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Übergewicht, das als Volkskrankheit ein wachsendes globales Problem darstellt, ist mit mehreren folgenreichen Komorbiditäten behaftet und die Assoziation der Erkrankung mit nachweisbarer Schädigung des Erbguts durch oxidativen Stress ist mittlerweile unangefochten. In der vorliegenden Studie wurden periphere Lymphozyten stark bis morbid adipöser Patienten mit Hilfe des Mikrokern-Assays untersucht und es konnte – begleitend zu der zu erwartenden BMI-Abnahme – eine signifikante Reduktion des Genomschadens durch Magenbypass bzw. Sleeve-Gastrektomie 12 Monate postoperativ detektiert werden. Daneben demonstrierte die Analyse zusätzlich erhobener Patientendaten, die u. a. Nüchternglucose, HbA1c, Blutdruck und Herzfrequenz sowie ein Blutbild der Patienten (inklusive CRP als Entzündungsmarker, Transaminasen, gGT sowie Lipidprofil) umfasste, eine deutliche Besserung vieler Parameter bis auf teilweise wieder physiologische Normwerte. All diese Ergebnisse stützen die These der metabolischen Wirksamkeit sowohl des Roux-en-Y-Magenbypass als auch der Sleeve- Gastrektomie. Ihre Bedeutung liegt nicht zuletzt in der angenommenen Reduktion des Krebserkrankungsrisikos, da jeweils ein Zusammenhang mit der Adipositas an sich, dem Diabetes und durch oxidativen Stress verursachter DNA-Schädigung besteht. Mit Blick auf eine gegenwärtig in der Forschung diskutierte potentielle therapeutische Anwendung von Antioxidantien zur Reduktion von Erbgutschädigungen, die durch oxidativen Stress zustande kommen, wurden die Substanzen Tricetinidin, Curcumin und Resveratrol im Rahmen des Mikrokerntests an HL60- und NRK-Zellen untersucht, in denen mit der Mischung aus Insulin und Angiotensin II eine gentoxische Wirkung erzielt worden war.
G protein coupled receptor kinases (GRK) phosphorylate and thereby desensitize G protein coupled receptors (GPCR) including β-adrenergic receptors (βAR), which are critical regulators of cardiac function. We identified the Raf kinase inhibitor protein (RKIP) as an endogenous inhibitor of GRK2 that leads to increased cardiac contractility via βAR activation. RKIP binds to the N-terminus (aa1-185) of GRK2, which is important for the GRK2/receptor interaction. Thereby it interferes with the GRK2/receptor interaction without interference with cytosolic GRK2 target activation. In this project, the RKIP/GRK interface was investigated to develop strategies that simulate the effects of RKIP on βAR.
RKIP binding to different isoforms of GRK expressed in the heart was analyzed by protein interaction assays using full-length and N-termini of GRK2, GRK3 and GRK5: 1-53, 54-185 and 1-185. Co-immunoprecipitation (Co-IPs) and pull-down assays revealed that RKIP binds to the peptides of GRK2 and GRK3 but not to the ones of GRK5, which suggests the existence of several binding sites of RKIP within the N-termini of GRK2 and GRK3. To analyze whether the peptides of GRK2 and GRK3 are able to simulate the RKIP mediated interference of the GRK2/receptor interaction, we analyzed the β2-AR phosphorylation in the absence and presence of the peptides. Interestingly, N-termini (aa1-185) of GRK2 and GRK3 reduced β2AR phosphorylation to a comparable extent as RKIP. In line with reduced receptor phosphorylation, the peptides also reduced isoproterenol-stimulated receptor internalization as shown by [3H] CGP-12177 radioligand binding assay and fluorescence microscopy compared to control cells. Subsequently, these peptides increased downstream signaling of β2AR, i.e. the phosphorylation of the PKA substrate phosducin. In an attempt to elucidate the mechanism behind the observed effects, Co-IPs were performed in order to investigate whether the peptides bind directly to the β2-AR and block its phosphorylation by GRK2. Indeed, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 could bind the receptor, suggesting that this way GRK2 is prevented from inhibiting the receptor. To investigate the physiological effect of GRK2 1-185, GRK3 1-185 and GRK5 1-185, their effect on neonatal mouse cardiomyocyte contractility and hypertrophy was analyzed. After long-term isoproterenol stimulation, in the presence of GRK2 1 185 and GRK3 1-185 the cross-sectional area of the cardiomyocytes showed no significant increase in comparison to the unstimulated control cells. In addition, upon isoproterenol stimulation, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 increased the beat rate in cardiomyocytes, mimicking RKIP while the base impedance, an indicator of viability, remained stable.
The N-termini (1-185) of GRK2 and GRK3 simulated RKIP’s function and had a significant influence on β2AR phosphorylation, on its downstream signaling and internalization, could bind β2-AR, increased beat rate and did not significantly induce hypertrophy, suggesting that they may serve as a model for the generation of new and more specific targeting strategies for GRK mediated receptor regulation.
In den letzten Jahrzehnten ist die Akzeptanz stetig größer geworden, dass oxidativer Stress eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von chronischen Erkrankungen, malignen Neoplasien sowie der Beschleunigung des Alterungsprozesses spielt. Als eine der häufigsten chronischen Erkrankungen ist Hypertonie oft mit einem fehlregulierten Renin-Angiotensin-Aldosteron-System assoziiert, welches chronisch oxidativen Stress verursacht. Bluthochdruck ist ein Risikofaktor für neurologische Erkrankungen wie der vaskulären Demenz (VaD) und viele neurologischen Störungen, einschließlich der VaD, haben eine ROS-assoziierte beziehungsweise inflammatorische Komponente in ihrer Entstehung.
Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits eine AT-II-induzierte Genotoxizität in Nieren- und Myokardzellen bzw. -Gewebe nachweisen. Ziel dieser Dissertation war es, einen möglichen Zusammenhang zwischen AT-II und Neurodegeneration zu untersuchen, welche durch eine neuronale Genotoxizität von AT-II ausgelöst wird.
Zunächst zeigten wir in zwei neuronalen Zelllinien, dass AT-II eine Dosis-abhängige Genomschädigung verursacht. Nachfolgende Experimente konnten diese Toxizität auf NOX-produziertes Superoxid zurückführen, das nach Bindung von AT-II an den AT1R generiert wird. Zudem konnte ein AT-II-induzierter Verbrauch des wichtigsten intrazellulären Antioxidans – Glutathion - nachgewiesen werden.
In vivo konnten wir zeigen, dass AT1aR-Knockout-Mäuse nach AT-II-Behandlung signifikant mehr Genomschäden im Subfornikalorgan (SFO) aufwiesen als Wildtypmäuse. Das SFO hat als eine der wenigen Strukturen im Gehirn eine unterbrochene Blut-Hirn-Schranke, was es für zirkulierendes AT-II zugänglich und besonders empfindlich macht. Diese Genomschäden wurden in der neueren Literatur auch in Nieren- und Herzgewebe beschrieben und belegen eine zusätzliche, AT1aR- und damit Blutdruck-unabhängige Genotoxizität von AT-II.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass erhöhte AT-II-Konzentrationen in Nervenzellen Genomschäden durch NOX-produziertes Superoxid verursachen. Die Hoffnung ist, dass diese Ergebnisse dabei helfen, eines Tages die vollständige Entstehung der VaD zu entschlüsseln.
Durch Phosphorylierung inaktiviert GRK2 kardiale ß-Adrenorezeptoren und vermindert dadurch die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten. Als natürlicher Inhibitor der GRK2 beeinflusst RKIP die Signalweiterleitung bei Stimulation von ß-Adrenorezeptoren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von RKIP die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten erhöht. Es wurde die Anzahl auftretender Spontankontraktionen vor und nach Stimulation mit Isoproterenol erfasst sowie eine zeitliche Analyse der Calciumfreisetzung und –aufnahme nach elektrischer Stimulation durchgeführt. Im unstimulierten Zustand zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, die Wildtyp-RKIP überexprimierten, verglichen mit der Kontrollgruppe, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich auftretender Spontankontraktionen. Nach Stimulation mit Isoproterenol zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, in denen Wildtyp-RKIP überexprimiert wurde, eine signifikant höhere Anzahl auftretender Spontankontraktionen. Eine Analyse der Calciumtransienten zeigte bei RKIP-Wildtyp überexprimierenden neonatalen Rattenkardiomyozyten eine erhöhte Calciumfreisetzung während der Systole sowie eine beschleunigte Calciumwiederaufnahme während der Diastole. Zudem wurden die RKIP-Mutanten RKIPS51V und RKIPS52V im Hinblick auf ihre Kontraktilität untersucht. Neonatale Rattenkardiomyozyten welche RKIPS51V und RKIPS52V überexprimierten zeigten weder im Hinblick auf auftretende Spontankontraktionen noch bei der Analyse der Calciumtransienten signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe. Da auch eine Phosphorylierung an Aminosäureposition 51 bzw. Aminosäureposition 52 ohne direkte Auswirkung auf die Kontraktilität möglich ist, wurde in einem in vitro Kinase Assay analysiert, ob neben der bekannten Phosphorylierungsstelle S153 eine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKA oder PKC erfolgt. Bei Einsatz der an Aminosäureposition 153 phosphorylierungsdefizienten RKIP Mutante RKIPS153A konnte keine Phosphorylierung beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte neben einer Phosphorylierung an S153 keine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKC oder PKA beobachtet werden.
Die Raf-MEK-ERK1/2-Kaskade spielt eine wichtige Rolle in der Vermittlung von kardialer Hypertrophie und Zellüberleben. Durch unsere Arbeitsgruppe konnte im Vorfeld gezeigt werden, dass die Dimerisierung von ERK2 eine Voraussetzung für dessen Autophosphorylierung an Thr188 darstellt, welche wiederum für die Übermittlung der hypertrophen Effekten von ERK1/2 erforderlich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daraus abgeleitet die Fragestellung untersucht, ob mit Verhinderung der ERK2-Dimerisierung eine nützliche Strategie zur Inhibition von Hypertrophie vorliegt und welchen Einfluss diese auf das Zellüberleben hat.
Die Auswirkungen der Dimerisierungsdefizienz von ERK2 wurden in neonatalen Kardiomyozyten der Ratte und in transgenen Mäusen mithilfe einer ERK2-Mutante untersucht, der einige Aminosäuren in der ERK-ERK-Interaktionsfläche fehlen und daher keine Dimere bilden kann (ERK2Δ174-177). Eine Überexpression von ERK2Δ174-177 in neonatalen Kardiomyozyten verringerte signifikant die Antwort auf hypertrophe Stimuli (Phenylephrin, Endothelin 1). Im Anschluss daran wurden die Effekte der Dimerisierungsdefizienz von ERK2 in vivo an transgenen Mäusen mit kardialer Überexpression von ERK2Δ174-177 erforscht. Diese Mäuse zeigten unter basalen Bedingungen keine Unterschiede gegenüber Wildtyp-Mäusen hinsichtlich Kardiomyozytengröße, Ventrikelwanddicke und kardialer Funktion. Unter chronischer Druckbelastung mittels TAC ließ sich hingegen ein signifikant vermindertes Ausmaß an Hypertrophie im Vergleich zu Wildtyp quantifizieren. Da der ERK1/2-Signalweg auch am Überleben von Kardiomyozyten beteiligt ist, wurde die Apoptose an histologischen Schnitten von Mausherzen analysiert. Interessanterweise fand sich bei Herzen, die das dimerisierungsdefiziente ERK2-Protein überexprimierten, eine mit Wildtyp vergleichbare Anzahl TUNEL-positiver Zellen. Ein ähnliches Ergebnis konnte bei der Messung des Fibrosegrades an Sirius-Rot gefärbten histologischen Schnitten beobachtet werden. Zuletzt wurden die Folgen der ERK2-Dimerisierungsdefizienz auf physiologische Hypertrophie mit einem Laufrad-Versuchsaufbau evaluiert. Transgene ERK2Δ174-177- und Wildtyp-Mäuse zeigten unter diesem physiologischen Stimulus keine Unterschiede im Hinblick auf die Zunahme an kardialer Hypertrophie.
Da die Dimerisierungsdefizienz von ERK2 zu einer reduzierten pathologischen Hypertrophie, ohne negative Auswirkungen auf ERK1/2-vermittelte anti-apoptotische Effekte noch auf kardiale Funktion oder physiologische Hypertrophieprozesse führt, stellt die Hemmung der ERK-Dimerisierung ein attraktives Ziel zur Therapie pathologischer Hypertrophie sowie potentiell auch anderer auf den ERK1/2-Signalweg basierenden Krankheiten dar.
Bei vielen Erkrankungen wie z.B. Herzhypertrophie, Diabetes und Entzündungen spielt die Raf-MEK-ERK-Signalkaskade eine wichtige Rolle. ERK1/2 ist in vielen zellulären Prozessen, u.a. Proliferation, Differenzierung, Wachstum, Hypertrophie und Apoptose involviert. Auch in der Tumorentstehung besitzt dieser MAPK-Signalweg eine signifikante Funktion, da er bei ca. 50% aller Krebsarten deutlich aktiviert ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle einer neu entdeckten Phosphorylierungsstelle an Threonin188 an ERK2 bei der Entstehung und der möglichen Therapie von Tumoren zu erarbeiten. Dafür wurde ein Myc-ERK2309-357-Peptid verwendet, das 2013 in der Arbeitsgruppe Lorenz entwickelt wurde. Myc-ERK2309-357 zeigte in bisher unveröffentlichten Versuchen, dass es direkt an ERK2 bindet, eine Dimerisierung von ERK1/2 hemmen und eine vermehrte Lokalisation von ERK2 im Zellkern verhindern kann. Im Rahmen dieses Projekts konnten wir belegen, dass mit Hilfe des Myc-ERK2309-357-Peptids die Tumorzellproliferation von verschiedenen Krebszelllinien (Caco-2, SCC68, PC/1-1 und PC/13-1) um 60-80% vermindert werden konnte. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Myc-ERK2309-357 keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK1/2 am TEY-Motiv besitzt. Die Aktivierung von ERK1/2 durch die Kinasen MEK1/2 wird somit nicht beeinflusst und die zytosolischen ERK-Funktionen, wie z.B. der anti-apoptotische Effekt, würden somit bestehen bleiben. Außerdem fanden wir heraus, dass Myc-ERK2309-357 im Vergleich zu den MEK-Inhibitoren U0126 und PD98059 und verglichen mit dem EGF-Rezeptor-Antikörper Cetuximab die Proliferation signifikant besser hemmt.
The CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) and the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3) are seven transmembrane receptors that are involved in numerous pathologies, including several types of cancers. Both receptors bind the same chemokine, CXCL12, leading to significantly different outcomes. While CXCR4 activation generally leads to canonical GPCR signaling, involving Gi proteins and β‐arrestins, ACKR3, which is predominantly found in intracellular vesicles, has been shown to signal via β‐arrestin‐dependent signaling pathways. Understanding the dynamics and kinetics of their activation in response to their ligands is of importance to understand how signaling proceeds via these two receptors.
In this thesis, different Förster resonance energy transfer (FRET)‐based approaches have been combined to individually investigate the early events of their signaling cascades. In order to investigate receptor activation, intramolecular FRET sensors for CXCR4 and ACKR3 were developed by using the pair of fluorophores cyan fluorescence protein and fluorescence arsenical hairpin binder. The sensors, which exhibited similar functional properties to their wild‐type counterparts, allowed to monitor their ligand-induced conformational changes and represent the first RET‐based receptor sensors in the field of chemokine receptors. Additional FRET‐based settings were also established to investigate the coupling of receptors with G proteins, rearrangements within dimers, as well as G protein activation. On one hand, CXCR4 showed a complex activation mechanism in response to CXCL12 that involved rearrangements in the transmembrane domain of the receptor followed by rearrangements between the receptor and the G protein as well as rearrangements between CXCR4 protomers, suggesting a role of homodimers in the activation course of this receptor. This was followed by a prolonged activation of Gi proteins, but not Gq activation, via the axis CXCL12/CXCR4. In contrast, the structural rearrangements at each step of the signaling cascade in response to macrophage migration inhibitory factor (MIF) were dynamically and kinetically different and no Gi protein activation via this axis was detected. These findings suggest distinct mechanisms of action of CXCL12 and MIF on CXCR4 and provide evidence for a new type of sequential signaling events of a GPCR. Importantly, evidence in this work revealed that CXCR4 exhibits some degree of constitutive activity, a potentially important feature for drug development. On the other hand, by cotransfecting the ACKR3 sensor with K44A dynamin, it was possible to increase its presence in the plasma membrane and measure the ligand‐induced activation of this receptor. Different kinetics of ACKR3 activation were observed in response to CXCL12 and three other agonists by means of using the receptor sensor developed in this thesis, showing that it is a valuable tool to study the activation of this atypical receptor and pharmacologically characterize ligands. No CXCL12‐induced G protein activation via ACKR3 was observed even when the receptor was re-localized to the plasma membrane by means of using the mutant dynamin. Altogether, this thesis work provides the temporal resolution of signaling patterns of two chemokine receptors for the first time as well as valuable tools that can be applied to characterize their activation in response to pharmacologically relevant ligands.
Recently, it was shown that MDA-MB-231 breast cancer cells express very high levels of the A2BAR as the sole adenosine receptor subtype, and stimulation of the A2BAR in MDA-MB-231 cells triggers an unusual inhibitory signal on ERK1/2 phosphorylation. The ERK1/2 pathway is reported to be associated with the control of growth, proliferation and differentiation of cells and as such might serve as a promising target for tumor treatment. The present study investigated signaling mechanisms involved in linking A2BAR to ERK1/2 phosphorylation in MDA-MB-231 cells. The A2BAR mediated reduction of ERK1/2 phosphorylation and of proliferation of MDA-MB-231 cell is in good agreement with previous results from (Dubey et al., 2005). These observations provide support to the hypothesis that activation of A2BAR could attenuate the growth of some types of cancer cell and argue against a stimulation of proliferation resulting from the activation of A2BAR as discussed by (Fernandez-Gallardo et al., 2016). AC activation by forskolin has recently been shown to enhance the activity of the chemotherapeutic agent doxorubicin in TNBC cells via a mechanism dependent on the PKA-mediated inhibition of ERK1/2 phosphorylation. Furthermore, forskolin also increased the sensitivity of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 triple negative breast cancer cells to 5-fluorouracil and taxol (Illiano et al., 2018), and sustains the evidence of anticancer activity mediated by cAMP/PKA-mediated ERK1/2 inhibition. Similar to these studies, a reduced amount of pERK1/2 was also observed after stimulation of AC with FSK, application of cAMP-AM or inhibition of PDE-4. The inhibition of ERK1/2 phosphorylation was mimicked by UTP and abolished with the PLC inhibitor U73122 or by chelating intracellular Ca2+ with BAPTA-AM. These results point to an important role for both cAMP and Ca2+ signaling in the pathway leading to a decrease in ERK1/2 phosphorylation. This study encourages the idea that A2BAR could be used as target in cancer therapy. But A2BAR did not only stimulate signaling cascades associated with cell survival and proliferation reduction, but also key phases relevant in angiogenesis like Ca2+ mobilization (Kohn et al., 1995). Whereas the potency toward AC and Ca2+ are similar for the diverse agonists, the potency to promote ERK1/2 reduction is much higher. Interestingly, the proliferation of MDA-MB-231 cells is inhibited by low nanomolar agonist concentration which is inactive in Ca2+ mobilization. This means that it is certainly possible to reduce the proliferation without promoting angiogenesis. LUF6210 is particularly interesting when considering that it preferentially stimulates a reduction in ERK1/2 phosphorylation over Ca2+ and therefore may not promote angiogenesis. LUF6210 is therapeutically appealing as adjuvant in treatment of cancer. Given that stimulation of AC can activate a reduction of ERK1/2 phosphorylation and proliferation in cancer cells, agonist bias toward Gs-AC-PKA-mediated ERK1/2 inhibition represent a potential therapy of various malignancies. The fact that the reduction of ERK1/2 phosphorylation followed by reduced proliferation observed in MDA-MB-231 cells were mediated by the activation of the A2BAR illustrates the importance of this receptor subtype in cancer. A2BARs must be considered as a key factor in cancer treatment and deserve attention for the development of new therapeutic strategies.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Mikrokernbildung in Mundschleimhautzellen von 35 Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren während einer sechswöchigen Radio-/Radiochemotherapie und sechs Wochen danach darzustellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren im Vergleich zu gesunden Probanden erhöhte Mikrokernraten aufwiesen. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass es zu einer vermehrten Bildung von Mikrokernen während einer sechswöchigen Radio-/Radiochemotherapie kam. Nach Therapiebeendigung sanken die Werte nach drei bis sechs Wochen und lagen unter dem Ausgangswert, in dem Bereich von spontan entstehenden Mikrokernen. In Bezug auf die Tumorgröße konnte nur in der zweiten Woche ein signifikanter Unterschied in der Mikrokernrate zwischen T1- und T4-Stadium beobachtet werden. Es konnte keine Korrelation zwischen einer zusätzlich verabreichten Chemotherapie, Grading des Tumors, Alter sowie Geschlecht der Patienten und einem Anstieg der Mikrokernrate festgestellt werden.
Die Phosphatase PDXP (auch bekannt als Chronophin) gehört zur Familie der HAD Phosphatasen, einer ubiquitär exprimierten Enzymklasse mit wichtigen physiologischen Funktionen. PDXP zeigt Phosphatase-Aktivität gegenüber seinem Substrat Pyridoxal 5´-Phosphat (PLP), der aktivierten Form von Vitamin B6. PDXP-defiziente Mäuse (Knockout-Mäuse) weisen im Vergleich zu Wildtypen verdoppelte PLP-Konzentrationen in Erythrozyten sowie im Gesamthirn auf. Vermutlich kommt PDXP daher eine wichtige Funktion in Erythrozyten und im Hirn zu. Ziel dieser Arbeit war es, erste Einblicke in diese Funktion(en) von PDXP zu erlangen.
Hierzu wurden HPLC-basierte Analysen der erythrozytären PLP-Konzentrationen in Wildtyp- sowie PDXP-defizienten Mäusen durchgeführt. Dabei ließen sich die rund doppelt so hohen erythrozytären PLP-Level in den KO-Mäusen bestätigen. Zudem ist es gelungen, eine Methode zur Messung der endogenen Phosphatase-Aktivität von PDXP in Erythrozytenlysaten zu etablieren. So konnte im Wildtyp anhand der Verringerung der PLP-Konzentrationen pro Zeiteinheit eine erythrozytäre PDXP-Aktivität nachgewiesen werden. Dazu waren die Inkubation mit Pyridoxin, sowie die Anwendung eines Inhibitors der PDXK notwendig. Eine bis dato vermutete Funktion der PDXP, zur Mobilisation von erythrozytärem PLP während Fastenzeiten, konnte ausgeschlossen werden. So zeigte der Vergleich der erythrozytären PLP-Konzentrationen aus gefasteten mit normal gefütterten Tieren in beiden Genotypen exakt dieselbe prozentuale PLP-Verringerung. Während Nahrungszufuhr ließ sich jedoch eine Funktion der Phosphatase PDXP als „Converter“ von Pyridoxin zu Pyridoxal erkennen. Ausgehend von PN konnte im Wildtyp (über die Zwischenprodukte PNP und PLP) eine PDXP-abhängige Dephosphorylierung von PLP zu PL erfolgen. So wies der Wildtyp eine rund vierfach höhere PL-Produktion auf, verglichen mit der PDXP-defizienten Maus. Die Phosphatase PDXP erwies sich als essenziell für die erythrozytäre Konversion von Pyridoxin zu Pyridoxal. Dadurch erreicht der Organismus eine metabolische Flexibilität, die ihn bis zu einem gewissen Grad unabhängig von der Nahrungsauswahl macht. Zudem können Zellen oder Organe, denen durch das Fehlen der PNPO, die Konversion zu PLP nicht möglich ist, mit PL versorgt werden.
Aus der hohen Reaktivität von PLP mit umliegenden Nucleophilen ergibt sich eine gewisse Problematik für die Zelle im Umgang mit freiem PLP. So liegt der Großteil des erythrozytären PLPs gebunden an Proteine (vor allem Hämoglobin) vor. Anhand von Filtern (MWCO, 3000) ließ sich zwischen der hier definiert als „freien“ und der „gebundenen“ Form von PLP differenzieren. So konnten erste Erkenntnisse zur Rolle von PDXP als Determinator freier PLP-Konzentrationen in Erythrozyten und insbesondere im Hippocampus erlangt werden. Im Hippocampus ergaben sich insgesamt deutlich höhere Konzentrationen an freiem PLP als in den Erythrozyten und es bestand zudem ein Unterschied zwischen den Genotypen. So wiesen die KO-Mäuse ~1/3 höhere freie PLP-Konzentrationen im Vergleich zu den Wildtypen auf. Schließlich konnte ein Effekt des Tieralters auf den PLP-Metabolismus festgestellt werden. Sowohl in den Erythrozyten als auch im Hippocampus ergaben sich alterskorrelierte Änderungen ihrer PLP-Konzentrationen. Zudem zeigten Western Blot Analysen altersbedingte Unterschiede ihrer Vitamin B6-Enzymexpressionen. So wiesen ältere Wildtypen im Hippocampus eine fünffach erhöhte PDXP-Expression verglichen mit jüngeren Tieren auf. In den Erythrozytenlysaten hingegen zeigten ältere Tiere beider Genotypen eine rund vierfach geringere PNPO-Expression gegenüber jüngeren Tieren. Die mit dem Alter eintretende physiologische Verringerung der erythrozytären PNPO-Expression würde somit für den Organismus einen Verlust seiner metabolischen Flexibilität bedeuten, die mit der Konversion von PN zu PL einhergeht.