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Aufklärung des Pathomechanismus bei der pmn-Mausmutante, einem Mausmodell für Motoneuronerkrankungen
(2007)
Die pmn-Maus dient als Modell für degenerative Motoneuronerkrankungen: Während heterozygote Mäuse klinisch unauffällig sind, entwickeln homozygote einige Anzeichen, wie man sie auch bei humanen Motoneuronerkrankungen findet. Ab der 2. postnatalen Woche weisen sie eine progrediente Schwäche der Hinterläufe auf. Innerhalb kurzer Zeit sind auch andere Muskelgruppen betroffen, was zwischen der 4. und 6. postnatalen Woche zum Tod durch Atemversagen führt. Verantwortlich für die Erkrankung der pmn-Mäuse ist eine Punktmutation im Tubulin-spezifischen Chaperon E (tbce) Gen, die zu einem Aminosäureaustausch an einer evolutionär konservierten Aminosäure im TBCE-Protein führt. TBCE wird ubiquitär exprimiert und spielt eine Rolle bei der Assemblierung der Mikrotubuli. Phänotypisch sind von der Mutation spezifisch Motoneurone betroffen. Nach der Herstellung und Charakterisierung eines Antiserums gegen TBCE war es möglich, nach Unterschieden zwischen pmn-mutierten und wildtypischen Motoneuronen hinsichtlich der Stabilität und der subzellulären Lokalisation des TBCE Proteins zu suchen. Western Blot Analysen mit Rückenmarkslysaten von vier Wochen alten pmn-Mäusen zeigen eine deutliche Reduktion der TBCE-Expression. Mittels Immunfluoreszenz waren in isolierten embryonalen Motoneuronen indes keine Unterschiede hinsichtlich der Expressionsstärke und der subzellulären Lokalisation festzustellen. Das TBCE-Protein wird überwiegend im Zellsoma exprimiert und befindet sich dort im Golgi-Apparat und an den Centrosomen, die als Generatoren der axonalen Mikrotubuli angesehen werden. Obwohl mittels Immunfluoreszenz zu diesem Zeitpunkt keine Unterschiede detektierbar sind, weisen die pmn-mutierten Motoneurone nach sieben Tagen in Kultur einige axonale Pathologien auf, wenn sie in Gegenwart des neurotrophen Faktors BDNF kultiviert werden: Das Längenwachstum der Axone ist deutlich reduziert und entlang der Axone finden sich zahlreiche axonale Schwellungen mit Proteinaggregaten. Elektronenmikroskopisch findet sich eine Reduktion der Mikrotubulianzahl im proximalen Axonabschnitt, während die medialen und distalen Teile eine unveränderte Anzahl an Mikrotubuli aufweisen. Parallel findet sich in allen Axonabschnitten der pmn-mutierten Motoneurone eine deutliche Zunahme an Neurofilamenten. Neben den morphologischen Veränderungen weisen die Motoneurone aus pmn-Mäusen zu diesem Zeitpunkt auch eine Störung im axonalen Transport der Mitochondrien auf, die in den Axonen saltatorisch und bidirektional entlang von Mikrotubuli transportiert werden, auf. So ist die Anzahl stationärer Mitochondrien in pmn-mutierten Motoneuronen signifikant erhöht, während die Anzahl an transportierten Mitochondrien und deren maximale Transportgeschwindigkeit reduziert ist. Die morphologischen Veränderungen und die Störungen im axonalen Transport können kompensiert werden, wenn die pmn-mutierten Motoneurone statt mit BDNF mit dem neurotrophen Faktor CNTF kultiviert werden. Die Effekte von CNTF auf das Längenwachstum der Axone ist STAT3 vermittelt, da pmn-mutierte Motoneurone mit einer STAT3-Defizienz keine Reaktion mehr auf die Gabe von CNTF zeigen. Da STAT3 direkt mit Stathmin interagieren kann und dessen destabilisierende Wirkung auf Mikrotubuli dadurch verhindert, wurde angenommen, dass die STAT3 vermittelten CNTF Effekte auf eine lokale Wirkung von STAT3 in Axonen zurückzuführen ist. Diese Hypothese wird dadurch gestützt, dass die Herunterregulation der Stathmin Expression in pmn-mutierten Motoneuronen den gleichen Effekt auf das Längenwachstum zeigt, wie eine CNTF Gabe während der Kultivierung.
Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes besitzt die Fähigkeit, eukaryotische Wirtszellen zu penetrieren, sich in diesen zu vermehren, fortzubewegen und zwischen den Zellen auszubreiten. Im Zuge des intrazellulären Lebenszyklus gehen Listerien Wechselwirkungen mit ver-schiedenen zellulären Proteinen ein. Als eines dieser Proteine konnte das zelluläre Phosphoprotein Stathmin identifiziert werden. Dieses Protein bindet an Untereinheiten des Tubulins und destabilisiert dadurch Mikrotubuli (MT). Es wird durch Phosphorylierung von vier spezifischen Serinresten in seiner MT-destabilisierenden Aktivität reguliert. Da Stathmin als Antwort auf externe Signale zelluläre Funktionen, z. B. Zell-Proliferation und Differenzierung reguliert, vermutet man seine Funktion in einer Art Relais welches verschiedene Signale aus dem Umfeld der Zelle integriert. In mit L. monocytogenes infizierten Wirtszellen wird Stathmin an die Oberfläche intrazellulärer Bakterien rekrutiert. Inwiefern diese Rekrutierung das Phosphorylierungsmuster von Stathmin und damit dessen Aktivität beeinflusst, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Stathmin knock-out Mäuse sollten sich gut eignen, um die Rolle von Stathmin während einer Infektion mit L. monocytogenes EGD in vitro und in vivo zu untersuchen. Es stellte sich heraus, dass in Stathmin(-/-)-Makrophagen der intrazelluläre Lebenszyklus der Listerien nicht signifikant beeinflusst ist. Nach intravenöser Verabreichung von 5x103 L. monocytogenes waren drei Tage nach der Infektion in Leber und Milz der knock-out Mäuse allerdings signifikant mehr Listerien nachzuweisen, als in den Organen wildtypischer Mäuse. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und einem anti-Stathmin-Antiersum konnte an mit verschiedenen L. monocytogenes-Mutanten infizierten Zellen gezeigt werden, dass Stathmin mit der Oberfläche intrazellulärer Listerien kolokalisiert. Allerdings konnten dabei die Angaben in der Literatur nicht bestätigt werden, wonach für diese Kolokalisation die Expression von ActA notwendig ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen im Gegensatz zu den publizierten Daten dafür, dass Stathmin über einen bisher noch unbekannten Mechanismus ActA-unabhängig an intrazelluläre Listerien rekrutiert wird. Zweikomponentensysteme ermöglichen Bakterien eine rasche Anpassung an sich verändernde Umweltbedingungen, da sie extra- und intrazelluläre Stimuli in zelluläre Signale umwandeln. Um die 16 in der Genomsequenz von L. mono-cytogenes EGDe identifizierten Zweikomponentensysteme charakterisieren zu können, wurden individuelle Mutanten konstruiert, in denen individuelle Response Regulatorgene deletiert sind. Die erhaltenen Mutanten wurden in vitro und in vivo auf ihr Wachstumsverhalten hin untersucht. Es zeigte sich, dass unter den angewandten Kultur- und Versuchsbedingungen keines der Zweikomponentensysteme eine signifikante Rolle bei der Anpassung an Temperatur, sowie an oxidativen oder osmotischen Stress spielt. Die Zugabe von 5 % Ethanol hatte einen stark hemmenden Effekt auf das Wachstum von 4 Mutanten, wohingegen zwei andere Mutanten in Gegenwart des Alkohols deutlich besser wuchsen. Unter anaeroben Bedingungen konnte kein Unterschied im Wachstum beobachtet werden. Die Expression wichtiger Virulenzgene war in keiner der untersuchten Mutanten im Vergleich zum Ausgangsstamm verändert. Die intrazelluläre Replikation sowie intrazelluläre Bewegung und Ausbreitung im Zellrasen waren durch die Deletion der Response Regulatorgene nicht beeinträchtigt. Abgesehen von geringen Unterschieden in der Invasivität einiger Deletionsmutanten für Cos-1 und Caco-2 Zellen zeigte sich keiner der Response Regulatoren für den intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes erforderlich. Es zeigte sich, dass der in der vorliegenden Arbeit verwendete L. monocyto-genes-Wildstamm auch bei der für die Flagellenexpression normalerweise nicht-permissiven Temperatur von 37° C noch beweglich ist. Die L. monocytogenes ΔdegU-Mutante war dagegen auf Weichagar temperaturunabhängig unbeweglich. Die elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass dieser Stamm im Gegensatz zum Wildtyp auch bei 24° C keine Flagellen ausbildet. Durch vergleichende Proteomanalysen konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes ΔdegU bei 24° C wesentliche Proteine des Flagellenapparates nicht synthetisiert. Mittels Transkriptomanalysen konnten die Ergebnisse der Proteomanalysen bestätigt werden. Es wurden neben Genen, die für Proteine der Flagellenbiosynthese und Chemotaxis codieren, noch weitere Gene identifiziert, die offensichtlich unter der transkriptionellen Kontrolle des Response Regulators DegU stehen. Die Ergebnisse der in vivo Studien zeigten, dass L. monocytogenes ΔdegU deutlich virulenzattenuiert ist. Für die restlichen L. monocytogenes ΔTCS-Mutanten waren im Vergleich zum Wildtyp die Unterschiede in Leber und Milz nur leicht verändert und statistisch nicht signifikant.