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Listeria monocytogenes ist ein weit verbreitetes, Gram-positives humanpatho-genes Bakterium, welches in immunsupprimierten Personen das Krankheitsbild der Listeriose auslösen kann. Der Infektionszyklus der Listerien im Wirt ist im Hinblick auf die Pathogenese dieses Erregers intensiv untersucht worden. Die Regulation der verschiedenen beteiligten Virulenzfaktoren unterliegt in L. monocytogenes einer starken Kontrolle, die einerseits durch regulatorische Proteine aber auch durch Umweltfaktoren beeinflusst wird. Die Mechanismen, die auf transkriptionaler wie auch auf translationaler Ebene die Expression verschiedener listerieller Virulenzgene regulieren, wurden kürzlich näher charakterisiert. Es wurden für verschiedene listerielle Virulenzgene Riboswitch-mechanismen zur Expressionskontrolle in Listerien neu beschrieben. Durch Vorarbeiten wurde auch für das inlAB-Operon ein posttranskriptionaler Regu-lationsmechanismus postuliert. Dabei wurde der anaerobe Stoffwechsel der Listerien als möglicher Auslöser für die beobachtete Translationssteigerung des inlA- und inlB-Gens diskutiert. Innerhalb der vorliegenden Arbeit sollte nun weitergehend untersucht werden, in welchem Bereich der Sequenz des inlAB-Operons sich regulatorische Strukturen zur posttranskriptionalen Regulation unter anaeroben Wachstumsbedingungen befinden. Dazu wurden verschiedene Mutanten mit unterschiedlichen Deletionen im inlAB-Operon konstruiert und die Transkription und Translation sowohl des inlA-, als auch des inlB-Gens betrachtet. Eine Deletion im aroA-Gen bewirkt das Wachstum der Bakterien bei anaerobem Stoffwechsel. Diese Deletion wurde in die konstruierten Stämme eingefügt, um die Expression der Gene unter den verschiedenen Wachstumsbedingungen vergleichen zu können. Außerdem wurden verschiedene gus-Reportergen-Fusionsmutanten und Promotor-austauschmutanten konstruiert, um quantitativ aussagekräftigere Daten zu erheben. Die Charakterisierung der Mutanten ließ erkennen, dass keiner der deletierten Bereiche des inlAB-Operons von L. monocytogenes für die beobachtete Translationssteigerung im inlA-Gen bei anaerobem Stoffwechsel verantwortlich zu sein scheint. Das inlB-Gen war innerhalb der hier gezeigten Experimente nicht posttranskriptional reguliert, wie im Vorfeld postuliert. Nach plasmidkodierter Expression verschiedener Bereiche des inlAB-Operons konnte, verglichen mit genomischer Expression, keine Veränderung in der inlA-Expression beobachtet werden. Die mögliche Beteiligung eines potentiellen Regulatorproteins konnte innerhalb dieser Arbeit daher nicht näher eingegrenzt werden. Auch ein Einfluss der regulatorischen Faktoren Hfq und CcpA auf die Expression des InlA Proteins in der L. monocytogenes ΔaroA-Mutante konnte nicht gefunden werden. Es zeigte sich interessanterweise außerdem, dass weitere Virulenzgene wie actA und hly unter den anaeroben Bedingungen ebenfalls eine Translations-steigerung zeigten. Somit stellt sich abschließend die Frage, ob es sich bei der beobachteten Translationssteigerung des inlA-Gens wirklich um einen durch bestimmte Strukturen in der inlAB-mRNA ausgelösten Mechanismus handelt. L. monocytogenes ist als intrazellulär replizierendes, Gram-positives Bakterium interessant für den Einsatz in immun- und tumortherapeutischen Anwendungen. Attenuierte L. monocytogenes-Stämme wurden dazu bereits erfolgreich im Mausmodell als Trägerbakterien für Impfstoffstrategien eingesetzt. Die gezielte Infektion von Geweben ist jedoch aufgrund des wenig ausgeprägten Zelltropismus der Listerien im Wirt bisher ein Problem für einen Einsatz in bakterienbasierten Anwendungen, wie z.B. der Tumor- oder Gentherapie. Innerhalb dieser Arbeit wurden L. monocytogenes-Stämme konstruiert, bei denen chromosomal das für die Integrase codierende Gen gegen das Gen für das Staphylokokken Protein A (SPA) unter der Kontrolle listerieller Promotoren ausgetauscht wurde. Die erfolgreiche Oberflächenlokalisation von Protein A in der Zellwand von Listerien konnte im Western Blot oder in funktionellen Immunfluoreszenzfärbungen in Mikroskop- und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Diese Stämme sollen im Cell Targeting zur gezielten Infektion von Geweben eingesetzt werden. Dazu konnten die Bakterien über Herceptin®-HER2/neu-vermittelte Adhäsion an SK-BR-3-Zellen erfolgreich in diese aufgenommen werden und innerhalb dieser replizieren. Die neu konstruierten Listeria-Stämme zeigten im Mausmodell keine Veränderung in ihrer Virulenz verglichen mit nicht-SPA-exprimierenden Stämmen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Antikörper-Rezeptor-vermittlelte Aufnahme der Listerien in Zellen stellt einen neuen, bisher nicht beschriebenen Mechanismus dar, der in vielen therapeutischen Anwendungen zur Infektion spezifischer Gewebe durch Listerien genutzt werden kann.
Im Genom von Listeria monocytogenes konnten zwei Gene identifiziert werden, die mutmaßlich für niedermolekulare Protein-Tyrosin Phosphatasen (LMW-PTPs) kodieren, Lmo0938/Ptp-1 und Lmo2540/Ptp-2, beide ähneln LMW-PTPs von B. subtilis. Einzel- und Doppeldeletionen der ptp-Gene beeinflussten die Transkription zahlreicher Gene, wie anhand von Gesamtgenom-DNA-Microarray-Analysen und quantitativer RT-PCR gezeigt werden konnten. Insbesondere waren die Gene für i) die Internaline A und B, ii) den Osmoprotektanten-Transporter OpuC, iii) MCP, notwendig zur Flagellen-Bewegung und iv) eine Anzahl von den Proteinen, die in die Nährstoffaufnahme sowie den intrazellulären Metabolismus involviert sind, in vitro herunterreguliert. Die PrfA-regulierten Virulenzgene wurden in den Mutanten verstärkt exprimiert. Im Wesentlichen konnte das gleiche Transkriptionsmuster in infizierten Caco-2-Enterocyten beobachtet werden. Die verringerte Invasivität (abhängig von InlA) und die Unbeweglichkeit der Mutanten passt zu den Transkriptionsergebnissen. Jedoch wurden weder die intrazelluläre Replikation innerhalb eukaryontischer Wirtszellen noch die Resistenz gegen Stressbedingungen durch die Deletion beeinträchtigt. Die Proteome des Wildtyps und der ptp-Mutanten wurden durch 2-dimensionale Gelelektrophorese verglichen und es zeigte sich, dass die Transkriptionsergebnisse nicht vollständig im Proteom reflektiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ptps in die Regulationsnetzwerke des alternativen Stress-Sigmafaktor SigB und von PrfA eingreifen. Der ähnliche Effekt beider Ptps auf die Transkription oder auf den Proteinlevel deutet eine Interaktion oder Kooperation der beiden Enzyme an.
Listeria monocytogenes überwindet endotheliale Barrieren, um eine Meningitis oder Encephalitis auszulösen. Das Hindurchtreten durch diese Barriere könnte über die Invasion von Endothelzellen durch Listerien aus dem Blut und anschließender Freisetzung der Bakterien ins Gehirn erfolgen. In den ersten Infektionsmodellen, in denen gezeigt wurde, daß Listerien in der Lage sind Endothelzellen zu invadieren, wurden humane, makrovaskuläre Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet. Die für die Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen mikrovaskulären Hirnendothelzellen (BMEC) unterscheiden sich aber deutlich von den makrovaskulären HUVEC. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von L. monocytogenes mit HUVEC und mit humanen BMEC (HBMEC) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß L. monocytogenes HBMEC effizient invadieren kann. Nach der Aufnahme und dem Entkommen der Bakterien aus dem Phagosom bilden sie Aktinschweife aus, mit deren Hilfe sie sich im Zytoplasma frei bewegen können. Listerien sind in der Lage, sich in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden zu vermehren und über eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle in benachbarte Zellen zu gelangen. Mit einem Listerien-Stamm, der das grün-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnte der Infektionsverlauf in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden in Echtzeit verfolgt werden. Hierbei zeigte sich, daß auch stark infizierte HBMEC sich nicht vom Untergrund ablösen oder lysieren und somit gegenüber intrazellulären Listerien sehr widerstandsfähig sind. Wie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HBMEC-Monolayern nach einer Infektion mit L. monocytogenes erkennen ließen, adhärieren Listerien an HBMEC, indem sie einen engen Kontakt mit Mikrovilli auf HBMEC eingehen. Mit Listerien infizierte HBMEC bilden wenige Stunden nach der Infektion Membranausstülpungen aus, in denen sich Listerien befinden. Diese Ausstülpungen sind mit der Zelle nur noch über sehr dünne Membranschläuche verbunden. Um herauszufinden, welche Listerienproteine an der Aufnahme von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC beteiligt sind, wurden verschiedene Deletionsmutanten auf ihre Invasivität in HUVEC und HBMEC getestet. In Gegenwart von 20 Prozent Humanserum wurden HUVEC in einer von den Oberflächenproteinen InlA, InlB und ActA unabhängigen Weise von L. monocytogenes invadiert. Wurde das Gen, welches für den positiven Regulationsfaktor PrfA kodiert, deletiert, reduzierte dies die Invasionsrate beträchtlich. Listerienstämme mit einer Deletion im für InlB kodierenden Gen sind unfähig, HBMEC zu invadieren. Neben InlG und ActA spielt auch PrfA eine entscheidende Rolle bei der Invasion von L. monocytogenes in HBMEC. Die Adhäsion von L. monocytogenes an HBMEC ist von InlB unabhängig. Auch die apathogene und nicht-invasive Art L. innocua bindet an HBMEC. Humanserum hemmt die Invasion von L. monocytogenes in HBMEC, nicht aber in HUVEC. Während sich die Invasionsraten von L. monocytogenes in HUVEC durch Zentrifugation bei der Infektion erhöhen ließen, hatte die Zentrifugation keine Auswirkung auf die Invasivität von L. monocytogenes in HBMEC. Neben diesen konnten in dieser Arbeit noch weitere Infektionsparameter gefunden werden, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC haben. Im Zellüberstand von HUVEC konnten bis zu 6 Stunden nach einer Infektion mit L. monocytogenes große Mengen an IL-8 nachgewiesen werden. Während eine Infektion von HUVEC mit L. monocytogenes die Expression von IL-6-spezifischer mRNA schwach induzierte, war keine vermehrte Expression von MCP-1- und VCAM-1-spezifischer mRNA feststellbar. Indem Caco-2-Zellen und HBMEC auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters bis zur Konfluenz kultiviert wurden, konnte ein in-vitro-Modell des choroid plexus etabliert werden. Wenige Stunden nach der Infektion von HBMEC mit L. monocytogenes befanden sich auch in den Caco-2-Zellen Listerien. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, waren diese Listerien durch die Filterporen in die Epithelzellen gelangt. Der Mechanismus, dem diese Ausbreitung zugrunde liegt, ist noch unbekannt.
In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen können im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, nämlich die Überlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im Überschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit überwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellulär gewachsene Bakterien über Bindung an paramagnetische Partikel („Beads“) und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gewählt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel  Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy – CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur für die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate für die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien während der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. Für einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen“ Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begründet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen Fällen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellulären Veränderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten übereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazelluläre posttranskriptionelle Mechanismen begründet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen.
Die in dieser Arbeit etablierte Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM ermöglicht es, das Genom von pathogenen Bakterien zu mutagenisieren und die so generierte Mutantenbank im high-throughput-Format auf Gene zu untersuchen, die unter bestimmten Bedingungen für das infektiöse Potential oder für das Überleben dieser Keime von Bedeutung sind. Die Grundlage von IDM bildet ein konditional replizierender Vektor, in den eine Genbank des Wirtsorganismus kloniert wird und der unter nicht-permissiven Replikationsbedingungen mittels homologer Rekombination ins Chromosom integriert und dadurch einen Gen-Knockout bedingt. Das IDM-Verfahren weist gegenüber der Transposon-Mutagenese den Vorteil auf, dass das Genom nach dem Zufallsprinzip saturierend mutagenisiert werden kann und dass keine hot spots für die Insertion auftreten. Darüber hinaus kann der mutierte Genlocus nach Screening der Mutanten schnell per PCR identifiziert werden, indem die Exzision des Vektors induziert und das klonierte, homologe Fragment sequenziert wird. Die Insertion des Vektors ins Chromosom und damit der Gen-Knockout ist selbst ohne Selektionsdruck sehr stabil, so dass die Mutanten im Zellkultur- oder Tier-System untersucht werden können. IDM wurde im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf Salmonella enterica Serovar typhimurium und Listeria monocytogenes angewandt. Die Applikation von IDM auf S. typhimurium hatte zum Ziel, Gene zu identifizieren, deren Produkte für das Überleben dieses Gram-negativen Keims in Vollmedium unter Laborbedingungen essentiell sind. Ausgehend von 14.000 S. typhimurium Fragmentbank-Klonen konnten durch Induktion der Integration des Vektors 262 Klone identifiziert werden, für welche die Mutation zu einem lethalen Phänotyp führte. 116 der 262 entsprechenden Proteine konnte durch IDM erstmalig eine essentielle Funktion für die Vitalität von S. typhimurium zugewiesen werden. Darunter befinden sich sowohl Proteine, die homolog sind zu Proteinen anderer klinisch-relevanter Keime, als auch Proteine, die Salmonella-spezifisch sind. Der größte Teil der identifizierten Proteine ist in die Speicherung und Weitergabe von Information (Transkription, Translation, DNA-Reparatur etc.) involviert, viele sind allerdings auch Proteine unbekannter Funktion. Die Essentialität der durch IDM identifizierten Gene konnte durch die Konstruktion von konditional lethalen Mutanten bestätigt werden. IDM ist demnach das erste Mutagenese-Verfahren, welches das essentielle Gen-Set von S. typhimurium für das Überleben in Vollmedium zu definieren vermochte. Basierend auf den IDM Daten konnte es auf 511 Gene, d.h. auf 11 % des Gesamt-Genoms beziffert werden. Bei der Applikation von IDM auf L. monocytogenes lag der Fokus auf der Identifizierung von Genen, die für das Überleben dieses Gram-positiven Bakteriums im Zytosol von eukaryontischen Zellen von Bedeutung sind. Im Screening von bis dato 720 der 1491 L. monocytogenes Insertionsmutanten auf ein attenuiertes Replikationsverhalten in Caco-2 Zellen konnten 69 Mutanten selektioniert werden. In diesen Mutanten sind Gene ausgeknockt, deren Produkte hauptsächlich wichtige Funktionen in der Nährstoffbereitstellung, in der Energiesynthese und im Metabolismus inne haben. Mit der Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM steht ein molekulares Werkzeug zur Verfügung, welches für die Identifzierung neuer targets für sowohl Breitband- als auch Spezies-spezifische Antiinfektiva eingesetzt werden kann und welches unbekannten Proteinen eine biologische Funktionen zuweisen kann.
Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger.
Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43).
Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell
(2006)
Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte.
Listeria monocytogenes gehört zu den Gram-positiven fakultativ intrazellulären Bakterien, ist aber auch zu einem saprophytischen Leben in freier Natur fähig. Zahlreiche, umfassend charakterisierte Virulenzfaktoren sind für die verschiedenen Schritte im Infektionszyklus von L. monocytogenes erforderlich: InlA und InlB induzieren die Aufnahme von L. monocytogenes in nicht-phagozytische Zellen, LLO und PlcA sind für die Freisetzung aus dem primären Phagosom, ActA für die Zell-zu-Zell-Ausbreitung und LLO zusammen mit PlcA und vor allem PlcB für die Freisetzung der Listerien aus dem sekundären Phagosom erforderlich. Der Hexose-Phosphat-Transporter UhpT ist teilweise für die Vermehrung von L. monocytogenes im Zytosol der infizierten Wirtszelle verantwortlich. Die Gene, die für diese Virulenzfaktoren kodieren, sind größtenteils in dem 9,6 kb-großen Virulenzgencluster LIPI-1 zusammengefasst oder liegen verteilt auf dem Chromosom. Alle diese Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA (PrfA = positive regulatory factor A) in ihrer Transkription kontrolliert. Das prfA-Gen, kodierend für PrfA, ist benfalls Bestandteil des Virulenzgenclusters (LIPI-1). In bisherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Verwertung der Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose und Cellobiose zur Hemmung der PrfA-Aktivität in L. monocytogenes führt. Basierend auf Literaturdaten und eigenen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass Komponenten der globalen Kohlenstoff-Katabolitrepression (KKR) oder des PTS (Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System)-abhängigen Zuckertransports an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind. Um zu überprüfen, ob über die KKR die Aktivität von PrfA gesteuert wird und dadurch auch die Regulation der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression, wurden in dieser Arbeit pLSV101-Insertionsmutanten für die Gene ccpA (kodierend für CcpA = catabolite control protein A), hprK (kodierend für die HPr-Kinase/Phosphorylase, die HPr am Ser46 phophoryliert) und ptsH (kodierend für das hitzestabile HPr) charakterisiert. Die Insertionsmutanten ::ccpA und ::hprK zeigten sowohl in BHI (undefiniertes nährstoffreiches Medium) als auch in definiertem Minimalmedium (MM) mit 50 mM Glukose ein verlangsamtes Wachstum und eine verringerte [14C]-Glukose-Aufnahme im Vergleich zum Wildtyp (WT). Die ::ptsH-Insertionsmutante war nur zu einem Wachstum in BHI fähig und zeigte erwartungsgemäß (fehlendes HPr) kein Wachstum in definiertem MM mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle. Die ::hprK- und (unter bestimmten Wachstumsbedingungen) auch die ::ptsH–Mutante wiesen sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene eine gesteigerte Expression PrfA-abhängiger Virulenzgene auf. Cellobiose-Verwertung führte auch in der ::hprK-Insertionsmutante zu einer Hemmung der PrfA-Aktivität. Dagegen wurde in der ::ccpA-Insertionsmutante eine geringere Expression aller PrfA-abhängigen Virulenzgene im Vergleich zum WT festgestellt. Die Revertanten RccpA, RhprK und RptsH wiesen im Wachstumsverhalten und in der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression wieder einen wildtypischen Phänotyp auf. Trotz der etwas gesteigerten Virulenzgenexpression zeigte die ::ptsH-Mutante eine deutlich verringerte Replikationsrate in J744 Makrophagen gegenüber dem WT. Die Transkriptomprofile der ::ccpA- und ::hprK-Insertionsmutanten zeigten im Vergleich zum WT viele hochregulierte Gene. Diese umfassen Gene, die v.a. für den PTS-abhängigen Zuckertransport, ABC-Transporter und Enzyme des C- und N-Metabolismus kodieren und im WT wahrscheinlich unter den gegebenen Wachstumsbedingungen unter KKR-Kontrolle stehen. Die erhöhte PrfA-abhängige Virulenzgenexpression in der ::hprK-Mutante korreliert mit der Herunterregulation einiger Gene, die in ihrer Transkription durch einen aktiven PTSvermittelten Glukose-Transport kontrolliert werden. Die gesteigerte PrfA-Aktivität und die Abwesenheit von HPr-Ser46~P (neben CcpA eine wichtige Komponente der KKR) in den ::hprK- und ::ptsH-Insertionsmutanten führten zu der Annahme, dass eine Korrelation zwischen der Menge an HPr-Ser46~P und der PrfA-Aktivität bestehen könnte. Die Untersuchung der PrfA-Aktivität und parallel dazu die Mengenbestimmung von HPr-Ser46~P in MM mit Glukose, Cellobiose und Glyzerin zeigte jedoch, dass weder HPr-Ser46~P noch HPr-His15~P direkte Modulatoren der PrfA-Aktivität sind. Eine direkte Interaktion zwischen HPr-Ser46~P und PrfA konnte mittels Biacor-Analyse ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Auch in vitro Transkriptions-Studien zeigten keinen inhibitorischen Effekt von HPr-Ser46~P auf die Initiation der Transkription bei PrfA-abhängigen Promotoren (S. Müller-Altrock, persönliche Mitteilung). Interessanterweise war bei einem aktiven Glukose-Transport, bei Bedingungen also, wo die EIIA-Komponenten aller aktiven Glukose-spezifischen PTS im unphosphoryliertem Zustand vorliegen (EIIA-Komponenten übertragen über EIIB das aktive Phosphat auf die über EIIC in die Bakterienzelle transportierte Glukose), die PrfA-Aktivität gering. Erst in der spätlogarithmischen bis stationären Wachstumsphasen, wenn Glukose nur noch in geringem Umfang von der Bakterienzelle aufgenommen wird und die Glukose-spezifischen EIIA-Komponenten in phosphorylierter Form vorliegen, steigt die PrfA-Aktivität. Die Verwertung der PTS-unabhängigen Kohlenstoffquelle Glyzerin zeigte gegenüber den PTS Zuckern Glukose und Cellobiose schon in der frühen Wachstumsphase eine erhöhte PrfA-Aktivität. Demnach scheint sich die Expression spezifischer PTS und der Phosphorylierungszustand von EIIA dieser PTS regulatorisch auf die PrfA-Aktivität auszuwirken. Die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ist noch nicht vollständig aufgeklärt (R. Stoll, unveröffentlichte Ergebnisse). Doch kann aufgrund des Wachstumsverlustes der ::ptsH-Insertionsmutante in Glukose-haltigem MM davon ausgegangen werden, dass die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ausschließlich PTS-abhängig erfolgt. Ein Glukose-spezifisches PtsG, das in B. subtilis und anderen Bakterien als wichtiger Glukose-Transporter beschrieben wurde, existiert in L. monocytogenes nicht. Hier konnte nur eine PtsG-spezifische EIIA-Komponente (kodiert von lmo1017) identifiziert werden. Wachstumsuntersuchungen in definiertem MM mit den Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose, Cellobiose und Glyzerin ergaben keinen Wachstumsunterschied zwischen der in dieser Komponente defekten ΔeIIAGlc-Mutante und dem WT. Die PrfA-Aktivität dieser Mutante war leicht erhöht, was sich in einer etwas gesteigerten ActA- bzw. PrfA-Expression und einer höheren LLO-Aktivität gegenüber dem WT ausprägte. Es konnte jedoch keine eindeutige Interaktion zwischen dieser gereinigten EIIAGlc-Komponente und dem PrfA-Protein mittels Biacor-Analyse nachgewiesen werden (S. Müller-Altrock und G. Seidel, persönliche Mitteilung). Welche EIIA-Komponenten spezifischer PTS an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind, konnte in dieser Arbeit damit nicht abschließend geklärt werden. Der Transport von phosphorylierten Zuckern, wie Glukose-1-, Glukose-6- oder Mannose-6- Phosphat, erfolgt in L. monocytogenes über den Hexose-Phosphat-Transporter UhpT, der von dem strikt PrfA-abhängig uhpT-Gen kodiert wird. Durch die Zugabe von Amberlite XAD-4 zu LB-Medium oder durch vorherigen Anzucht in Glyzerin-haltigem MM, Bedingungen, die sich stimulierend auf die PrfA-Aktivität auswirken, konnte ein effizientes Wachstum von L. monocytogenes in Glukose-6-Phosphat-haltigem Medium erreicht werden. Obwohl die Kohlenstoff-Verbindungen (Glukose, Cellobiose und Glukose-6-Phosphat) in die Glykolyse eingeschleust werden, führte die Verwertung von Glukose-6-Phosphat zur Aufhebung der KKR. Dies konnte durch vergleichende Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und an der Bestimmung der HPr-Ser46~P Meng gezeigt werden. Die PTS-unabhängige Glukose-6-Phosphat-Aufnahme führt, ähnlich wie die von Glyzerin, zu einer erhöhten Aktivität von PrfA. Neben Glyzerin können auch Dihydroxyaceton (Dha) und Pyruvat (letztere allerdings mit niedriger Wachstumseffizienz), nicht aber Glyzerin-3-Phosphat in vitro als C3-Quellen dienen. Da die ::ptsH-Insertionsmutante kein Wachstum in Glyzerin- oder Dha-haltigem Medium zeigte, lässt sich vermuten, dass die listeriellen Glyzerin-Kinase(n) (GlpK), ähnlich wie die von B. subtilis, durch HPr-His15~P aktiviert werden muss und die Dha-Kinase(n) (DhaK) von L. monocytogenes ebenfalls HPr-His15~P als Kofaktor für die Phosphorylierung von Dha verwendet. Der Glyzerin-Metabolismus in L. monocytogenes wurde vor allem über Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und Real-time RT-PCR Untersuchungen näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes mehrere Gene besitzt, die in Glyzerin-haltigem Medium verstärkt exprimiert werden und vermutlich am Glyzerin- bzw. Dha-Metabolismus beteiligt sind. L. monocytogenes besitzt zwei Dha-Kinasen (kodiert von lmo0347-48 und lmo2695-96), die beide eine hohe Homologie zur DhaK aus E. coli besitzen. Eine Deletion beider Dha-Kinasen (ΔdhaK = Δlmo0347-48/lmo2695-96) führte zu einer starken Wachstumshemmung in Glyzerin-haltigem MM und zur weitgehenden Inaktivierung von PrfA. Die ΔdhaK- und die ΔglpD/dhaK-Mutante wiesen in J744 Makrophagen eine verringerte Replikationsrate im Vergleich zum WT auf, was für eine Verwertung von Glyzerin und/oder Dha durch L. monocytogenes im Zytoplasma von Wirtszellen spricht. Da diese Mutanten aber noch –wenn auch mit verringerter Effizienz – in diesem Zellkompartiment der Makrophagen wachsen können, muss L. monocytogenes wohl auch in der Lage sein, weitere Kohlenstoffquellen dieser Wirtszelle verwerten zu können.
Der Thiol:Disulfid-Redox Metabolismus und der Blaulichtrezeptor Lmo0799 von Listeria monocytogenes
(2010)
Der Thiol-Redox-Metabolismus, der in allen lebenden Zellen zu finden ist, wirkt oxidativem Stress entgegen. Des Weiteren dient er auch der Aufrechterhaltung der intrazellulären Thiol:Disulfid-Balance, die wiederum für die Funktion vieler Proteine essentiell ist. Auch stellt er Reduktionsäquivalente für die Produktion von Desoxyribonucleotiden für die DNA-Synthese bereit und hilft oxidierte Proteine zu reparieren. Der Thiol:Disulfid-Redox-Metabolismus (TDRM) unterscheidet sich von anderen metabolischen Netzwerken dadurch, dass keine Kohlenstoff- oder Stickstoffbindungen verändert werden. In vielen Fällen beinhaltet er die reversible Oxidation zweier benachbarter Cysteinreste im entsprechenden Protein, was zur Ausbildung von Disulfidbrücken führt. Da ein totaler Ausfall der GSH-Synthese einen geringeren Effekt zu haben schien als ein teilweiser, wurden DNA-Microarray-Transkriptomanalysen der ΔgshF-Mutante durchgeführt. Es wurden rund 750 Gene als signifikant reguliert (p < 0,05, Fold-change <0,5 bzw. >2) identifiziert. Da die am stärksten regulierten Gene von besonderem Interesse waren, wurden die Ausschlussgrenzen auf <0,2 bzw. >5 –fach reguliert heraufgesetzt. Diese Parameter trafen auf 92 Gene zu, davon 41 durch GSH-Mangel herauf-regulierte (d.h. die mRNA-Menge war in der Mutante höher als im Wildtyp) und 51 herunter-regulierte. Auffällig war, dass die Expression vieler Gene, welche durch den Stress-Sigmafaktor SigB reguliert werden, bei Fehlen von GSH verändert war. Zu den am stärksten (sechs- bis elffach) herauf-regulierten Genen zählen lmo0135-7, sie codieren für einen putativen Oligopeptidtransporter. Die Vermutung lag nahe, dass dieser evtl. GSH aus dem Medium in die Zellen transportieren könnte. Man kann also davon ausgehen, dass GSH von Listeria aktiv aus dem Medium aufgenommen wird und dass die Effekte, die im Versuch ohne zusätzliches GSH auftreten, direkt auf das Fehlen von GSH zurückzuführen sind. Zusammengefasst zeigte sich, dass ein Ausfall der GSH-Synthese in Listeria keinen auffälligen Phänotyp zeigt. Es wurden jedoch sehr umfangreiche Veränderungen des Transkriptionsprofils beobachtet, offenbar konnten die Bakterien dadurch eine neue zelluläre Homöostase erreichen. Physiologische Mengen von GSH im Medium komplementierten den Ausfall der GSH-Synthese fast vollständig. Im Laufe dieser Analysen fiel das Augenmerk auf ein Gen mit unbekannter Funktion, lmo0799, das in der ΔgshF-Mutante als deutlich heraufreguliert identifiziert worden war. Eine nähere in-silico-Analyse ergab deutliche Homologien des Lmo0799 Proteins zu einem Blaulicht-photorezeptor, YtvA, von Bacillus subtilis. Da ein Zusammenhang mit dem TDRM aufgrund der Microarray-Analysen mehr als wahrscheinlich schien, richtete sich das Augenmerk verstärkt auf die Charakterisierung des putativen Blaulichtrezeptors Lmo0799. Es wurde eine In-Frame-Deletionsmutante in lmo0799 hergestellt, die mit Δlmo0799-Mutante bezeichnet wurde. Darin ist das ursprünglich 253 Aminosäuren (AS) große Genprodukt von lmo0799 auf sieben AS verkürzt, ohne den Promotor- oder Terminatorbereich bzw. umliegende Gene zu verändern. Parallel wurde begonnen, Versuche zum Einfluss von Licht (blau, λ=455nm bzw. rot, λ=625nm) in vivo und in vitro auf L. monocytogenes durchzuführen. Versuche mittels qRT-PCR wurden durchgeführt um die genaue Wirkweise von Lmo0799 näher aufzuklären. Dazu wurden Testgene aus verschiedenen Regulons ausgewählt und deren Transkription in Proben von Wildtyp und Δlmo0799-Mutante mit und ohne blauem bzw. rotem Licht sowie mit und ohne Salzstress gemessen. Dabei zeigte sich, dass vor allem die Transkription von Genen des SigB-Regulons, das für die allgemeine Stressantwort in Listerien zuständig ist, durch Licht moduliert wurde. Die Wirkung von Blaulicht hing in hohem Maße von der Anwesenheit von Lmo0799 ab, welches wahrscheinlich eine Komponente des „Stressosoms“ von Listeria darstellt. Die Lichtregulation betraf auch die Internaline A und B, deren Transkription durch Belichtung stark erhöht wurde. Infektionsversuche mit blau belichteten bzw. dunkel gehaltenen Wildtyp- bzw. Δlmo0799-Bakterien an humanen Caco-2 Enterozyten zeigten, dass wildtypische Listerien nach Bestrahlung mit blauem Licht ihre Invasionsrate verdoppelten, während die Δlmo0799-Listerien auf Niveau der Dunkelkontrolle blieben. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass L. monocytogenes (und wohl auch die anderen Listeria-Arten) in Lmo0799 einen funktionalen Blaulichtrezeptor besitzt, der eine wichtige Rolle in der Vermittlung von Stressreizen via SigB spielt und auch die Motilität und Virulenz moduliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch rotes Licht die Transkription zahlreicher durch Blaulicht regulierter Gene beeinflusst. Der molekulare Mechanismus konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr aufgeklärt werden.