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Die Plastizität von Nozizeptoren kann eine der Ursachen für neuropathische Schmerzen sein. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der Capsaicinempfindlichkeit und der Galaninexpression in einzelnen Spinalganglionneuronen unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Diese Eigenschaften wurden gewählt, weil beide nach experimentellen Nervenverletzungen starken Veränderungen unterliegen und weil beide über „nerve growth factor“ reguliert werden. Neurone von Ratten mit experimenteller Axotomie oder „chronic constriction injury“ des N. ischiadicus wurden mit entsprechenden Neuronen von unverletzten Ratten unter Kulturbedingungen verglichen. Der gleichzeitige Nachweis beider Eigenschaften erfolgte in isolierten Neuronen durch eine Doppelfärbung, bei der die Capsaicinempfindlichkeit mittels Kobaltaufnahme und die Galaninexpression immunzytochemisch nachgewiesen wurden. Mit zunehmender Dauer einer Axotomie und mit zunehmender Dauer in Kultur sank der Anteil capsaicinempfindlicher Neurone. Gleichzeitig kam es zu einer starken Hochregulation von Galanin. Diese Effekte waren in vitro durch die Zugabe von „nerve growth factor“ oder „glial cell line-derived neurotrophic factor“ reversibel. Mit zunehmender Dauer einer „chronic constriction injury“ hingegen veränderten sich diese Populationen nicht. Die Analyse doppeltgefärbter Neurone ergab, daß nach einer Axotomie kein einziges Neuron gleichzeitig capsaicinempfindlich und galaninerg war. Unter bestimmten Kulturbedingungen sah man jedoch vereinzelt eine Doppelfärbung. Die nach einer Axotomie de novo galaninergen Neurone hatten ein Größenverteilungsprofil, das demjenigen von unverletzten capsaicinempfindlichen Neuronen stark ähnelte. Aus der Literatur ist bekannt, daß die Hochregulation von Galanin das Vorhandensein capsaicinempfindlicher Neurone voraussetzt. In dieser Arbeit wird daher die Hypothese aufgestellt, daß die nach einer Axotomie galaninergen Neurone zuvor capsaicinempfindlich gewesen sein müssen. Dies impliziert, daß im einzelnen Neuron die Hochregulation von Galanin erst nach einer Herabregulation der Capsaicinempfindlichkeit geschieht. Ob diese Sequenz eine funktionelle Bedeutung hat, bedarf weiterer Untersuchungen. Es liegt nahe, daß Galanin als Markerpeptid gelten kann, mit dem in künftigen Untersuchungen neuropathischer Zustände der Nozizeption diejenigen Neurone identifiziert werden können, die zuvor im unverletzten Zustand capsaicinempfindliche Nozizeptoren waren.
In dieser Arbeit wurde die Wirkung der ungesättigten Fettsäure Arachidonsäure, des Endocannabinoids Anandamid und des synthetischen Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten WIN55,212-2 auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 untersucht. Dazu wurden an Xenopus Oozyten, denen die entsprechende Kanal-RNA injiziert wurde, in der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme elektrophysiologische Messungen durchgeführt. Zunächst wurden für alle drei Substanzen Dosis-Wirkungs-Beziehungen bestimmt. Diese führten zu folgenden Ergebnissen: • TASK-1 wird durch WIN55,212-2 um bis zu ca. 81% gehemmt. Die IC50 beträgt 0,83 µM. Anandamid besitzt eine IC50 von 1,92 µM und hemmt den Strom um bis zu ca. 71%. Bei WIN55,212-2 bzw. bei Anandamid liegt mit einem Hill-Koeffizienten (nH) von 1,65 bzw. von 1,42 positive Kooperativität vor. Arachidonsäure hingegen inhibiert den Strom nur um bis zu ca. 63%. Die IC50 beträgt 11,3 µM. Der Hill-Koeffizient von 0,9 ergibt negative Kooperativität. • TASK-3 wird durch alle drei Substanzen deutlich weniger inhibiert. Die maximale Inhibition durch WIN55,212-2 [10µM] beträgt 32,4% (± 9,7). Fünf µM Anandamid bzw. 80 µM Arachidonsäure verursachen eine Hemmung um 32,1% (± 5,4) bzw. um 20,3% (± 5,5). Bei beiden Kanalproteinen wurde außerdem untersucht, welche Bedeutung den Aminosäuren in Position 243-248, die bei TASK-1 und TASK-3 mit Ausnahme einer Aminosäure übereinstimmen, bei der Wirkung von Cannabinoiden zukommt. Dazu wurden Mutationsstudien im Bereich des C-Terminus von TASK-1 und TASK-3 durchgeführt. • Es wurden die sechs Aminosäuren in Position 243-248 aus TASK-1 bzw. TASK-3 entfernt (TASK-1 [243-248] bzw. TASK-3 [243-248]). Die inhibitorische Wirkung von WIN55,212-, Anandamid und Arachidonsäure war bei TASK-1 [243-248] deutlich vermindert, während es bei TASK-3 [243-248] zu unterschiedlichen Effekten kam. • Der gesamte C-Terminus des TASK-1 wurde entfernt, mit Ausnahme der sechs Aminosäuren in Position 243-248. Außerdem wurden die endständigen Aminosäuren RSSV an das Restprotein angefügt, da diese für einen gut funktionierenden Transport in die Membran notwendig sind (TASK-1 [249-390RSSV]. Die Wirkungen von WIN55,212-2, Anandamid und Arachidonsäure entsprachen bei dieser Mutante denen, die beim TASK-1 [Wildtyp] beobachtet wurden. • Durch Punktmutation wurde beim TASK-3 Leucin an Position 247 durch Methionin ersetzt (TASK-3 [L247M]. Diese Mutante besitzt dadurch in Position 243-248 das gleiche Sequenzmotiv wie der TASK-1. Im Vergleich zum TASK-3 [Wildtyp] waren die Wirkungen der Cannabinoide bei dieser Mutante jedoch unverändert. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die untersuchten Cannabinoide eine rezeptorunabhängige, spezifische und reversible inhibitorische Wirkung auf die Tandemporenkaliumkanäle TASK-1 und TASK-3 haben. Die Aminosäuren in Position 243-248 sind für diese Wirkung der Cannabinoide von wesentlicher Bedeutung.
Hintergrund: Der weitverbreitete und karzinogene Pilzmetabolit Ochratoxin A (OTA) beeinflußt die Funktion und das Wachstumsverhalten renaler Zellen. In höheren Konzentrationen reduziert OTA auch die Integrität der Zellen. Untersucht wurde die mögliche Beteiligung von Änderungen der zellulären Calciumhomöostase an den Wirkungen von OTA in nanomolaren Konzentrationen. Methoden: Immortalisierte menschliche Nierenepithelzellen (IHKE) wurden verwendet, um die Effekte von OTA auf die zytosolische Calciumhomöostase ([Ca2+]i), Zellwachstum und und -integrität zu untersuchen. 1 nmol/l OTA potenzierte Ca2+-abhängig die EGF- und Ang II-induzierte Zellproliferation. Ca2+-unahängige Zelluntergänge und Reduktion der Zellzahl konnte nur nach 24-stündiger Inkubation mit einer Schwellenkonzentration von >10 nmol/l beobachtet werden. Innerhalb von Sekunden wurden durch OTA reversible und konzentrationsabhänige [Ca2+]i-Oszillationen mit einer Schwellenkonzentration von 0.1 nmol/l hervorgerufen. Die Oszillationen wurden durch Reduktion des extrazellulären Ca2+, den Ca2+-Kanalblocker SK&F 96365 und durch Hemmung der der Phospholipase C verhindert. Der durch OTA hervorgerufene Ca2+-Einstrom war auch nach Entleerung von Ca2+-Speichern durch Schwellenkonzentration das ebenfalls die Oszollationen hemmte, noch vorhanden. Zusätzlich steigerte OTA den Füllungszustand von Thapsigargin-empfindlichen Ca2+-Speichern und stimulierte die Aktivität der Thapsigargin-empfindlichen Ca2+-ATPase. Eine 10-minütige Inkubation mit OTA erhöhte den zellulären cAMP-Gehalt dosisabhängig. Der Proteinkinase A Inhibitor H-89 unterdrückte die OTA-induzierten Ca2+- Oszillationen. 1 nM OTA potenzierte die Effekte von Angiotensin II und EGF auf [Ca2+]i. Schlußfolgerungen: (i) OTA beeinträchtigt in niedrig-nanomolaren Konzentrationen, die im Rahmen der natürlichen Exposition auftreten können, reversibel die Ca2+-Homöostase in menschlichen proximalen Tubuluszellen. (ii) OTA verursacht dosis-abhängige [Ca2+]i-Oszillationen die auf OTA-induzierten Ca2+-Einstrom und Thapsigargin-sensitive Ca2+-Speicher angewiesen sind. (iii) Ferner interagieren niedrig-nanomoler Konzentrationen von OTA mit hormonellen Ca2+-Signalen, was z.B. zu einem veränderten zellulären Proliferationsverhalten führt. (iv) Die Verminderung der Zellintegrität durch höhere OTA-Konzentrationen hängt nicht von Veränderungen der Ca2+-Homöostase ab. (v) Die durch OTA hervogerufene renale Dysfunktion scheint, zumindest teilweise, auf Wechselwirkungen mit zellulären Signaltransduktionsmechanismen zu beruhen und nicht auf Zellzerstörung.
Aktive Zonen (AZs) sind hoch spezialisierte, subzelluläre Kompartimente von Neuronen, die der synaptischen Übertragung dienen. Sie enthalten Gerüstproteine wie RIM (Rab3 interacting molecule) sowie elektronendichte Projektionen bestehend aus Bruchpilot bei Drosophila melanogaster oder Bassoon im Säuger, welche Schlüsselkomponenten des Vesikelverkehrs darstellen. Bei der Fliege sind Anzahl und Verteilung von Bruchpilot-Molekülen in AZs relevant für die funktionelle Differenzierung. Ihre Anordnung wird im Abstand von weniger als einem Mikrometer innerhalb einer präsynaptischen Endigung reguliert.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden elektrophysiologische Ableitungen und konfokale sowie höchstauflösende, immunhistochemische Bildgebung mit dem dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Verfahren an larvalen, neuromuskulären Synapsen von Drosophila durchgeführt. Dabei wurde das genetische Potenzial des Modellorganismus genutzt, um relevante Proteinfunktionen und -interaktionen zu analysieren.
RIM als zentrale Komponente Aktiver Zonen ist relevant für synaptische Plastizität. Eine als CORD7 (cone-rod dystrophy type 7) bezeichnete Punktmutation (Arginin zu Histidin) innerhalb der 310 Helix der C2A-Domäne von RIM wurde mit erhöhten kognitiven Fähigkeiten einer Patientengruppe in Verbindung gebracht. Weil die Drosophila C2A-Domäne eine hohe Homologie zur Säugerdomäne aufweist, konnte der Einfluss dieser Mutation auf Struktur und Funktion von Synapsen untersucht werden. Es zeigte sich, dass der Aminosäureaustausch der CORD7-Position und des benachbarten Arginin-Restes die synaptische Organisation und Transmission beeinflussen.
In einer Reihe weiterer Experimente wurde das Zusammenspiel von Bruchpilot und Synaptotagmin, dem Calciumsensor der evozierten Transmitterfreisetzung, analysiert. Während AZs ohne Bruchpilot auch ohne Synaptotagmin funktionieren, führt dessen Reduktion zu einer Umverteilung von Bruchpilot-Molekülen innerhalb von AZs und zu dramatischen Änderungen in ihrer Anzahl. Abschließend wurde so ein Beitrag zum Verständnis der molekularen Organisation synaptischer Informationsverarbeitung und Plastizität geleistet, wobei zu klären bleibt, wie die zuverlässige Speicherung von Informationen an AZs erreicht werden kann.
Kernpunkt dieser Arbeit ist die interessante pharmakologische Regulation der 2PDK+- Kan�le durch Inhalationsan�sthetika. �ber die molekularen Grundlagen dieser Interaktion und deren Bedeutung in vivo ist noch immer sehr wenig bekannt. Am Beispiel von Halothan, das in der aktuellen Literatur in diesem Zusammenhang am h�ufigsten verwendete Inhalationsan�sthetikum, soll im Hauptteil der Arbeit mit elektrophysiologischen Methoden die Wirkung der Inhalationsan�sthetika auf den Aktivit�tszustand der unterschiedlichen Subgruppen der 2PD-K+-Kan�le beschrieben werden. Die in Xenopus-Oozyten exprimierten 2PD-K+-Kan�le dienen hierbei als Modell nativer 2PD-K+-Kan�le. Es wird eine pharmakologische Konzentrations-Wirkungs-Beziehung erstellt, mit der anschlie�end R�ckschl�sse auf die Bedeutung der 2PD-K+-Kan�le f�r die Vermittlung der Narkose gezogen werden k�nnen. Es soll auch untersucht werden, ob diese Halothanwirkung durch andere physiologische Regulatoren der 2PD-K+- Kan�le beeinflusst wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit soll anhand von Mutagenese bestimmter Kanalabschnitte der molekulare Wirkmechanismus von Halothan genauer charakterisiert werden: Liegt dem beobachteten Ph�nomen eine Ligandenbindung nach dem Schl�ssel-Schloss-Prinzip zugrunde oder vermitteln kompliziertere Mechanismen, etwa ein Ionenkanal-Gate oder komplexe intrazellul�re Signalwege, die Wirkung von Halothan auf die 2PD-K+-Kan�le?
Die Niere stellt das wichtigste Zielorgan für die Akkumulation von anorganischem Quecksilber dar. Versuche an Ratten ergaben, dass bereits wenige Stunden nach Injektion einer geringen Menge Quecksilberchlorid 50% dieser Dosis in den Nieren akkumuliert war. Durch verschiedene Untersuchungen wurden die proximale Tubuli (Pars convoluta et recta) als Ort der Quecksilber-Anreicherung identifiziert. Der Schwermetallchelator DMPS (2,3-Dimercapto-1-Propansulfonsäure) ist heutzutage das Mittel der Wahl für die Behandlung von Vergiftungen mit anorganischem Quecksilber. DMPS hat sich gegenüber dem früher verwendeten BAL aus mehreren Gründen als überlegen erwiesen: in klinischen Tests bezüglich der Quecksilberentgiftung zeigt DMPS die größere Wirksamkeit, kann oral angewendet werden und ist zudem weitaus weniger toxisch als sein Vorgänger BAL. Jedoch war der Wirkmechanismus von DMPS nicht genau bekannt. Allerdings existieren zahlreiche in-vivo- und in-vitro-Studien, die zeigen, dass das organische Anion DMPS ein Substrat des „klassischen Organische-Anionen-Transportsystems“ bzw. des 1997 klonierten, tertiär aktiven Anionenaustauschers OAT1 sein könnte. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine direkte Interaktion zwischen DMPS und OAT1 stattfindet und DMPS ein Substrat von OAT1 ist. Von entscheidendem Interesse war dabei die Frage, ob der Redoxzustand von DMPS (reduziert-monomer, oxidiert-dimer) einen Einfluß auf einen möglichen Transport durch OAT1 hat. Darüber hinaus sollte die Rolle von Albumin, welches unter physiologischen Bedingungen im Blutkreislauf des Menschen in hoher Konzentration vorhanden ist, bei diesem Vorgang geklärt werden. In einem zweiten Teil lag das Interesse auf den Mechanismen, die DMPS und v.a. den intrazellulär gebildeten Quecksilber-DMPS-Komplex (Hg-DMPS-Chelat) aus der Tubuluszelle sezernieren und damit aus dem Organismus eliminieren. Dabei sollte insbesondere die Rolle des apikal lokalisierten, passiven Transporters OAT-K2 („kidney-specific“ Organische-Anionen-Transporter 2) geklärt werden. Die Untersuchung der Transportvorgänge an hOAT1 (menschliches Ortholog von OAT1) und OAT-K2 wurden an Xenopus laevis Ooztyen, HeLa-Zellen sowie OK-Zellen durchgeführt Das organische Anion DMPS war sowohl in reduzierter als auch in oxidierter Form in der Lage, den Transport von PAH kompetitiv zu hemmen: Ki (reduziertes DMPS) = 22.4 mM bzw. Ki (oxidiertes DMPS) = 66.0 mM DMPS-Äquivalente. Bei Anwesenheit von 0.1mM Albumin erlosch die Hemmung des PAH-Transports durch reduziertes und oxidiertes DMPS vollständig. Albumin alleine hatte hingegen keinen Einfluß auf den PAH-Transport durch hOAT1. Die Transstimulations-Experimente an hOAT1-transfizierten HeLa-Zellen zeigten, dass reduziertes und oxidiertes DMPS den Efflux von PAH stimulieren konnten: innerhalb von drei Minuten wurden so 10 bzw. 8% des PAH-Zellgehaltes aktiv über hOAT1 aus der Zelle sezerniert. Das Hg-DMPS-Chelat hatte im Gegensatz zu den beiden Einzelkomponenten Quecksilber und DMPS keinen hemmenden Einfluß auf den PAH-Transport in Oozyten. Damit hat der Komplex auch keine Affinität zu hOAT1, womit der basolaterale Weg für die Elimination des gebundenen Quecksilbers aus der Zelle keine Rolle spielt. Untersuchungen an OAT-K2 konnten aufgrund eines zu niedrigen Expressionsniveaus des Transporters in Oozyten und MDCK-Zellen nicht durchgeführt werden. OK-Zellen, die OAT1 aufgrund ihres Ursprungs aus dem proximalen Tubulus des Opossums endogen exprimieren, waren in der Lage, reduziertes DMPS transzellulär zu sezernieren. Ein Teil dieses Transports konnte durch PAH inhibiert werden. Damit zeigte sich nicht nur, dass hOAT1 DMPS als Substrat für den Transport über die basolaterale Membran akzeptiert, sondern darüber hinaus auch, dass in der apikalen Membran der Tubuluszelle Transporter lokalisiert sind, die DMPS in das Tubuluslumen sezernieren können. Die vorliegenden Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass hOAT1 eine tragende Rolle im Wirkmechanismus des Quecksilberantidots DMPS spielt: hOAT1 ist entscheidend am Transport von DMPS an den Ort der Vergiftung, die proximale Tubuluszelle, beteiligt. Dabei spielt es keine Rolle, ob die reduzierte oder oxidierte Form am Transporter vorliegt, da beide nachweislich Substrate von hOAT1 sind. Von wesentlicher Bedeutung ist die lockere Bindung von DMPS an Albumin, die DMPS einerseits vor einer raschen glomerulären Filtration bewahrt, andererseits aber durch einfaches Abdiffundieren eine rasche Gleichgewichtseinstellung mit dem perivaskulären Intersitium der Niere und anschließenden Transport in die Tubuluszelle erlaubt. Das intrazellulär gebildete Hg-DMPS-Chelat hat im Gegensatz zu DMPS keine Affinität zu hOAT1, wodurch eine Rückkehr des mobilisierten Quecksilbers in den Körperkreislauf auf diesem Weg verhindert wird.
Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten Mäusen
(2013)
Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung für das vaskuläre System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht hauptsächlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-ähnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges für die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskulären Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) führt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. Überraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterführende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie nähergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, während sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungeklärt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivität der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollständigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivität: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die Stärke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren können. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis für cGMP unabhängige Effekte nutzen sollte.
Ziel dieser Arbeit war die biophysikalische Charakterisierung der Bindekomponente des Epsilon-Toxins und der Epsilon-Toxin-Mutanten mit Hilfe künstlicher Lipid-Bilayer-Messungen. Es galt herauszufinden, welcher Teil des Epsilon-Toxins für die Kanalbildung verantwortlich ist, um somit die kanalbildende Domäne definieren zu können. Um diese ermitteln können, wurden in der Arbeit vier Epsilon-Toxin Mutanten untersucht, bei denen in dieser potentiellen Porendomäne Punktmutationen eingefügt worden sind. Diese werden Epsilon-Toxin 700, 701, 702 und 703 genannt. Im Vergleich von Wildtyp und Mutanten hat sich gezeigt, dass sich die Werte der Einzelkanalleitfähigkeit, der Selektivität und der Spannungsabhängigkeit verändert haben. Damit wurde bewiesen, dass die Punktmutationen genau in dem Bereich des Toxins durchgeführt wurden, der für die Kanalbildung verantwortlich sein muss.
Epithelzellen sind entlang einer apico-basolateralen Achse polarisiert. Die korrekte Insertion von Ionenkanälen und Transportproteinen ist für die normale Epithelfunktion unerlässlich. Im Gegensatz dazu sind migrierende Zellen in ihrer Bewegungsebene polarisiert, mit einem Lamellipodium und Zellkörper, die als Vorder- und Hinterende der Zell zu verstehen sind. In vorhergehenden Un- tersuchungen konnte gezeigt werden, dass Ionenkanäle und Transporter in be- stimmten Regionen von migrierenden Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) zu fin- den sind (z. B.: NHE1, Cl/HCO -Austauscher AE2). Diese reichern sich am Vor- derende der MDCK-F-Zellen an. Es war nicht bekannt, wo sich Markerproteine der apikalen Membran wiederfinden. Um dieser Frage nachzugehen, transfizierte ich MDCK-F-Zellen stabil mit dem Kalium-Kanal ROMK2. Dieser wird in der apikalen Membran im Nierensammelbecken expressioniert. Transfizierte Zellklone konnten durch Subcloning und RT-PCR-Experimente mit spezifischen ROMK2-Primern gefun- den werden. Desweiteren wurden Patch-Clamp-Experimente im Ganzzellmodus durch- geführt, um die Insertion von funktionellen ROMK2-Kanälen in die Zellmembran von transfizierten MDCK-F-Zellen nachzuweisen. Die mit dem Kalium-Kanal trans- fizierten Zellen produzieren einen Barium-hemmbaren Kalium-Strom, der in Mock- transfizierten Zellen nicht nachzuweisen war. Mock-transfizierte MDCK-F-Zellen migrieren mit einer Geschwindigkeit von ca 1,1 µm/min. Im Gegensatz dazu re- duziert die Insertion von ROMK2-Kanälen die Migrationsgeschwindigkeit auf 0,7 µm/min.In immunhistochemischen Experimenten konnte eine diffuse Verteilung des ROMK2 in MDCk-F-Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß es für 'apikale' und basolaterale' Proteine verschiedene intrazelluläre Transportwege in die Plasmamembran von migrierenden Zellen gibt.
Die Neurone der medialen Amygdala spielen eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von unkonditionierter Angst und aggressivem Verhalten (Nelson and Trainor, 2007). Ihre Erregbarkeit wird höchstwahrscheinlich durch eine Hintergrundleitfähigkeit von K2P-Kanälen und ihrem molekularen Korrelat reguliert. Bisher sind 15 dieser K2P-Kanäle bekannt. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Expression und die physiologische Funktion des TASK-3, einem säure-sensitivem K2P-Kanal, in dieser Gehirnregion untersucht. Bisher konnte die TASK-3-Expression durch in situ-Hybridisierungen in erwachsenen Ratten gezeigt werden (Karschin et al., 2001). Entsprechend konnten wir einen, dem TASK-3 ähnlichen Strom, durch elektrophysiologische Ganzzellmessungen in akuten Hirnschnitten nachweisen. Um die Beteiligung des TASK-3 an diesem Gesamtstrom zu überprüfen, verwendeten wir den selektiven TASK-3 Antagonisten Ruthenium Rot oder veränderten den extrazellulären pH-Wert auf pH 6,4. Ruthenium-Rot- bzw. pH-sensitive Neurone zeigten ein negativeres Ruhemembranpotential (-56.31 mV ± 1.51; n = 17) als die Neurone, die nicht sensitive für Ruthenium-Rot oder pH-Veränderungen waren (-48.39 mV ± 1.55; n = 13; p = 0.001). Zusätzlich verstärkte Ruthenium Rot die Aktionspotenzialfrequenz und die Aktionspotenzialbreite bei Stromapplikation in den Zellen mit einem positiveren Ruhemembranpotenzial. Unsere in situ-Hybridisierungen in C57/Bl6 Mäusen zeigten eine starke Expression des TASK-3-Kanals in den Neuronen der medialen Amygdala. Darum wurde die Erregbarkeit von TASK-3 Wildtypneuronen mit denen von TASK-3-Knockoutneurone verglichen. Wir konnten einen säuresensitiven Kaliumstrom in den TASK-3 Wildtypzellen identifizieren, welche in den TASK-3 Knockoutzellen abwesend war. Überraschenderweise tauchten keine Unterschiede in der Aktionspotenzialform, dem Ruhemembranpotenzial oder des Rheobasestrom auf. Verhaltenstests zeigten, dass TASK-3 Wildtyp Mäuse auf die Präsentation von TMT, ein Duftstoff aus den Fäkalien von Füchsen, stärker freezen, als TASK-3 Knockoutmäuse. Dies zeigt, dass ein Fehlen des TASK-3 zu einer geringeren Furchtantwort beiträgt. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass TASK-3 bei der zellulären Erregbarkeit von Neuronen der medialen Amygdala von Ratten eine große Rolle spielt. Diese TASK-3-Kanäle sind in der medialen Amygdala von Mäusen ebenso exprimiert, wo sie zur Verarbeitung von Furchtverhalten beitragen.