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Chronische Drucküberlastung des adulten Herzens führt zu Umbauvorgängen in der Extrazellulärmatrix und zur Hypertrophie der Herzmuskelzellen. Dabei kommt es zur Aktivierung von Integrinrezeptoren und der dadurch induzierten Entstehung des sogenannten fokalen Adhäsionskomplexes im Zytoskelett der Herzmuskelzelle. Dies konnte kürzlich im Modell der rechtsventrikulären Drucküberlastung an der Katze gezeigt werden. (Laser M et al., J. Biol. Chem, 2000). Um zu testen, ob die Integrinaktivierunng und der Umbau des Zytoskeletts im Hypertrophieprozess des linken Ventrikels eine Rolle spielen, wurden ausgewachsene Mäuse (30g Körpergewicht) nach Konstriktion der transversalen Aorta analysiert und mit scheinoperierten Mäusen verglichen. Morphologisch zeigte sich bei den drucküberlasteten Tieren eine signifikante Herzhypertrophie bezogen auf Körpergewicht und Tibialänge innerhalb eines Monats. Keine Unterschiede fanden sich bei der hämodynamischen Charakterisierung für die in vivo gemessene Herzfrequenz, während der systolische Druck und der enddiastolische Druck signifikant erhöht waren. Zur Western Blot-Analyse wurden jeweils eine Detergens-lösliche sowie eine unlösliche Fraktion (Zytoskelett) der Herzen präpariert. Dabei zeigten sich im Zytoskelett verschiedene tyrosinphosphorylierte Proteine bei 160, 125, 75 und 60 kD, beginnend drei Tage nach Drucküberlastung. Zwei dieser Banden konnten wir als Zytoskelett-assoziierte Tyrosinkinasen, „focal adhesion kinase“(Fak) und c-Src, identifizieren, welche beide zum sogenannten Integrin-abhängigen fokalen Adhäsionskomplex gehören. Weitere Analysen zeigten Phosphorylierungen von Fak bei Tyr-397 und Tyr-925, c-Src bei Tyr-418. Dies lässt darauf schließen, dass beide Kinasen aktiviert sind. Aus diesen Daten wird deutlich, dass eine Aktivierung von Integrinrezeptoren und die Formation des fokalen Adhäsionskomplexes auch im Hypertrophieprozess des linken Ventrikels eine Rolle spielen. Um den Einfluss der Integrin-vermittelten Signalwege auf die Entwicklung der Hypertrophie und deren Signaltransduktion weiter zu testen, wurde eine konditionale „knock-out“-Mauslinie (Cre/loxP-System mit MLC-2v-Promotor) etabliert. Bei diesen Mäusen ist das beta.1-Integrin-Gen selektiv im Myokard ausgeschaltet. Die Ergebnisse aus Phänotypisierung und Charakterisierung dieser Mauslinie im Hypertrophieprozess stehen noch aus.
Einleitung: Die Plasmamembran Ca2+-ATPase (PMCA) ist ein ubiquitär in eukaryonten Zellen vorkommendes Enzym, das Kalziumionen aus der Zelle transportiert. In Myokardzellen ist ihre Funktion trotz eingehender biochemischer Charakterisierung unklar. Die frühere Hypothese einer Zuständigkeit für die Feinabstimmung der [Ca2+]iz wurde in neuerer Zeit ergänzt durch die vermutete Rolle der PMCA in der Regulation von Zellparametern wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Unterstützt wird dies durch die Lokalisation der ATPase in Caveolae, spezifischen Membraninvaginationen, in denen wichtige Zentren der zellulären Signalverarbeitung gesehen werden. Ziel: Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion der Plasmamembran Ca2+-ATPase, insbesondere eine mögliche Beteiligung des Enzyms an der Übermittlung zellulärer Signale im Rahmen von Apoptose und Wachstum, weiter aufgeklärt werden. Methoden: Die Experimente zur Apoptose in dUTP-nick-end-labeling (TUNEL)-Technik wurden zum einen an einer Myoblastenlinie, zum anderen an transgenen Ratten mit hPMCA 4CI-Überexpression durchgeführt. Die Proteinsyntheseraten neonataler Kardiomyozyten wildtypischer bzw. überexprimierender Tiere mittels 3H-Leucin-Inkorporation in Ruhe und unter Stimulation mit hypertrophieinduzierenden Substanzen wurden verglichen. Ergänzend zu diesen funktionellen Versuchen fanden Immunfluoreszenzanalysen an neonatalen Kardiomyozyten der hPMCA 4CI-überexprimierenden Rattenlinie 1142 statt. Ergebnisse: In der L6-Myoblastenlinie beeinflußte die Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase die Apoptose nicht, ebenso in ruhenden neonatalen Kardiomyozyten. Phenylephrin und Isoproterenol steigerten die Syntheseaktivität in den überexprimierenden Herzmuskelzellen signifikant gegenüber Wildtypkontrollen. NOS-Inhibition mit L-NAME induzierte in den neonatalen Kardiomyozyten Hypertrophie. Die Kombination von L-NAME und Isoproterenol ergab in beiden Zellgruppen gegenüber dem Einzelstimulus verdoppelte Proteinsyntheseraten, wobei die Myozyten der Linie 1142 signifikant stärker ansprachen. Zusammenfassung: Überexpression der Plasmamembran Ca2+-ATPase moduliert myozytäres Wachstum, wobei ein Einfluß auf den b-adrenergen und NO Signalweg vorliegt. Die mittels Immunfluoreszenz nachgewiesene Lokalisation der PMCA in Caveolae läßt eine Interaktion des Enzyms mit anderen Signaltransduktionsmolekülen in diesen Subkompartimenten vermuten.