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Arabidopsis thaliana (A.th.) mesophyll cells play a pivotal role in the regulation of the drought stress response. The signaling & transport components involved in drought stress regulation within lipid rafts of the plasma membrane were investigated by DRM isolation from highly purified plasma membranes. Detergent treatment with Brij-98 and Triton X-100 resulted in a total of 246 DRM proteins which were identified by nano HPLC-MS/MS. The majority of these proteins could be isolated by Triton X-100 treatment (78.5 %) which remains the ”golden” standard for the isolation of DRMs. Comparing in-gel and in-solution digestion approaches disclosed additional protein identifications for each method but the in-gel approach clearly delivered the majority of the identified proteins (81.8 %). Functionally, a clear bias on signaling proteins was visible – almost 1/3 of the detected DRM proteins belonged to the group of kinases, phosphatases and other signaling proteins. Especially leucine-rich repeat receptor-like protein kinases and calcium-dependent protein kinases were present in Brij-98 & Triton X-100 DRMs, for instance the calcium-dependent protein kinase CPK21. Another prominent member of DRMs was the protein phosphatase 2C 56, ABI1, which is a key regulator of the ABA-mediated drought stress response in A.th. The lipid raft localization of the identified DRM proteins was confirmed by sterol-depletion with the chemical drug MCD. Proteins which depend upon a sterol-rich environment are depleted from DRMs by MCD application. Especially signaling proteins exhibited a strong sterol-dependency. They represented the vast majority (41.5 %) among the Triton X-100 DRM proteins which were no longer detected following MCD treatment. AtRem 1.2 & 1.3 could be shown to be sterol-dependent in mesophyll cells as well as two CPKs (CPK10 & CPK21) and the protein phosphatase ABI1. AtRem 1.2 & 1.3 could be proven to represent ideal plant lipid raft marker proteins due to their strong presence in Triton X-100 DRMs and dependency upon a sterol-rich environment. When fluorescence labeled AtRem 1.2 & 1.3 were transiently expressed in A.th. leaves, they localized to small, patchy structures at the plasma membrane. CPK21 was an intrinsic member of Triton X-100 DRMs and displayed extreme susceptibility to sterol-depletion by MCD in immunological and proteomic assays. Calcium-dependent protein kinases (CPKs) have already been studied to be involved in drought stress regulation, for instance at the regulation of S-type anion channels in guard cells. Hence, further transient expression studies with the anion channel SLAH3, protein kinase CPK21 and its counterpart, protein phosphatase ABI1 were performed in Nicotiana benthamiana. Transient co-expression of CPK21 and the anion channel SLAH3, a highly mesophyll- specific homologue of the guard cell anion channel SLAC1, resulted in a combined, sterol-dependent localization of both proteins in DRMs. Supplementary co-expression of the counterpart protein phosphatase ABI1 induced dislocation of SLAH3 from DRMs, probably by inactivation of the protein kinase CPK21. CPK21 is known to regulate the anion channel SLAH3 by phosphorylation. ABI1 dephosphorylates CPK21 thus leading to deactivation and dislocation of SLAH3 from DRMs. All this regulative events are taking place in DRMs of A.th. mesophyll cells. This study presents the first evidence for a lipid raft-resident protein complex combining signaling and transport functions in A.th. Future perspectives for lipid raft research might target investigations on the lipid raft localization of candidate DRM proteins under presence of abiotic and biotic stress factors. For instance, which alterations in the DRM protein composition are detectable upon exogenous application of the plant hormone ABA? Quantitative proteomics approaches will surely increase our knowledge of the post-transcriptional regulation of gene activity under drought stress conditions.
In der vorgestellten Arbeit wurden das Wachstum und das physiologische Verhalten von Zea mays auf Müllheizkraftwerk (MHKW) -Schlacke im Vergleich zu Gartenerde als Kulturmedium untersucht. Dabei stand das Wurzelsystem der Maispflanzen im Mittelpunkt des Interesses. Da feste Bodensubstrate verwendet wurden, mußten diese zu Beginn der Experimente chemisch, physikalisch und bodenbiologisch charakterisiert werden. Die Analyse der Schlacke zeigte, daß Schlacke ein multifaktorielles Streßsystem darstellt: Sie enthält einen hohen Gehalt an leicht löslichen Salzen, v.a. NaCl (bis zu 220 mM in der Bodenlösung). MHKW-Schlacke ist dagegen arm an Stickstoff und pflanzenverfügbarem Phosphat. Der pH-Wert der Bodenlösung von Schlacke ist stark alkalisch (pH 8.4 - 9.0). Darüber hinaus besitzt Schlacke einen hohen Gehalt an potentiell toxischen Schwermetallen und weist im Vergleich zum Kontrollsubstrat Gartenerde eine verdichtete Bodenstruktur mit erhöhtem mechanischen Widerstand auf. Im Vergleich zu der Kontroll-Anzucht auf Gartenerde reagierten die auf Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen mit vermindertem Wachstum: Sproß und Wurzel erreichten nur die Hälfte der Länge der Kontrollpflanzen. Ein Vergleich der Biomassen von Sproß und Wurzel zeigte, daß das Sproßwachstum der Schlacke-Pflanzen stärker eingeschränkt ist als das Wurzelwachstum, woraus ein vergrößertes Wurzel / Sproß-Verhältnis resultiert. Das Wachstum von jungen Mais-Pflanzen auf Schlacke ist jedoch nicht in dem Maß eingeschränkt, wie es aufgrund der hohen Salzbelastung zu erwarten wäre. In einem Vergleichsexperiment mit Mais-Pflanzen, die in einer Nährlösung mit Zusatz von 100 mM NaCl kultiviert wurden, war das Wachstum erheblich schlechter und in den Blättern akkumulierte weitaus mehr Natrium als in Schlacke-Pflanzen. Hier wird der positive Einfluß des hohen Calciumgehaltes der Schlacke deutlich. Die Beeinträchtigung des Wachstums von Mais bei Kultur auf Schlacke wird hauptsächlich auf Phosphatmangel zurückgeführt, da durch Düngung eine beträchtliche Wachstumsverbesserung erzielt werden kann. Zudem wurden keine toxischen Konzentrationen an Schwermetallen im Blattgewebe von auf Schlacke kultivierten Pflanzen gefunden. Der Photosynthese-Apparat der Schlacke-kultivierten Pflanzen war sehr leistungsfähig: Es bestand keine Beeinträchtigung in der Energieverfügbarkeit (Quantenausbeute des Photosystems II) und die Lichtsättigung der photo-synthetischen Elektronentransportrate lag sogar höher als bei den Kontrollpflanzen. Die Bestimmung des „adenylate energy charge“ bestätigte diesen Sachverhalt. Das Wurzelsystem von Zea mays auf Schlacke wies strukturelle Veränderungen auf. Neben der verkürzten Wurzellänge und dem vergrößerten Wurzeldurchmesser der Schlacke-Pflanzen ergaben mikroskopische Untersuchungen, daß die Wurzeln durch Kultur auf Schlacke mit einer mechanischen Verstärkung reagieren: Stärker ausgeprägte tangentiale Zellwandverdickungen der Endodermis im tertiären Zustand und Zellwandmodifikationen in den radialen Zellwänden der Rhizodermis (Phi-Verdickungen). Für monokotyle Arten, insbesondere für Mais, gibt es bisher keine Beschreibung von Phi-Verdickungen in der Literatur. Gaschromatographische und massenspektrometrische Untersuchungen belegen, daß sich die Zellwände von auf Erde und Schlacke kultivierten Maiswurzeln im Hinblick auf den Gesamtgehalt an Lignin (endodermale Zellwandisolate) und in der Ligninzusammensetzung (hypodermale Zellwandisolate) unterscheiden: In Schlacke-kultivierten Maiswurzeln wurde ein höherer Anteil an dem Lignin-Monomer p Hydroxyphenyl gefunden, was zu einem höher verdichteten Lignin führt (Streßlignin). Die endodermalen Zellwände von auf Schlacke-kulivierten Pflanzen hatten dagegen einen höheren Gesamtlignin-Gehalt als die entsprechenden Kontrollen, was ebenfalls eine mechanische Verstärkung der Wurzel bewirkt. In Bezug auf Suberin konnten keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Anzuchten gefunden werden, weder in den hypodermalen noch in den endodermalen Zellwandisolaten. Die verschiedenen Streßfaktoren führen demnach nicht zu einer verstärkten Imprägnierung der Zellwände mit lipophilem Material. Die Zellwände von Mais spielen eine wichtige Rolle bei der Immobilisierung von Schwermetallen. Die Zellwandisolate von auf Erde und Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen wiesen je nach Schwermetall-Element 43 - 100 % des Gesamtgehaltes auf. Die absoluten Gehalte in den Zellwandisolaten von auf Schlacke angezogenen Pflanzen waren dabei höher als die entsprechenden Werte der Kontrolle. Eine Anreicherung in den Zellwänden wurde hauptsächlich für die Schwermetalle Zink, Blei, Nickel und Chrom beobachtet. Als unspezifische Streßantwort reagierten Maispflanzen auf die Kultur in Schlacke mit einer erhöhten Peroxidaseaktivität in der interzellulären Waschflüssigkeit. Die Peroxidaseaktivität des Symplastens der Wurzel unterscheidet sich zwischen den beiden Anzuchten dagegen nicht. Die Konzentration des Phytohormons Abscisinsäure (ABA) war in Blättern von auf Schlacke kultivierten Pflanzen von Zea mays und Vicia faba im Vergleich zu den Kontrollpflanzen erhöht. Dieser Anstieg ist eine Folge der erhöhten Salzbelastung der Schlacke, da die ABA-Gehalte entsprechender Blätter von auf gewaschener Schlacke kultivierten Pflanzen annähernd den Kontrollwerten entsprachen. Bei der Verteilung von ABA zwischen der Wurzel und der Bodenlösung der umliegenden Rhizosphäre konnte das als Anionenfalle bekannte Prinzip bestätigt werden. Nach diesem Modell reichert sich ABA im alkalischten Kompartiment an (hier: Schlacke-Bodenlösung). In den Wurzeln konnte nur in der Maiskultur auf Schlacke ein erhöhter Gehalt gefunden werden, nicht dagegen in der Vicia faba-Kultur. Dieser Unterschied liegt daran, daß Mais im Gegensatz zu Vicia faba eine exodermale Spezies ist und die Exodermis für ABA eine Barriere darstellt, was den ABA-Efflux in die Rhizosphäre verhindert. Im Wurzelgewebe von auf Schlacke kultivierten Maispflanzen wurde ein im Vergleich zur Kontrolle 15-facher Gehalt an wasserlöslichen, nicht proteingebundenen Sulfhydrylgruppen nachgewiesen. Diese auf Schwermetallstreß zurückzuführende Reaktion impliziert, daß die in der Schlacke-Bodenlösung vorhandenen Schwermetalle nicht ausreichend im Apoplasten zurückgehalten werden und bis in den Symplasten vordringen können.