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Eine wichtige Standardtherapie in der modernen Behandlung von Krebserkrankungen ist die Strahlentherapie, in welcher Tumorzellen mittels ionisierender Strahlung geschädigt und abgetötet werden. Dabei soll die Schädigung des umgebenden Normalgewebes möglichst gering gehalten und trotzdem eine maximale Schädigung des Tumorgewebes erreicht werden. Deshalb sind neue Strategien zur Steigerung der Radiosensitivität des Tumorgewebes sehr wichtig, die es erlauben, bei gleicher Dosis eine verstärkte Strahlenantwort im Tumorgewebe zu erreichen. Hier kommen zunehmend sog. Radiosensibilisatoren zum Einsatz, die unter anderem onkogene Signalwege in den Tumorzellen inhibieren. Der PI3K/Akt/mTOR Signalweg stellt hierbei einen wichtigen Ansatzpunkt dar, da er in vielen Tumorentitäten dereguliert vorliegt und diese Signalkaskade bekanntermaßen einen Einfluss auf die zelluläre Strahlensensitivität hat. Obwohl es für diesen Signalweg schon eine Reihe von Inhibitoren gibt, für die bereits neben einer anti-proliferativen Wirkung auch ein radiosensibilisierender Effekt nachgewiesen wurde (z.B. Wortmannin und Rapamycin), machten eine geringe Spezifität, starke Nebenwirkungen und negative Rückkopplungsmechanismen im Signalweg, die die Wirkung des Inhibitors kompensieren, die Entwicklung neuer Inhibitoren notwendig. Das Imidazoquinolinderivat NVP-BEZ235 inhibiert den PI3K/Akt/mTOR Signalweg an mehreren Stellen gleichzeitig, indem es kompetitiv zu ATP das katalytische Zentrum von PI3K und mTOR blockiert. Für diesen kleinmolekularen, dualen Inhibitor gibt es bereits erste vielversprechende Forschungsergebnisse hinsichtlich einer radiosensibilisierenden Wirkung, allerdings sind die zugrunde liegenden molekularbiologischen Mechanismen noch nicht vollständig geklärt. Deshalb war das Ziel der vorliegenden Dissertation, in drei Teilprojekten mehrere Aspekte der NVP-BEZ235-induzierten Radiosensibilisierung aufzuklären: a) Einfluss des Behandlungsschemas für NVP-BEZ235 in vier Glioblastomzelllinien mit unterschiedlichem PTEN und TP53 Mutationsstatus, b) Einfluss der Sauerstoffversorgung (Hypoxie, Normoxie, reoxygeniert nach Bestrahlung) auf die strahlensensibilisierende Wirkung von NVP-BEZ235 in zwei Mammakarzinomzelllinien, c) gleichzeitige Inhibierung des MAPK Signalwegs durch AZD6244 und der PI3K/Akt/mTOR Signalkaskade durch NVP-BEZ235 in zwei Zelllinien mit unter-schiedlichem Mutationsstatus aus verschiedenen Tumorentitäten, um synergistische Effekte zu untersuchen. Um diese Fragestellungen zu beantworten, wurde im Rahmen - 142 -
der Dissertation eine Auswahl an humanen Tumorzelllinien mit unterschiedlich deregulierten Signalwegen bearbeitet. Dabei wurde die Expression von Schlüsselproteinen der MAPK/Erk und der PI3K/Akt/mTOR Signalwege analysiert und mit zellbiologischen Daten verschiedener phänotypischer Endpunkte nach Inhibitor Behandlung und Bestrahlung integriert (Proliferationsrate, klonogenes Überleben, Zellzyklusaberrationen, DNS-Schäden und -Reparatur, Zelltod und Autophagie).
Im Teilprojekt zum Behandlungsschema der NVP-BEZ235 Inhibierung und Bestrahlung konnte in vier Glioblastomzelllinien mit Behandlungsschema I (NVP-BEZ235 Behandlung 24 Stunden vor Bestrahlung) kein radiosensibilisierender Effekt hinsichtlich klonogenem Überleben nachgewiesen werden, wohingegen Behandlungsschema II (NVP-BEZ235 Behandlung 1 h vor und im Anschluss an die Bestrahlung) unabhängig vom Mutationsstatus in allen vier Zelllinien eine starke Radiosensibilisierung bewirkte. Auf molekularer Ebene war zwischen beiden Behandlungsschemata für das antiapoptotische Protein Akt ein großer Unterschied zu beobachten, welches bei Behandlung nach Schema I zum Zeitpunkt der Bestrahlung überaktiviert, nach Behandlung mit Schema II hingegen inhibiert war. Weiterhin resultierte Behandlungsschema I in einem erhöhten Anteil der Zellen in der radioresistenteren G1-Phase des Zellzyklus zum Zeit-punkt der Bestrahlung. Behandlungsschema II führte hingegen nach Bestrahlung zu einer verminderten Expression des Reparaturproteins Rad51 und damit zu verminderter DNS-Schadensreparatur und schließlich zu einem stabilen Arrest in der G2/M-Phase des Zellzyklus sowie zu verstärkter Apoptose (erhöhte Spaltung von PARP, erhöhter Anteil hypodiploider Zellen). Somit zeigen diese Ergebnisse, dass unabhängig vom PTEN und TP53 Mutationsstatus eine Radiosensibilisierung nur durch das Behandlungsschema II erreicht werden konnte. Ferner deuten die Ergebnisse der Proteinexpression darauf hin, dass durch NVP-BEZ235 ein negativer Rückkopplungsmechanismus ausgelöst wird, wodurch die PI3K/Akt/mTOR Signalkaskade 24h nach Zugabe des Inhibitors aktiviert und synergistische Effekte mit ionisierender Bestrahlung aufgehoben wurden.
Im Teilprojekt zur Abhängigkeit der NVP-BEZ235 Inhibition vom Sauerstoffgehalt wurden in den beiden Brustkrebszelllinien MCF-7 (ER-positiv) und TN MDA-MB-231 (TP53 mutiert) normoxische, hypoxische und nach Bestrahlung reoxygenierte Kulturbedingungen im Hinblick auf die Koloniebildungsfähigkeit nach NVP-BEZ235 Behandlung und Bestrahlung untersucht. Die beobachtete Radiosensibilisierung war unter allen getesteten Bedingungen auf gleichem Niveau. In beiden Zelllinien bewirkte NVP-BEZ235 eine Inhibition des antiapoptotischen HIF-1α Proteins, eine stabile Inaktivierung des PI3K/Akt/mTOR Signalweges und eine Aktivierung der Autophagie. Nach Bestrahlung waren zudem erhöhte residuale DNS-Schäden und ein stabiler Arrest in der G2/M-Phase des Zellzyklus unter allen Oxygenierungsbedingungen in beiden Zelllinien zu beobachten. Eine Apoptose Induktion (Spaltung von PARP, hypodiploide Zellen) trat nur in der TP53 wildtypischen MCF-7 Zelllinie nach NVP-BEZ235 Behandlung auf. Somit konnte in beiden Zelllinien in allen pathophysiologisch relevanten Oxygenierungszuständen eine sauerstoffunabhängige Radiosensibilisierung durch NVP-BEZ235 gezeigt werden.
Der bisher nicht erforschte Aspekt zur synergistischen Wirkung des MEK Inhibitors AZD6244 und des dualen PI3K/Akt/mTOR Inhibitors NVP-BEZ235 nach Bestrahlung wurde an der Glioblastomzelllinie SNB19 und der Lungenkarzinomzelllinie A549 anhand der Koloniebildungsfähigkeit der behandelten Zellen untersucht. Eine Behandlung mit dem MEK Inhibitor bewirkte lediglich eine moderate Radiosensibilisierung, wohin-gegen der duale PI3K/Akt/mTOR Inhibitor beide Zelllinien in stärkerem Maße sensibilisierte. Eine Kombination beider Inhibitoren resultierte bei keiner Zelllinie in einer Verstärkung der durch NVP-BEZ235 induzierten Radiosensibilisierung. Eine mögliche Erklärung für die fehlende Synergie im Bezug auf die Radiosensibilisierung können die gegensätzlichen Effekte der beiden Inhibitoren auf den Zellzyklus sein. Auf Proteinebene führte eine simultane Behandlung mit beiden Substanzen zur Inhibition beider Signalwege. Darüber hinaus war in SNB19 Zellen eine verstärkte Dephosphorylierung von Rb und ein erhöhter Anteil an G1-Phase Zellen bei kombinierter Gabe der Inhibitoren zu beobachten.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit die radiosensibilisierende Wirkung von NVP-BEZ235 in Abhängigkeit vom Behandlungsschema gezeigt werden. Ferner wurde nachgewiesen, dass die Radiosensibilisierung unabhängig von der Sauerstoffversorgung sowie von den PTEN und TP53 Mutationsstatus der Tumorzellen ist. Die kombinierte Inhibition der MAPK und PI3K/Akt/mTOR Signalwege resultierte zwar in einem verstärkten zytostatischen, aber nicht in einem verstärkten radiosensibilisierenden Effekt. Da allerdings eine große Anzahl verschiedener Inhibitoren der MAPK/Erk und der PI3K/Akt/mTOR Signalkaskade verfügbar sind, sollte die kombinatorische Inhibition dieser Signalwege systematisch weiter verfolgt werden. Die vorliegende Arbeit liefert auch weitere grundlegende Erkenntnisse zu den molekularen Mechanismen der Radiosensibilisierung durch NVP-BEZ235, die auch auf Verknüpfungen und Wechselwirkungen mit anderen als den bisher bekannten Proteinen hindeuten, die für jeden Inhibitor aufgeklärt werden müssen, um eine effektive radiosensibilisierende Wirkung vorher-sagen zu können.
Cancer is the leading cause of death in economically developed countries (Jemal et al. 2011). Heat shock protein 90 can be a promising target in cancer treatment as it is responsible for sustaining protein homeostasis in every human cell by folding and activating of more than 200 client proteins (Picard et al. 2002). Apart from strong anti-tumor activities in vitro (Smith et al. 2005) and in vivo (Supko et al. 1995), Hsp90 inhibitors can sensitize tumor cells to radiation (Bisht et al. 2003, Stingl et al.2010, Schilling et al. 2011). Recently, our group showed the radiosensitizing potential of novel Hsp90 inhibitors: NVP-AUY922 and NVP-BEP800 (Stingl et al. 2010). The drugs were administered to cancer cell lines of different origin 24 hours before irradiation (drug-first treatment). In the present work, we explored the effects of a schedule other than drug-first treatment on A549 and SNB19 tumor cell lines. Cell samples were treated with either NVP-AUY922 or NVP-BEP800 one hour before IR and kept in the drug-containing medium for up to 48 hours (simultaneous drug-IR treatment). Our findings showed that depending on the tumor cell line, the combination of Hsp90 inhibition and irradiation may result in radiosensitization or apoptosis of cancer cell lines. It is advised to adjust the sequence of treatment, involving Hsp90 inhibition and irradiation, on the basis of the genetic background of tumor cells. Before entering the clinic, novel therapeutics should be tested on non-malignant tissue to exclude their possible toxic activities. Thus, we applied the simultaneous drug-IR treatment on human skin fibroblast strains. This work showed that Hsp90 inhibitors NVP-AUY922 and NVP-BEP800 preferentially sensitize tumor cells to radiation, whereas the effect(s) on normal fibroblasts was much weaker. The exact mechanisms underlying the Hsp90 inhibitors’ selectivity towards malignant cells remain to be elucidated. It was shown previously that the administration of Hsp90 inhibitors, including NVP-AUY922 and NVP-BEP800, induces heat shock response (Niewidok et al. 2012). Heat shock response triggers the up-regulation of Hsp70, which, due to its strong anti-apoptotic properties, might be responsible for reducing the effects of Hsp90 inhibition. The transfection with Hsp70 siRNA suppressed the NVP-AUY922-induced over-expression of the target protein. However, on the long-term scale, it did not influence the radiosensitivity of A549 and SNB19 cells. To summarize, the use of siRNA proved that Hsp70 inhibition could be used to support Hsp90 inhibition on the short-term scale. Therefore, for future works, more potent and stable methods of Hsp70 inhibition are needed. This thesis presented the effects induced by two novel Hsp90 inhibitors NVP-AUY922 and NVP-BEP800, in combination with irradiation in tumor cell lines as well as in normal skin fibroblasts. Hsp70 pre-silencing was tested as a method for improving radiosensitizing potential of NVP-AUY922. These results support the use of NVP-AUY922 and NVP-BEP800 in combination with irradiation in future clinical trials.