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Eine durch Aktivierung eines G-Protein gekoppelten Rezeptors induzierte Konfirmationsänderung resultiert in einer Signaltransduktion durch das G-Protein zu einem Effektorenzym wie der Adenylylcyclase. In dieser Arbeit konnten Aminosäuren in dem zur G-Protein gekoppelten Rezeptorfamilie zugehörigen beta1-adrenergen Rezeptor identifiziert werden, welche für dessen Aktivierung von Bedeutung sind. Der Analyse von beta1-adrenergen Rezeptormutanten lag die Erkenntnis zu Grunde, dass therapeutisch genutzte Liganden wie Terbutalin, oder das experimentell eingesetzte Broxaterol Agonisten am beta2- und beta3-adrenergen Rezeptor, jedoch Antagonisten am beta1-adrenergen Rezeptor sind. Dieses Verhalten wurde zum Anlass genommen spezifische Aminosäuren zu identifizieren, welche eine bedeutende Funktion in der Aktivierung von beta -Rezeptorsubtypen haben könnten. Nach einem Aminosäurevergleich innerhalb der Familie der beta-adrenergen Rezeptoren konnten Aminosäurepositionen identifiziert werden, die identisch im beta2- bzw. beta3-Rezeptor sind und sich von denen des beta1- Rezeptors unterscheiden und damit das Aktivierungsprofil von Broxaterol und Terbutalin widerspiegeln. Mit zielgerichteten Punktmutationen wurden nun insbesondere im Bereich der Transmembranregionen solche Aminosäuren im beta1-adrenergen Rezeptor durch die entsprechende des beta2- (beta3-) Rezeptors ersetzt. Obwohl keine der getesteten Mutanten Unterschiede im pharmakologischen Bindungsprofil zeigten, konnten vier Mutanten gefunden werden, welche partiell oder vollständig durch Broxaterol oder Terbutalin aktiviert wurden. Die beiden Mutanten I185L sowie D212N konnten mit Broxaterol und Terbutalin aktiviert werden, zwei Liganden, die Antagonisten am beta1- Wildtyprezeptor sind. Außerdem konnten zwei weitere Mutanten, V120L und K253R, durch Terbutalin aktiviert werden. Betrachtet man die Struktur von Terbutalin, so ist dieser Ligand den endogenen Katecholaminen ähnlicher als Broxaterol. Ein Rezeptormodell zeigt, dass die vier relevanten Aminosäuren außerhalb der Ligandenbindungsregion liegen und somit eine direkte Interaktion mit dem Liganden unwahrscheinlich erscheint. Diese These wird durch das im Vergleich zum Wildtyp nicht veränderte Bindungsprofil der beta1-Rezeptormutanten unterstützt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Aminosäuren V120, I185, D212 und K253 in der ligandeninduzierten Konfirmationsänderung des beta1-Rezeptors von Bedeutung sind.
Fanconi-Anämie gehört zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilität aus. Die genomische Instabilität ist auch Ursache häufiger Rückmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilität vor. Insbesondere gilt dies für das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilität aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als häufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplementär einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. Für die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine höhere Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase.
Die progressiven Muskeldystrophien Duchenne (DMD) und Becker (BMD) entstehen durch verschiedene Mutationstypen (Deletionen, Duplikationen, Punktmutationen) im Dystrophin-Gen, welches als größtes Gen des Menschen 79 Exons aufweist und sich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms befindet. Es wurden Daten von 1365 Personen bezüglich der Häufigkeit der Mutationstypen sowie der Verteilung der einzelnen Mutationen auf die Exons des Dystrophin-Gens ausgewertet. Hieraus konnte ermittelt werden, dass sich bei 780 männlichen Patienten mit gesicherter Diagnose zu 65 Prozent Deletionen, 9 Prozent Duplikationen und 26 Prozent Punktmutationen nachweisen ließen. Desweiteren wurde gezeigt, dass sich bei der Verteilung der Deletionen auf das Dystrophin-Gen zwei hot spot Regionen finden, eine größere im Bereich der Exons 45 - 54 und eine kleinere im Bereich 11 - 20. Die Duplikationen weisen eine Häufung der betroffenen Exons am Anfang des Gens auf, wobei Exon 2 am häufigsten das erste betroffene Exon darstellt. Die Punktmutationen dagegen verteilen sich zufällig über das Gen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass hinsichtlich der Verteilung der gleichen Mutationen auf das Dystrophin-Gen zwischen einer Gruppe von männlichen Patienten und der Gesamtheit aller Probanden einschließlich Konduktorinnen keine Unterschiede bestehen. Dagegen unterschieden sich die verschiedenen Mutationstypen im Vergleich miteinander hinsichtlich ihrer Verteilung auf das Dystrophin-Gen. Bei der Untersuchung der geographischen Verteilung der DMD und BMD konnte lediglich bei den Duplikationen eine Gleichverteilung in Deutschland bestätigt werden.
Die arrhythmogene Kardiomyopathie (ACM) ist eine Herzmuskelerkrankung, die durch den fett- und bindegewebigen Umbau von Herzmuskelgewebe charakterisiert ist. Klinisch treten häufig ventrikuläre Herzrhythmusstörungen auf, teilweise bis hin zum plötzlichen Herztod. ACM ist eine genetisch bedingte Erkrankung, die durch Mutationen in desmosomalen Proteinen, wie Plakophilin-2 (PKP2) und Desmoglein-2 (DSG2), entsteht. Die molekularen Mechanismen sind nur teilweise verstanden und aktuell gibt es keine spezifischen Therapiemöglichkeiten.
Ziel der Arbeit war es, die therapeutische Wirkung eines DSG2-spezifischen Tandem-Peptids (TP) durch desmosomale Stabilisierung an humanen Kardiomyozyten (KM) in einem ACM-Modell zu untersuchen. KM wurden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) einer PKP2-Knockout- (PKP2-KO), DSG2-Knockout- (DSG2-KO) und deren isogener Kontrollzelllinie differenziert. Zunächst wurden verschiedene Methoden der beschleunigten Zellreifung getestet. Dann wurden die PKP2- und DSG2-KO-KM anhand von intrazellulären Kalzium-Messungen und Arrhythmie-Analysen phänotypisch charakterisiert. Letztlich wurde die Wirkung des TPs, das an die DSG2 der geschwächten Zellbindungen von PKP2-KO-KM binden sollte, im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass mit der Matrigel-Mattress-Kultivierung und einer Hormonbehandlung elektrisch stimulierbare hiPS-KM mit reifen Eigenschaften hergestellt werden konnten. Der Phänotyp der mutationstragenden PKP2-KO-KM und DSG2-KO-KM zeichnete sich durch erhöhte diastolische Kalzium-Konzentrationen und erniedrigte Kalzium-Amplituden sowie durch beschleunigte Kalzium-Kinetik im Sinne der Relaxationszeiten aus. Weiterhin war bei den PKP2-KO-KM die Häufigkeit der Arrhythmien erhöht, die unter beta-adrenerger Stimulation nachließen. Insgesamt konnte keine eindeutige Wirkung des TPs im ACM-Modell gezeigt werden. Das TP hatte nur auf die diastolischen Kalzium-Konzentrationen der PKP2-KO-KM einen therapeutischen Einfluss, allerdings auch auf DSG2-KO-KM, weshalb der Hinweis auf eine fehlende DSG2-Spezifität des TPs entstand.
Schlussfolgernd wurde bestätigt, dass sich reife hiPS-KM mit genetischen Veränderungen als Modell zur Untersuchung der Kalziumhomöostase und von Arrhythmien bei der ACM eignen. Sie können grundsätzlich zum Test von therapeutischen Anwendungen genutzt werden. Die Wirksamkeit und Spezifität des getesteten TPs sollte zukünftig weiter überprüft werden.
Ziel der Arbeit ist es, die Bedeutung der C282Y und H63D Mutation in der Pathogenese der hereditären Hämochromatose und ihre Verteilung, insbesondere in der Region Unterfranken darzustellen. Die oben genannten Mutationen des HFE-Gens beeinflussen den Transferrinrezeptor an der vasalen Seite der Enterozyten. Über vermehrte Eisennabschöpfung wird diesen ein scheinbarer Eisenmangel vorgetäuscht, dem sie durch maximale Steigerung ihrer Eisenresorption entgegenwirken. Das überschüssige Eisen reichert sich in allen parenchymalen Zellen an und bewirkt durch Beeinträchtigung der funktionellen / strukturellen Zelleigenschaften die bekannten Auswirkungen des Krankheitsbildes mit letztendlich letalem Ausgang. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie sprechen in Einklang mit internationalen Studien für die große Bedeutung der C292Y-Mutation in der Pathogenese der primären Hämochromatose, vor allem in homozygoter, aber auch in compound heterozygoter Form mit der H63D-Mutation. Die C282Y Mutation war im Erbgut Hämochromatosekranker (76,3%) signifikant häufiger anzutreffen als in der klinisch gesunden Kontrollgruppe (4,5%). Die Compound Heterozygotie scheint in Unterfranken eine besondere Rolle zu spielen. Über 20% der histologisch gesicherten Erkrankten trugen diese Mutationskombination in ihrem Erbgut. Während die Penetranz global zwischen 0,5 und 1,5% liegt, überraschte sie in Unterfranken mit 4,5%. Sowohl die Homozygotie C282Y als auch die Compound Heterozygotie mit H63D korrelierte mit Klinik, Symptomatik und den bekannten Laborparametern des Eisenstoffwechsels. Die vorliegende Arbeit bekräftigt durch den hohen Anteil der C282Y Mutation bei Hämochromatosekranken und Gesunden in Unterfranken den Verdacht auf einen keltischen Ursrung der C282Y Mutation. Anhand von Familienuntersuchungen konnte der bekannte autosomal rezessive Erbgang nachvollzogen werden. Therapie der Wahl ist eine frühzeitige Eisenentspeicherung durch konsequente Aderlaßtherapie. Der entscheidende Wert der Genotypisierung liegt in der frühen Diagnose und somit Behandlungsmöglichkeit der Erkrankung vor der Entwicklung ihrer fatalen Komplikationen.
In der vorliegenden Arbeit wurden aus den Testzentren Würzburg und Wien DNA-Proben von Patienten, die im Laufe einer Anästhesie eine maligne Hyperthermie (MH) entwickelt hatten, und deren Angehörigen auf MH-verursachende Mutationen im Gen für den Ryanodinrezeptor 1 (RYR 1) untersucht. Es wurde dabei eine Hotspotregion des RYR 1 ausgewählt, für die bereits im Vorfeld mehrere Mutationen bekannt waren. Das Screening wurde mit Hilfe der Methode single-stranded conformation polymorphism (SSCP) durchgeführt. Eine dem abweichenden Laufverhalten eventuell zugrunde-liegende Mutation wurde anschließend durch die automatische Sequenzierung identifiziert. Unter 190 Patienten aus 126 Familien konnte in 18 Fällen eine Mutation gefunden werden. Das entspricht einer Detektionsrate von 14,29%. Insgesamt traten 10 verschiedene Mutationen auf, von denen eine (G6377A) vorher noch nicht beschrieben war. Die Mutationshäufigkeiten unterschieden sich zum Teil erheblich innerhalb der beiden untersuchten Populationen und im Vergleich zu Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen. Alle Indexpatienten und viele Angehörige hatten sich bereits einem in-vitro-Kontrakturtest (IVCT) zur Diagnostik der MH unterzogen. So konnten die Ergebnisse des IVCT mit denen der genetischen Untersuchung verglichen werden. Es fand sich eine gute Übereinstimmung, die die Zuverlässigkeit des IVCT stützt. Begleitend zur Screeninguntersuchung wurden die Methoden SSCP und automatische Sequenzierung hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit im Screening großer Patientenkollektive bewertet. Bei vergleichbarer Sicherheit ist mit dem SSCP in kürzerer Zeit bei geringerem Kostenaufwand eine größere Anzahl an Patientenproben auswertbar. Der Stellenwert der genetischen Diagnostik bei der MH wurde als ideale Methode zur Identifikation betroffener Familienmitglieder in MH-Familien mit bekannter Mutation bestätigt.
MC ist eine seltene, lebensbedrohliche Erkrankung mit einer bisher unvollständig verstandenen Pathogenese. Die zugrundeliegenden ACTH-produzierenden Adenome beherbergen in 35-62% somatische Mutationen imUSP8 Gen. Die aktivierenden Mutationen machen USP8 hyperaktiv und verhindern damit den Abbau von Zielproteinen. Ziel dieser Studie war es, den Einfluss von USP8-Mutationen auf Proteine, die in MC dereguliert sind, zu identifizieren. Zudem wird untersucht, ob es Zusammenhänge der klinischen Daten bei Patienten mit bekanntem Mutationsstatus gibt. Für die Analyse der klinischen Daten wurden Patienten eingeschlossen, die sich zwischen 1997 und 2016 einer transsphenoidalen Operation in der Uniklinik Hamburg, Würzburg oder Erlangen unterzogen haben. Die Daten wurden von 125 unterschiedlichen Patienten mit 127 corticotropen Tumoren ausgewertet (34 USP8 mutiert, 93 USP8 WT). Von dem obengenannten Patientenkollektiv der ACTH-produzierenden Tumore für die Auswertung der klinischen Daten, lagen uns insgesamt Proben von 78 dieser Tumore zur immunhistochemischen Färbung vor. Zudem wurde weitere Proben von Hypophysenadenomen und normalen Hypophysen als Vergleichsgruppe gefärbt und untersucht. Insgesamt wurden 111 Hypophysenadenome sowie 5 normale Hypophysen untersucht. Die bereits mit MC assoziierten deregulierten Proteine (USP8, EGFR, P27/Kip1, Cyclin E, CRHR1,AVPR1b, TR4, HSP90, CREB, pCREB, PKA) wurden immunhistochemisch untersucht. Während bei den USP8 mutierten Tumoren die Patienten zu 100% weiblich waren, ergab die relative Häufigkeit der Frauen bei den WT Tumoren nur 62%.Die Patienten mit USP8 Mutation waren bei der ED des MC im Schnitt 10 Jahre jünger als die vom WT Der basale präoperative Cortisolspiegel zeigte sich signifikant höher in mutierten Tumoren und die ACTH-Spiegel ergaben ähnliche Werte bei WT und mutierten Hypophysenadenomen. Die Tumorgröße war signifikant kleiner in den USP8mutierten Adenomen. Während die Invasivitätsrate der Tumore sich ähnlich zeigte, lag bei den WT Adenomen signifikant häufiger eine subtotale Resektion des Tumors vor als bei den mutierten Tumoren vor. Die Rezidivrate ergab keinen signifikanten Unterschied. Während die meisten der mittels Immunhistochemie untersuchten Proteine keinen Unterschied in der Expression zwischen USP8 mutierten und WT Tumoren zeigten, war der Zellzyklusinhibitor p27/Kip1 signifikant reduziert in mutierten Tumoren Im Gegensatz dazu, zeigte sich das Chaperon HSP90 im Nukleus stärker exprimiert und die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktor CREB war erhöht in mutierten Tumoren im Vergleich zum WT .Das lässt vermuten, dass p27/Kip1, HSP90 und pCREB direkte oder indirekte Zielproteine von USP8 sind und daher potenzielle Ziele für therapeutische Ansätze bei Patienten mit MC sein könnten.
Innerhalb des letzten Jahrzehnts entstanden zahlreiche neue Anreicherungs- und Sequenzier-technologien der zweiten (und dritten) Generation, die in rasantem Tempo weiterentwickelt und schon jetzt in vielen Bereichen als neuer Goldstandard für molekulargenetische For-schung und Diagnostik angesehen werden. Als Hochdurchsatz-Verfahren ermöglichen diese Next Generation Sequencing-Methoden (NGS) in immer kürzerer Zeit die parallele Analyse zahlreicher Proben und immer größerer Zielregionen bis hin zum ganzen Genom und führten in der Humangenetik dadurch zu Forschungsansätzen in neuen Dimensionen.
In dieser Doktorarbeit, die im molekulargenetischen Diagnostik-Labor der Humangenetik Würzburg durchgeführt wurde, wurden in fünf Projekten NGS-Ansätze unterschiedlicher Stufen bzw. Größenordnungen für verschiedene erblich bedingte Erkrankungen konzipiert und etabliert und in Forschungsprojekten sowie der Routinediagnostik eingesetzt. Dabei wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung der Zielsequenzen und zur NGS-Sequenzierung erprobt und auf ihre Effizienz beurteilt. Die Ergebnisse des NGS und darauf basierender Nachweis-Experimente wurden in sieben Veröffentlichungen dokumentiert, auf denen diese Dissertation aufbaut.
In den drei ersten Projekten wurden das Access Array-System (Fluidigm) zur Anreicherung der Zielsequenzen und der GS Junior (Roche) zur Erzeugung der Sequenzen verwendet.
In Projekt 1 wurde COL4A6 als neues Kandidatengen für nicht-syndromale Hörstörungen identifiziert. Um mögliche weitere Mutationsträger zu detektieren, wurde erfolgreich ein kleiner NGS-Ansatz für das zügige Screening dieses Gens bei knapp 100 weiteren Patienten etabliert. Diese und weitere Ergebnisse bestätigten die Kausalität der COL4A6-Mutation eines Index-Patienten mit schwerer, X-chromosomal-rezessiver Hörstörung.
Ein geeigneter NGS-Ansatz für die Analyse des großen RYR1-Gens wurde in Projekt 2 ge-sucht. Der erste Ansatz mit Access Array-System und GS Junior führte zwar bei 39 von 87 Patienten mit Maligner Hyperthermie und/oder Central Core Disease zu dem Auffinden einer (potentiell) pathogenen Variante, allerdings mit hohen Ausfallquoten. Mit der zweiten Methode (Anreicherung: SureSelect-System custom design, Agilent; Sequenzierung: HiSeq, Illumina) wurden neben RYR1 noch 63 weitere Gene analysiert, was zu deutlich besseren Ergebnissen und vier Mutationsfunden führte.
Projekt 3 beinhaltete die Etablierung zwei kleiner Panels für Muskelkrankheiten. Ein Panel für drei Gene für Gliedergürteldystrophien wurde sogar erfolgreich in die akkreditierte Rou-tinediagnostik übernommen. Mit dem zweiten Panel für acht Kandidatengene myofibrillärer Myopathien (MFM) wurde u.a. eine neue Mutation im BAG3-Gen identifiziert.
Das Exom eines MFM-Patienten wurde in Projekt 4 nach Anreicherung mit dem SureSelect-System (Agilent) auf dem HiSeq (Illumina) sequenziert. Nach Auswertung und Beurteilung der identifizierten Varianten wurde ein neuer Erbgang für Myotilinopathien entdeckt. Verschiedene Nachweisexperimente bestätigten die Kausalität der Mutation im Myotilin-Gen.
In Projekt 5 wurde die komplette genomische Sequenz des F8-Gens nach tiefen intronischen Mutationen bei Hämophilie-Patienten abgesucht (Anreicherung SureSelect custom design, Agilent; Sequenzierung MiSeq, Illumina). Bei jedem der analysierten Patienten konnte min-destens eine verdächtige Variante identifiziert werden, die zu verändertem Spleißverhalten führen könnte. Drei Mutationen waren schon durch Publikationen bekannt, bei einer weite-ren konnten in vitro-Spleißanalysen die Kausalität bestätigen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die zur Verfügung stehenden Methoden zur An-reicherung von Zielsequenzen aus dem menschlichen Genom und zu deren Sequenzierung je nach Komplexität der Fragestellung, d.h. der Anzahl und Größe der Gene sowie der Anzahl der zu untersuchenden Proben, sinnvoll und effizient kombiniert werden können. Im Verlauf der Arbeit haben sich die NGS-Techniken rasant weiterentwickelt. So sind PCR-basierte Ansätze zur Anreicherung der Zielsequenzen für die meisten Anwendungen von hybridisierungs-basierten Methoden verdrängt worden. Von den ursprünglich drei konkur-rierenden Verfahren zur Hochdurchsatzsequenzierung hat sich die Methode des „sequen-cing-by-synthesis“ (Illumina) weitgehend durchgesetzt. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in den während dieser Arbeit erhobenen Daten wider.
Die Arbeitsgruppe Zimmer am Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie der Universität Würzburg detektierte im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (DLD) eine bisher nicht bekannte Mutation, die für die Entwicklung einer familiären Form der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) verantwortlich ist. Die DLD spielt als Teil von mitochondrialen Enzymkomplexen eine wichtige Rolle im Energie- und Aminosäurestoffwechsel der Zelle. Mutationen im DLD-Gen führen dabei meist zu neurologischen Syndromen mit Erscheinungsbildern wie mentaler Entwicklungsverzögerung, Krampfanfällen und spastischen Bewegungsstörungen. Fälle von Herzinsuffizienz und frühkindlicher Hypertropher Kardiomyopathie wurden ebenfalls beschrieben. Von den zahlreichen Gendefekten, die als Auslöser für die dilatative Kardiomyopathie bekannt sind, ist bisher noch keiner im Gen der DLD beschrieben worden. Vielmehr sind DCM-Mutationen in Genen zu finden, die für muskelspezifische Proteine kodieren. Dadurch führen sie oft zu einer Beeinflussung der Kraftübertragung im Sarkomer. Die durch die Arbeitsgruppe Zimmer beschriebene DLD-Mutation wurde in einer portugiesischen Großfamilie entdeckt, in welcher das Auftreten der dilatativen Kardiomyopathie über mehrere Generationen hinweg zu verfolgen ist. Ähnliche Fälle außerhalb dieser Familie sind nicht bekannt. Demnach gibt es keine Daten, die die Häufigkeit DCM-assoziierter Mutationen im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase beschreiben. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich damit weitere Zusammenhänge zwischen genetischen Alterationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer DCM aufzudecken. In diesem Rahmen wurden DCM-Patienten, die erwiesenermaßen an einer familiären Form dieser Erkrankung leiden, gezielt auf Veränderungen in den Exons des DLD-Gens untersucht. Insgesamt wurden die Exons von 88 Patienten auf das Vorhandensein heterozygoter Mutationen überprüft. Hierfür wurden PCR-Produkte, die die jeweiligen Exons enthielten, mit Hilfe der Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC) untersucht. Diese Methode ermöglicht eine hochsensitive und gleichermaßen äußerst spezifische Detektion heterozygoter Mutationen. Auffällige Ergebnisse wurden anschließend mittels Sequenzierung verifiziert. Insgesamt wurden bei elf Patienten fünf unterschiedliche Mutationen nachgewiesen. Es handelte sich um vier bereits bekannte Einzelnukleotid-Polymorphismen und eine bisher nicht beschriebene Mutation. Dabei lagen vier Mutationen in nicht näher bezeichneten Intron-Bereichen, eine Mutation in einer 3‘ Spleißstelle und eine weitere Mutation in der 3‘ UTR (untranslated region) der mRNA. Somit befanden sich also einige Mutationen an für die Regulation der Genfunktion strategisch wichtigen Positionen. Da es sich dabei um bekannte Polymorphismen handelte, wurde mit Hilfe der Daten des HapMap Projekts überprüft, ob es bereits Hinweise für eine klinische Assoziation gab. Die Daten zeigten, dass bisher keiner der hier detektierten SNPs mit klinischen Erscheinungsbildern in Verbindung gebracht werden konnte. Es gab auch keine Hinweise dafür, dass die erfassten SNPs im Patientenkollektiv häufiger vorkamen als in der Normalbevölkerung. Einer der hier beschriebenen Mutationen war nicht in den verwendeten Datenbanken aufgeführt. Daher kann ein pathologischer Einfluss dieser Mutation zwar nicht ausgeschlossen werden, erscheint aber aufgrund ihrer Lage in einem weit vom Exon entfernten Intron-Bereich nicht offensichtlich. Es ließen sich also für keine der detektierten Mutationen pathogene Eigenschaften nachweisen. In Protein-kodierenden Sequenzbereichen konnten keine Mutationen nachgewiesen werden. Abschließend lässt sich also sagen, dass eine Assoziation zwischen Mutationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer familiären DCM im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden konnte. Es ist jedoch möglich, dass DCM-assoziierte Mutationen im DLD-Gen nur äußerst selten auftreten oder aber die durch die Arbeitsgruppe Zimmer detektierte Mutation im DLD-Gen die bisher einzige ist, die mit DCM in Verbindung gebracht werden kann. Um diese Frage zu klären müssen Untersuchungen mit größeren Patientenkollektiven angeschlossen werden.
Masernvirus (MV) ist ein negativ-strängiges RNA-Virus, das im Menschen und im Nagermodell zu akuten und subakuten Enzephalitiden führen kann. Es wurde beschrieben, dass bestimmte Antikörperescape-Mutanten des MV neurovirulent, andere nicht neurovirulent sind (Liebert et al., 1994). Mit Hilfe von rekombinanten Masernviren, konnte ich diejenigen Aminosäuren charakterisieren, die einerseits für die Bindung monoklonaler, neutralisierender anti-MV-H-Antikörper (K29, K71, Nc32 und L77) und andererseits für die Neurovirulenz verantwortlich sind. Bei den rekombinanten MV wurde das von Duprex et al. (1999) als Neurovirulenz vermittelnd beschriebene H-Gen des nagerhirnadaptierten neurovirulenten CAM/RB-Stammes in das Grundgerüst des nicht neurovirulenten Edtag (molekularer Klon des Vakzinestammes Edm) kloniert. Über gerichtete Mutagenese wurden die jeweiligen Mutationen in dieses CAM/RB H-Gen eingefügt. Mittels der FACS-Analyse konnten die Aminosäureänderungen identifiziert werden, die für die Bindung der jeweiligen Antikörper verantwortlich sind. Sie befinden sich nach einem Strukturmodell der H-Proteine (Langedijk et al., 1997) im Membran-distalen Teil, den so genannten Propellern. Im Einzelnen sind folgende Aminosäureänderungen im Hämagglutinin-Protein für den Escape verantwortlich: L77 – 377 Arg -> Gln und 378 Met -> Lys; Nc32 – 388 Gly -> Ser; K71 – 492 Glu -> Lys und 550 Ser -> Pro; K29 – 535 Glu -> Gly. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die beiden Aminosäureveränderungen an den Positionen 195 und 200 gemeinsam für die Neurovirulenz verantwortlich sind und nicht assoziiert sind mit den Mutationen für den Antikörperescape. Der Aminosäureaustausch an Position 200 bei neurovirulenten Viren führt zum Verlust einer benutzten Glykosylierungsstelle. Diese Mutation ist jedoch nicht alleine für das unterschiedliche Neurovirulenzverhalten der Viren verantwortlich, sondern es muss gleichzeitig der Austausch an Position 195 vorhanden sein, der eine positive Ladung im H-Molekül entfernt. Diese beiden Mutationen sind nach dem Strukturmodell nach Langedijk im Stamm2-Bereich angesiedelt. Sind im H-Protein an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Gly und Ser vorhanden, so findet im Gehirn neugeborener Lewis-Ratten eine verstärkte Virusvermehrung und Ausbreitung statt, die die akute Enzephalitis mit Expression typischer proinflammatorischer Zytokine zur Folge hat. Werden an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Arg und Asn exprimiert, so ist der Verlauf der Infektion inapparent. In dieser Arbeit wurde auch ein Zellkultursystem gemischter Hirnzellen neugeborener Lewis-Ratten etabliert, das die Unterschiede der Virusausbreitung in vivo reflektiert und mit dem weitere Untersuchungen zum Mechanismus der Neurovirulenz durchgeführt werden könnten. Anhand der durchgeführten Untersuchungen mit Ratten des CD46 transgenen Lewis-Modells konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit des Rezeptors CD46 das Virulenzverhalten der getesteten Viren nicht beeinflusst. Weder mit dem Vakzinestamm Edm noch mit einem nicht an Nager adaptierten Wildtypstamm, konnte nach intracerebraler Injektion eine akute Enzephalitis induziert werden. Die Untersuchungen zeigen, dass die Neurovirulenz des an Nager-adaptierte MV-Stammes CAM/RB essentiell von den Aminosäuren Gly und Ser an Position 195 und 200 im H-Protein abhängt und nicht durch die transgene Expression zellulärer Rezeptoren für MV vermittelt werden kann.