevanz. In einem zweiten Schritt wurden immunhistochemische Färbungen mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt und auf ihre prognostische Bedeutung überprüft. Als negative prognostische Parameter erwiesen sich die Negativität für CD10 sowie BCL-6, also Antigene, die mit einer Keimzentrumszell-Differenzierung assoziiert werden, sowie eine Überexpression von MUM-1, das mit einer postfollikulären Differenzierung assoziiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass einer Expression von BCL-2 und einem Ki67-Index von unter 80 % eine negative prognostische Bedeutung zukommt. Die Stratifikation der Fälle in einen GCB- und einen ABC- Typ anhand des Hans-Klassifikators zeigte nur eine schwache Korrelation zur Überlebenswahrscheinlichkeit. In einem dritten Schritt wurde gezeigt, dass die kombinierte Analyse jeweils zweier Parameter eine relative Abhängigkeit ihrer Expression von der Expression weiterer Marker erkennen ließ. Aus diesem Grunde wurde ein Modell einer sequentiellen Addition negativer prognostischer Indikatoren entwickelt, in der bei Anwesenheit einer negativen Variable (CD10-Negativität, BCL-6 < 20%, BCL-2 positiv, MUM-1≥ 50% und Ki67 < 80%) ein negativer Faktor gewertet und die Summe dieser als Risiko-Score angegeben wurde. Die Stratifikation der Patienten anhand dieses „kombinierten immunhistochemischen Risiko-Scores“ zeigte drei prognostisch deutlich unterschiedliche Gruppen: In der Gruppe von Patienten ohne Risikofaktoren verstarb lediglich eine Patientin (die eine Behandlung abgelehnt hatte); in der Hochrisikogruppe (Score 5) verstarben alle Patienten innerhalb eines Jahres. Die multivariate Analyse des Scores ergab dabei eine Unabhängigkeit von den Parametern des IPI. In der intermediären Gruppe mit einem Risiko-Score von 1-4 zeigten sich der IPI sowie eine LDH-Erhöhung und das Vorhandensein einer B-Symptomatik als geeignete Parameter, um hier eine weitere Stratifizierung durchzuführen. Die vorliegende Arbeit stellt somit eine Erweiterung der publizierten Ansätze einer Erfassung prognostischer Indikatoren in kombinierten Algorithmen dar. Eine Verifizierung der gezeigten Ergebnisse in einer homogen behandelten Patientengruppe innerhalb einer klinischen Studie muss Ziel weiterer Untersuchungen sein.
In der vorliegenden Arbeit wurden Lymphoproliferationen und maligne Non-Hodgkin-Lymphome der B-Zellreihe, die eine Infektion der Tumorzellen mit dem Epstein-Barr Virus aufwiesen, hinsichtlich ihres Immunphänotyps und ihrer zytogenetischen Aberrationen durch Fluoreszenz in-situ Hybridisierung charakterisiert. Von besonderer Bedeutung war es, durch eine detaillierte Analyse der klinischen Daten Vorerkrankungen/Zweiterkrankungen mit einer möglichen Immunsuppression zu identifizieren. Die erhaltenen Daten wurden mit denen EBV-negativer diffuser grosszelliger B-Zell Lymphome verglichen. In der Gewebe-Array-Technik konnten letztlich 69 Fälle detailliert charakterisiert werden. Von 53/69 (77%) dieser Lymphoproliferationen, die sämtlich eine EBV-Assoziation aufwiesen, konnten klinische Daten erhalten werden. Die detaillierte Analyse dieser Daten zeigte, dass in der grossen Mehrzahl der Fälle eine für eine EBV-Infektion prädisponierende Vor- bzw. Grunderkrankung vorlag (44/69 Fälle, 64%). Dabei handelte es sich in 9 Fällen um eine HIV-Infektion, in 12 Fällen um eine Post-Transplantations lymphoproliferative Erkrankung, in 19 Fällen um einen Zustand nach vorangegangener, therapierter Lymphomerkrankung und in vier Fällen um einen Zustand bei Methotrexatbehandlung oder vergleichbarer medikamentöser Immunsuppression. In neun Fällen war nachweislich keine zu einer möglichen Immunsuppression führende Grunderkrankung eruierbar; diese Tumoren, die bei Patienten mit einem Durchschnittsalter von 72,7 Jahren auftraten, entsprechen wahrscheinlich den in der Literatur beschriebenen „senilen“ EBV-assoziierten Lymphoproliferationen, bei denen eine durch das fortgeschrittenen Lebensalter bedingt reduzierte Fähigkeit des Immunsystems zu einer adäquaten Viruskontrolle diskutiert wird. Klinische Angaben, die auf eine mögliche Immunsuppression und damit auf eine mögliche EBV-Assoziation hindeuten, lagen zum Zeitpunkt der Vorstellung des Falles im Referenzzentrum bemerkenswerterweise nur in 26/69 Fällen (38%) vor.EBV-assoziierte Lymphoproliferationen und Lymphome gehören signifikant häufiger dem (immunhistochemisch definierten) non-GCB-Subtyp als dem GCB-Subtyp der DLBCL an (73% versus 37%; p<0,0001). Hier lag ein zusätzlicher interessanter Aspekt vor: EBV-assoziierte Lymphoproliferationen, die aufgrund ihrer Reaktivität der Tumorzellen für CD10 dem GCB-Typ zugeordnet worden waren, exprimierten nur in einer Minderzahl der Fälle (1 von 12; 8%) gleichzeitig auch BCL-6, ein Befund, der bei sporadischen, EBV-negativen DLBCL nur äußerst selten zu finden war (1 von 50; 2%). Weitere immunhistochemische Unterschiede zwischen EBV-assoziierten und EBV-negativen DLBCL lagen für die Expression des Aktivierungsmarkers CD30, der bei EBV-negativen DLBCL eher selten exprimiert wird, aber bei EBV-positiven DLBCL/-Lymphoproliferationen signifikant häufiger positiv ist, und auch für CD138 vor. Auch dieser Marker einer plasmazellulären Differenzierung war bei EBV-positiven DLBCL häufiger exprimiert, wohingegen die Expression von BCL-2 und BCL-6 in den Tumorzellen EBV-assoziierter LPD seltener war. Der häufigere non-GCB-Status, die vermehrte Expression von CD138 und die geringere Reaktivität für BCL-6 legen nahe, dass EBV-assoziierte DLBCL/Lymphoproliferationen offensichtlich aus B-Zellen bestehen oder hervorgegangen sind, die die Keimzentrumsreaktion bereits durchlaufen hatten. Die Analyse der interphasenzytogenetischen Daten und ihr Vergleich zu klassischen zytogenetischen Daten einer Kontrollgruppe von sporadischen DLBCL zeigte, dass chromosomale Bruchereignisse und auch eine TP53 Mutation (ausgewiesen durch die immunhistochemisch nachgewiesene Überexpression des Gens) nur bei denjenigen Fällen auftrat, die konventionell-morphologisch als DLBCL charakterisiert worden waren. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde eine signifikant häufigere Rearrangierung von CMYC in EBV-assoziierten DLBCL gefunden; im Gegensatz hierzu waren Bruchereignisse im BCL2- und im BCL6-Locus ohne signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe. Als „Nebenbefund“ konnte in dieser Studie eine Infektion eines – offenbar primär nodalen – DLBCL vom immunoblastisch-plasmoblastischen Subtyp bei einem HIV-positiven Patienten durch das humane Herpesvirus 8 (HHV8) nachgewiesen werden. Diese Konstellation stellt insofern eine Rarität dar, da HHV8-positive DLBCL zumeist extranodal, z.B. in Form des sogenannten „Primären Effusions-Lymphoms“ (PEL) oder in Assoziation zu einer multizentrischen Castleman-Erkrankung bei HIV-positiven Patienten auftreten.
Sumoylation of transcription factors modulate their activity (either upregulating or downregulating) by altering protein-protein interactions as well as subcelluar/subnuclear localization. The transcription factor family of NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) plays an important role in cytokine gene regulation in T cells. Due to alternative usage of two promoters (P1 & P2), two polyadenylation sites (pA1 and pA2) and alternative splicing events, NFATc1 is expressed in six isoforms which are NFATc1/alphaA, betaA, alphaB, betaB, alphaC and betaC, where alpha and beta refer to two different 1st exons and A, B, C to the differentially spliced and extended C-termini. The short isoforms of NFATc1 (NF-ATc1/A) contain a relatively short C terminus whereas, the longer isoforms, B and C, span the extra C-terminal peptides of 128 and 246 aa, respectively. To analyze the specific biological effects of NFATc1 isoform, a yeast two hybrid screening of a human spleen cDNA library with extra C-terminal peptide of NFATc1 as a bait, was performed. At the end of the assay, the proteins involved in the sumoylation pathway such as Ubc9, PIAS1 were detected with highest frequencies and subsequently were were able to demonstrate that NFATc1 is sumoylated. The extent of sumoylation is isoform specific. While NFATc1/A, harboring only one sumoylation site, shows very weak sumoylation, the two additional sites within NFATc1/C lead to efficient sumoylation. This modification directs NFATc1/C into SUMO-1 bodies, which in turn colocalize with PML-nbs. Furthermore, sumoylated NFATc1/C recruits the transcriptional co-repressors HDAC (both class I as well as class II HDACs) which results in a significant decrease of the level of histone acetylation on the IL-2 promoter, an important NFATc1 target gene. As a consequence of this, a decrease of IL-2 production was observed, while NFATc1/C, which can no longer be sumoylated due to mutating the target lysines, exhibited dramatic elevated transcriptional potential on the IL2 promoter. This supports our finding from IL-2 promoter-driven reporter gene assay, which shows downregulation of NFATc1/C transactivation upon sumoylation. Hence, sumoylation exerts a negative effect on NFATc1 transcriptioanl activity. Immunofluorescence studies showed SUMO modification to relocate NFATc1/C also into transcriptionally inactive heterochromatin regions, demonstrated by H3K9 m3 (tri-methylated histone lysine 9) colocalization studies. Interestingly, in the absence of sumoylation, NFATc1 was partially colocalized with transcriptional hotspots in the nucleus, which might contribute to the higher transcription potentiality of the non-sumoylated NFATc1. It is important to note that, the transcriptional activity of other NFATc1 target genes (IL-13, IFN-gamma etc.) was positively upregulated upon sumoylation of NFATc1, suggesting a non-universal effect of sumoylation on NFATc1/C function. In conclusion, sumoylation directs NFATc1 into nuclear bodies where it interacts with transcriptional co-repressors and relocalize itself with heterochromatin, leading to repression of NFATc1/C-mediated transcription. Most importantly, the effect of NFATc1/C sumoylation is promoter specific. Taken together, SUMO modification alters the function of NFATc1 from an activator to a site-specific transcriptional repressor. This study unraveled a novel regulatory mechanism, which controls isoform specific NFATc1 function.