Refine
Has Fulltext
- yes (1)
Is part of the Bibliography
- yes (1)
Year of publication
- 2008 (1)
Document Type
- Doctoral Thesis (1)
Language
- German (1) (remove)
Keywords
- Zidovudin (1) (remove)
Institute
- Institut für Virologie und Immunbiologie (1) (remove)
AZT-Resistenz bei Foamyviren
(2008)
Azidothymidin (AZT) ist ein nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NRTI), der bei HIV-Infektionen in Kombination mit anderen antiretroviralen Substanzen eingesetzt wird. AZT zeigt darüberhinaus auch eine gute Wirksamkeit gegen Foamyviren, eine Subfamilie der Retroviren mit charakteristischen Besonderheiten in ihrer Molekularbiologie und ihrem Replikationszyklus, deren Vertreter verschiedene Affenarten und andere Säugetiere infizieren, wobei sie sich sowohl im jeweils natürlichen Wirt als auch bei seltener zufälliger Infektion des Menschen apathogen zeigen. In der vorliegenden Arbeit wurde das AZT-resistente Foamyvirus SFVmacAZTres untersucht, das in Anwesenheit steigender AZT-Konzentrationen in Zellkultur selektiert worden war. Hierzu wurde SFVmacAZTres zunächst einer genotypischen Analyse unterzogen, wobei im Vergleich mit der wildtypischen Ausgangssequenz zwei Mutationen in gag und vier Mutationen in pol nachgewiesen wurden, die zu Änderungen auf Aminosäureebene führten. Mittels PCR wurden Fragmente, die alle sechs Mutationen oder nur die vier pol-Mutationen enthielten, aus der Sequenz von SFVmacAZTres amplifiziert und jeweils in einen SFVmac-Klon eingefügt. Im weiteren Verlauf zeigte sich dabei kein Unterschied zwischen diesen beiden Konstrukten bezüglich der Replikation in Abwesenheit oder Anwesenheit von AZT, so dass gefolgert werden konnte, dass die gag-Mutationen keinen Beitrag zur AZT-Resistenz leisten. Die pol-Mutationen befanden sich sämtlich im für die Reverse Transkriptase kodierenden Bereich und führten zu den Aminosäuresubstitutionen K211I, I224T, S345T und E350K. An Position 224 fand sich dabei in einer veröffentlichten Sequenz bereits ein Threonin, so dass hier unabhängig von der Selektion in Anwesenheit von AZT möglicherweise ein Polymorphismus vorliegt. Der Vergleich der vier Mutationen der RT von SFVmacAZTres mit den bei HIV bekannten Mustern an Mutationen wie den TAMs und dem Q151M-Komplex zeigte keine Übereinstimmungen. Um den jeweiligen Beitrag der vier nachgewiesenen pol-Mutationen zur AZT-Resistenz zu untersuchen, wurden sie einzeln und in Kombinationen mittels zielgerichteter Mutagenese in einen SFVmac-Klon eingefügt und die entsprechenden Konstrukte auf ihre Replikation in Abwesenheit und Anwesenheit von 0,5 µM, 5µM und 50 µM AZT untersucht. Hierfür wurden 293T-Zellen mit dem jeweiligen Plasmid transfiziert und nach Überprüfung der gleichmäßigen Expression von Gag und Pol mittels Western Blot der virushaltige Überstand auf Zielzellen gegeben und der Titer ausgezählt. Es konnte gezeigt werden, dass keines der Konstrukte mit Einzel , Doppel- und Dreifachmutationen eine ähnlich ausgeprägte AZT-Resistenz wie die Vierfachmutante aufwies, allerdings einige in unterschiedlichen Ausmaß teilresistent waren, während andere weder ohne noch mit AZT gut replizierten. S345T erwies sich vor E350K als die Mutation mit dem größten Beitrag zur AZT-Resistenz, I224T erhöhte den Titer in Abwesenheit und Anwesenheit um etwa den gleichen Faktor, wohingegen sich K211I in den meisten Kombinationen eher negativ auswirkte. Der Klon, in den alle vier Mutationen mittels zielgerichteter Mutagenese eingeführt worden waren, zeigte die gleiche AZT-Resistenz wie das in Zellkultur selektierte Virus. Damit war gezeigt, dass diese vier Mutationen sowohl notwendig als auch hinreichend für die AZT-Resistenz von SFVmacAZTres sind. Die pol-Mutationen von SFVmacAZTres wurden weiterhin soweit möglich an entsprechenden Stellen in Klon des prototypischen Foamyvirus PFV eingeführt, bei dem es zuvor nicht gelungen war, ein resistentes Isolat in Zellkultur zu generieren. Das PFV-Konstrukt mit den Mutationen aus SFVmacAZTres zeigte sich jedoch nicht AZT-resistent, sondern wies einen Replikationsdefekt auf. Einige HIV-Mutationen, die in den PFV-Klon eingefügt wurden, führten ebenfalls zu keiner AZT-Resistenz. Es bestehen also bezüglich AZT-Resistenz und damit gewisser Eigenschaften der Reversen Transkriptase deutliche Unterschiede zwischen PFV und SFVmac. Die durchgeführten Arbeiten stellen die Grundlage für weitere Untersuchungen dar, in denen beispielsweise dem biochemischen Mechanismus der AZT-Resistenz von SFVmacAZTres nachgegangen werden kann. Die gewonnenen Erkenntnisse können zum Verständnis allgemeiner Mechanismen der NRTI-Resistenz bei Retroviren ebenso beitragen wie zur weiteren Charakterisierung der foamyviralen Reversen Transkriptase an sich.