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In Vitro Toxizität der Nanopartikel Graphen und Siliciumdioxid für die Medikamentenapplikation
(2023)
Graphen und Siliciumdioxid Nanopartikel sind als Trägersubstanz für Medikamente beim Drug Targeting von Interesse. Diese Arbeit ist eine toxikologische Untersuchung der Nanopartikel Graphen und Siliciumdioxid im Zellmodell. Dabei wurden Graphen Nanopartikel mit einer Dicke von 6 bis 8 nm und einer Breite von 15 µm verwendet. Die verwendeten Siliciumdioxid Nanopartikel waren kugelförmig und porös mit einer Partikel-Größe von 5 bis 20 nm. Die dosisabhängige Toxizität (Konzentrationen 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml und 1 mg/ml, Inkubation über 24 Stunden) gegenüber 5 verschiedenen Zelllinien (cerebEND, Caco-2, Hep G2, HEK-293, H441) wurde geprüft. Dabei kamen Zellviabilitätstests (CellTiter-Glo Assay, EZ4U-Test) zum Einsatz. Zudem wurde mit den Apoptose-Markern Bax und Caspase-3 auf Gen- und Proteinebene (Polymerasekettenreaktion und Western Blot) überprüft, ob eine Apoptose eingeleitet wurde.
Zur Untersuchung der Zellviabilität wurde der CellTiter-Glo Assay verwendet. Für Graphen Nanopartikel zeigte sich ab einer Konzentration von 1 mg/ml bei den Zelllinien HEK-293 und H441 ein statistisch signifikanter Abfall der Zellviabilität. CerebEND und Hep G2 Zellen reagierten auf Graphen Nanopartikel ab einer Konzentration von 1 mg/ml ebenfalls mit einem deutlichen Abfall der Zellviabilität, diese Ergebnisse waren jedoch nicht statistisch signifikant. Die Zelllinie Caco-2 zeigte sich von den Graphen Nanopartikeln unbeeindruckt, es kam zu keiner statistisch signifikanten Veränderung der Zellviabilität. Siliciumdioxid Nanopartikel bewirkten ab einer Konzentration von 1 mg/ml einen statistisch signifikanten Abfall der Zellviabilität bei den Zelllinien cerebEND, HEK-293 und H441. HepG2 Zellen zeigten bei 1 mg/ml Siliciumdioxid einen deutlichen aber statistisch nicht signifikanten Abfall der Zellviabilität. Die Zelllinie Caco-2 erwies sich auch bei Siliciumdioxid Nanopartikel als äußerst robust und zeigte keine statistisch signifikanten Veränderungen der Zellviabilität.
Messungen der Zellviabilität auf Grundlage von Adsorptionsmessung, wie beim EZ4U-Test, hatten sich als ungeeignet erwiesen, da die Eigenfarbe der Nanopartikel Graphen und Siliciumdioxid mit dieser Messung interferierte.
Zudem wurde geprüft, ob die bei einem Teil der Zelllinien eingetretene toxische Wirkung der Nanopartikel ab einer Konzentration von 1 mg/ml durch Nekrose oder durch Apoptose zustande kam. Die Polymerasekettenreaktion zeigte mit einer einzigen Ausnahme keine statistisch signifikante Erhöhung der Genexpression für Bax und Caspase-3 und gab somit auch keine Hinweise auf die Einleitung einer Apoptose. Im Western Blot zeigte sich keine statistisch signifikante Erhöhung der Proteinexpression von Bax und Caspase-3. Zudem konnte im Western Blot auch keine aktivierte Caspase-3 nachgewiesen werden. Somit lagen auf Grundlage von Polymerasekettenreaktion und Western Blot keine Hinweise auf das Eintreten einer Apoptose vor. Die toxische Wirkung der Nanopartikel Graphen und Siliciumdioxid, die bei einem Teil der Zelllinien ab einer Konzentration von 1 mg/ml nachgewiesen werden konnte, beruhte demnach auf Nekrose.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss hochdisperser, nanoskaliger Materialien auf die Fließregulierung eines speziell ausgesuchten Trägermaterials mit einer unregelmäßigen Partikelform und einer breiten Partikelgrößenverteilung untersucht. Als Modellsubstanz diente gemahlenes, kristallines Laktosemonohydrat im Vergleich zu Maisstärke mit gleichmäßiger Partikelform. Es wurde nachgewiesen, dass die Wirkung von Fließregulierungsmitteln auch bei kantigen Partikeln mit rauer Oberfläche wie gemahlener Laktose auf der Adsorption kleiner Agglomerate des nanoskaligen Fließregulierungsmittels beruht. Zur Charakterisierung der Fließeigenschaften von Pulvern verschiedener Morphologie stellt der Zugspannungstester eine alternative Methode dar. Anhand von Vergleichsmessungen mit der Scherzelle nach Jenike wurde gezeigt, dass der Zugspannungstester eine geeignete Methode ist. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Entwicklung eines geeigneten Prämixes für den Einsatz von Fließregulierungsmitteln. Als Basis eines Prämixes sind grundsätzlich beide Trägermaterialien geeignet, Maisstärke ist der Laktose aber überlegen. In Prämixen mit Anteilen von 10 % Nanomaterial ist der Träger in der Lage das Fließregulierungsmittel zu zerteilen und zu adsorbieren. Diese Adsorbate werden in einer Endmischung schnell an die neu hinzugekommenen Partikel übertragen. Bei Einsatz eines Prämixes sinkt die Zugspannung mit steigender Mischzeit schneller als bei einer Direktmischung der Komponenten. Auch die Handhabung eines Prämixes hat sich als erheblich einfacher als die des reinen Nanomaterials herausgestellt. Die untersuchten Vormischungen sind sehr gut fließfähig und stauben kaum. Prämixe sind eine gute Option, Fließregulierungsmittel vorteilhaft in Pulvermischungen einzubringen. Eine Zugabe von zwei oder auch fünf Prozent eines Prämixes aus 10 % (m/m) Fließregulierungsmittel und Maisstärke statt der direkten Zugabe von 0,2 % bis 0,5 % Nanomaterial stellt eine verfahrenstechnische Verbesserung beim industriellen Einsatz von Fließregulierungsmitteln dar.
Es wurde untersucht, welchen Einfluss verschiedene hochdisperse Fließregulierungsmittel, wie sie bisher in der pharmazeutischen Technologie aber auch in der Lebensmittel- und Futtermittelindustrie eingesetzt werden, auf einige ausgewählte kohäsive Schüttgüter ausüben. Dazu wurden binäre Mischungen mit variierender Konzentration an Fließregulierungsmittel und Schüttgut hergestellt und in einem Freifallmischer gemischt. Als Fließverbesserer kamen verschiedene hochdisperse Kieselsäuren, darunter eine pyrogene Kieselsäure vom Typ AEROSIL® (Evonik Degussa GmbH) und mehrere Fällungskieselsäuren vom Typ SIPERNAT® (Evonik Degussa GmbH), zum Einsatz. Maisstärke, Kartoffelstärke und Hoechst Wachs C Micropulver® dienten als kohäsive Modellsubstanzen. Für den fließregulierenden Effekt spielt die gewählte Mischdauer eine entscheidende Rolle. Denn während des Mischvorgangs werden die ehemals Mikrometer bis Millimeter großen Fließregulierungsmittelagglomerate sukzessive zerkleinert, bis sie nanoskalige Rauigkeiten auf der Schüttgutoberfläche erzeugen. Je nach gewählter Mischdauer ergeben sich somit differierende Belegungsgrade der Trägerpartikeloberfläche. Die adsorbierten Oberflächenrauigkeiten bewirken eine Vergrößerung des Haftabstands zwischen den Pulverpartikeln und eine Verkleinerung der Kontaktfläche. Dadurch reduzieren sie die interpartikulären Anziehungskräfte, die vor allem durch van-der-Waals-Kräfte verursacht werden, und verbessern somit die Fließeigenschaften des Schüttgutes. Die interpartikulären Haftkräfte der binären Mischungen wurden mit Hilfe eines Zugspannungstesters gemessen. Die Größe und Anzahl der Kieselsäureadsorbate auf der Schüttgutoberfläche wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie und anschließender bildanalytischer Auswertung (KS 300©, Carl Zeiss) bestimmt. Es konnten Unterschiede im fließregulierenden Potential der einzelnen Kieselsäuren aufgezeigt werden, die sich durch deren individuelle Tendenz zur Fragmentierung erklären lassen. Unabhängig davon, ob Mais- oder Kartoffelstärke verwendet wurde, und welche Untersuchungsmethode den Messungen zugrunde lag, wiesen die getesteten Fließregulierungsmittel eine gleich bleibende Rangfolge ihres fließverbessernden Potentials auf. Es konnte somit gezeigt werden, dass Fällungskieselsäuren sich in gleicher Weise als Fließregulierungsmittel eignen wie die bereits breit eingesetzten pyrogenen Kieselsäuren. Jedoch müssen die Agglomerate der gewählten Silica leicht und schnell zerkleinerbar sein. Dies trifft in besonderer Weise für vermahlene Produkte zu, da deren Agglomeratgefüge lockerer sind als bei unvermahlenen Substanzen. Solche Fließregulierungsmittel, die eine große spezifische Oberfläche aufweisen, das bedeutet über eine kleine Primärpartikelgröße verfügen, besitzen eine besonders feste Agglomeratstruktur, die sich beim Mischen nur schwer zerkleinern lässt. Diese Kieselsäuren sind deshalb zur Fließregulierung nur wenig geeignet. Weiterhin sind hydrophobe Kieselsäuren den hydrophilen überlegen, wenn es darum geht, die Fließeigenschaften der Pulver zu verbessern. Das Fehlen zusätzlicher Wasserstoffbrückenbindungen wird hier für die hervorragende fließverbessernde Potenz der hydrophoben Materialien verantwortlich gemacht. Spielt jedoch das Wasseraufnahmevermögen der Silica eine Rolle, so ist es von Vorteil eine hydrophile Kieselsäure einzusetzen. Hierbei übertreffen die Fällungskieselsäuren die pyrogenen Kieselsäuren sogar in der Absorptionsfähigkeit. Die Erkenntnisse stellen einen Fortschritt für die Charakterisierung der verschiedenen Silica-Typen dar. Besonders, da der Kieselsäuretyp SIPERNAT® im Vergleich zum Typ AEROSIL® noch wenig erforscht und etabliert ist. Nachteilig für die Verwendung im Pharmabereich ist allerdings die im Vergleich zu den pyrogenen Kieselsäuren niedrigere chemische Reinheit. Die Auswahl beschränkt sich hier ausschließlich auf Produkte, die über einen hohen SiO2-Gehalt verfügen und somit den Anforderungen der Ph. Eur. genügen. Die getesteten Substanzen bleiben daher vorerst interessanter für den lebensmittel- oder futtermitteltechnologischen Bereich.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und Charakterisierung von elektrorheologischen Flüssigkeiten (ERF), deren Aktivität durch den Einsatz von imidazoliumhaltigen ionischen Flüssigkeiten (IL) hervorgerufen wird. Diese sind in eine Matrix aus selbst hergestellten, geordneten mesoporösen Silica-Partikeln (SBA-15) eingebettet. Die IL wird während der Modifizierungsreaktion in die Poren des SBA-15 über intermolekulare Wechselwirkungen eingelagert, wobei die Porosität des Systems erhalten bleibt. Durch Optimieren der Reaktionsparameter kann der Prozess hinsichtlich seiner ökonomischen und ökologischen Effizienz gesteigert werden. Der Anteil an ionischer Flüssigkeit im System kann hierbei gezielt eingestellt werden. Als Dispergiermedium der ERF wird Siliconöl eingesetzt, wobei die rheologischen Eigenschaften der erhaltenen Suspensionen je nach Feststoffgehalt und Konzentration an ionischer Flüssigkeit variieren. Im elektrischen Feld zeigen die Suspensionen eine deutliche elektrorheologische (ER-)Aktivität, während IL-freie SBA-15 Dispersionen in Siliconöl nicht ER-aktiv sind. Die Ursache des ER-Effekts sind Polarisationsprozesse, die in den modifizierten SBA-15 Partikeln durch Verschieben von Ionen hervorgerufen werden und mit Hilfe der Impedanzspektroskopie nachgewiesen werden konnten. Die Größe des ER-Effekts ist von einer Vielzahl an Parametern abhängig, vor allem vom Feststoffgehalt der Suspension, von der Art und der Konzentration der im Feststoff eingelagerten ionischen Flüssigkeit, der Temperatur und der elektrischen Feldstärke. Unter optimalen Umständen konnten mit den ERF bei Messung in Rotation (Scherrate 1000 s−1) Schubspannungen über 3000 Pa erreicht werden. Diese Werte wurden von bisher veröffentlichten Silica-haltigen elektrorheologischen Flüssigkeiten nicht erzielt. Aufgrund der gezeigten Effekte sind die in dieser Arbeit beschriebenen Dispersionen in die Gruppe der klassischen dielektrischen ERF einzuordnen. Der Vorteil liegt in der porösen Struktur der Feststoffpartikel, in die das elektrorheologisch aktive Additiv eingebracht werden kann, um dort im elektrischen Feld eine maximale Polarisation der Feststoffpartikel zu bewirken. Grundsätzlich eignen sich die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten Dispersionen als ERF, besitzen jedoch noch Optimierungsbedarf.
In der vorliegenden Arbeit wurde der fließregulierende Effekt diverser hochdisperser Fällungskieselsäuren vom Typ SIPERNAT® (Evonik Degussa GmbH) auf die Fließeigenschaften kohäsiver Schüttgüter untersucht. Der Wirkmechanismus dieser nanostrukturierten Fließregulierungsmittel beruht bei trockenen und elektrostatisch nicht aufgeladenen Pulvern vorwiegend auf der Reduktion von van-der-Waals-Kräften durch Adsorption kleinerer Aggregate des Fließregulierungsmittels an die Oberfläche der Schüttgutpartikel und somit Vergrößerung des Abstandes bzw. Verkleinerung der Kontaktflächen zwischen den Trägerpartikeln. Durch unterschiedlich langes Mischen von Fließregulierungsmitteln mit kohäsiven Schüttgütern verändert sich sowohl die Anzahl adsorbierter Nanopartikel als auch die Größe, Größenverteilung und Form der Adsorbate, was in unterschiedlichen Fließeigenschaften der Mischungen resultiert. Zur Untersuchung des Zusammenhanges zwischen Oberflächenbelegung durch Adsorbate und Fließeigenschaften einer Mischung wurde Maisstärke, die als kohäsives Modellschüttgut fungierte, eine konstante Menge Fließregulierungsmittel zugesetzt und die Mischungen unterschiedlich langen Mischzeiten in einem Freifallmischer unterzogen. Die aus dem Mischprozeß resultierende Belegung der Maisstärkeoberfläche durch Adsorbate wurde mittels Rasterelektronenmikroskop mit anschließender bildanalytischer Auswertung (KL 300®, Carl Zeiss) charakterisiert. Die Fließeigenschaften der Mischungen wurden mit einem Zugspannungstester, einem modifizierten Auslauftrichter sowie Hausner-Faktor untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sich die Fließeigenschaften mit steigender Mischzeit kontinuierlich bis zum Erreichen eines Optimums verbessern. Dies wird mit der Abnahme der Adsorbatgrößen und der Zunahme der Adsorbatanzahl auf der Maisstärkeoberfläche erklärt. Bei kurzen Mischzeiten bewirken adsorbierte Fließregulierungsmittelaggregate eine Verbesserung der Fließeigenschaften durch Verhinderung direkter Kontakte zwischen den Schüttgutpartikeln. Bei weiterer Zunahme der Oberflächenbelegung werden die Fließeigenschaften durch einen Übergang von Träger-Adsorbat-Träger-Kontakten zu Träger-Adsorbat-Adsorbat-Träger-Kontakten verbessert. Eine beobachtete Verschlechterung der Fließeigenschaften nach Überschreiten der optimalen Mischzeit beruht wahrscheinlich auf einer Veränderung der dreidimensionalen Form der Adsorbate, die zu einer Vergrößerung der Kontaktflächen führt. Beim Vergleich der unterschiedlichen Messmethoden zur Ermittlung der Fließeigenschaften wurde ersichtlich, dass die Messparameter des modifizierten Auslauftrichters gut mit dem Hausner-Faktor korrelieren, während die Zugspannungsmessungen z.T. abweichende Ergebnisse lieferten. Eine genaue Analyse des Messvorgangs am Zugspannungstester zeigte, dass die Pulverproben bei der verwendeten Messmethode (Messung mit konstanter Vorlast) in Abhängigkeit von ihren Fließeigenschaften unterschiedlich stark durch den Messvorgang verdichtet werden, was Einfluss auf die gemessenen Zugspannungswerte hatte. Aus dieser Erkenntnis konnten Verbesserungsvorschläge für die Zugspannungsmessung an Schüttgütern gemacht werden.