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Das Mineralokortikoid Aldosteron ist ein wichtiger Regulator der Salz- und Wasserhomöostase und damit auch des Blutdrucks. Seine physiologische Wirkung entfaltet es über den Mineralokortikoidrezeptor (MR), indem es zu einer Homodimerisierung bzw. Heterodimerisierung mit dem Glukokortikoidrezeptor führt. Zudem sind die pathophysiologischen Wirkungen des Aldosterons beispielsweise auf das Herz-Kreislauf-System in den Focus gerückt, welche zumindest teilweise auch vom MR abhängig sind. Zur weiteren Charakterisierung dieser Signalwege sollen Interaktionen des MR mit möglichen Zielproteinen untersucht werden. Biolumineszenz Resonanz Energietransfer (BRET) ist eine Methode zur Untersuchung von Proteininteraktionen. Um ein BRET-System für den MR zu erstellen, wurde der MR an eine Renilla Luciferase (Rluc) einerseits und das enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) andererseits gekoppelt. Beide Fusionsproteine wurden auf ihre Funktionalität und Interaktion hin überprüft. Befinden sich die Fusionsproteine in räumlicher Nähe, regt das von der Luciferase emittierte Licht das fluoreszierende Protein an. Das aus Fluoreszenz und Lumineszenz berechnete BRET-Signal steigt und weist damit auf eine Proteininteraktion hin. Ansätze ohne fluoreszierenden Akzeptor korrigieren unspezifische Signaländerungen. Wir untersuchten den Effekt von Aldosteron und dem Aldosteronantagonisten Spironolacton sowie von Geldanamycin, das eine Dissoziation des MR von den Hitzeschockproteinen im Zytoplasma bewirkt. Aldosteron führte zu einer Steigerung des BRET-Signals, was die bereits bekannte Interaktion der Fusionsrezeptoren auch im BRET-System bestätigt. Geldanamycin bewirkte ebenfalls eine Signalsteigerung. Die gleichzeitige Gabe der beiden Substanzen sowie die Gabe von Spironolacton bewirkte keine Veränderung des BRET-Signals. Als Negativkontrolle verwendeten wir ein System mit an EYFP gekoppeltem MR und ungekoppelter Luciferase, also ohne Interaktionspartner für den EYFP-MR. Keine der oben genannten Substanzen führte hier zu einer Änderung des BRET-Signals. Das BRET-System kann damit die Grundlage für die Untersuchung der Interaktionen des MR mit weiteren Zielproteinen darstellen.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Lokalisation und der Dynamik der Replikationsproteine des murinen prä-replikativen Komplexes in vivo. Dazu wurden die zu untersuchenden Replikationsproteine als EGFP-Fusionsproteine in LTK--Zellen exprimiert und am konfokalen Laserscanning-Mikroskop untersucht. CDC6-EGFP war in der G1-Phase diffus in Zellkern und Cytoplasma verteilt, am G1/S-Übergang ausschließlich im Zellkern lokalisiert und während der S-Phase in zahlreichen Foci im Kern akkumuliert. CDC6-EGFP war mit Replikationsfoci colokalisiert. Endogenes Cdc6p wies dieselbe subzelluläre Verteilung wie CDC6-EGFP auf. Auch Fusionsproteine des humanen Proteins Cdc6p waren in HEK-293T-Zellen in Replikationsfoci lokalisiert. FRAP-Studien ergaben, dass 80-90 % von CDC6-EGFP während der gesamten S-Phase stabil mit der Replikationsmaschinerie assoziiert sind. Durch Mutation der Phosphoryliersstellen für Cyclin-abhängige Proteinkinasen wurde der Einfluss des Phosphorylierungsstatus der konservierten Serinreste der Cdk-Phosphorylierungsstellen auf die Lokalisation von CDC6-EGFP in vivo untersucht. Alle Mutanten bei denen die Cdk-Serinreste zu nicht-phosphorylierbaren Alaninresten mutiert wurden waren in Replikationsfoci lokalisiert. Dies zeigt, dass die Phosphorylierung dieser Serinreste für die Lokalisation von CDC6-EGFP an Stellen aktiver DNA-Replikation nicht essentiell ist. Durch Mutation der Serinreste zu Phosphatreste-simulierenden Aspartatresten konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung des Serinrests S102 zum Export von CDC6-EGFP aus dem Zellkern führt. FRAP-Studien ergaben, dass CDC6-EGFP in Replikationsfoci an Serinrest 82 phosphoryliert und an Serinrest 102 dephosphoryliert vorliegt. Mit Immunfluoreszenz-Analysen konnte gezeigt werden, dass Chromatin in Replikationsfoci nicht acetyliert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Elongation der DNA-Replikation an nicht-acetyliertem Chromatin erfolgt. Trichostatin A-induzierte Hyperacetylierung des Chromatins hatte keinen Einfluss auf Lokalisation und Mobilität von CDC6-EGFP in Replikationsfoci. Die Mobilität des nucleoplasmatischen CDC6-EGFP-Pools wurde dadurch erhöht. In der G1-Phase wurde die Mobilität von CDC6-EGFP durch TSA verringert, woraus gefolgert werden kann, dass der Acetylierungsstatus des Chromatins in der G1-Phase die Mobilität von CDC6-EGFP beeinflusst. ORC1-EGFP war im Zellkern in großen kugelförmigen Strukturen lokalisiert, ORC2-EGFP war diffus in Cytoplasma und Zellkern verteilt. ORC3-EGFP akkumulierte in PML nuclear bodies. Während ORC4-EGFP und ORC5-EGFP am Centrosom lokalisiert waren konnte ORC6-EGFP in Nucleoli nachgewiesen werden. Die EGFP-Fusionsproteine von Cdc45p, PCNA und DNA-Ligase-I waren im Zellkern lokalisiert, die Nucleoli waren ausgespart. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der Substratspezifität der murinen Cdc7p/Dbf4p-Proteinkinase. Die in Sf9-Zellen exprimierte und aufgereinigte Kinase phosphorylierte Orc2p, Orc6p, Cdc45p und Mcm6p. Mit Phosphopeptidkartierungen konnte gezeigt werden, dass Cdc7p von CylinE/Cdk2 an zwei Stellen und von CyclinA/Cdk2 an einer Stelle in vitro phosphoryliert wird. CDC7-EGFP war in der G1-Phase, am G1/S-Übergang und in der S-Phase im Kern lokalisiert. Durch FISH-Experimente konnte der genomische Locus des murinen Cdc7-Gens der Bande E von Chromosom 5 zugeordnet werden. Mit Kinase-Assays wurde untersucht, ob die murine Plk1p-Kinase Initiationsfaktoren der DNA-Replikation in vitro phosphoryliert. Die in Sf9-Zellen exprimierte Plk1p phosphorylierte Cdc7p, Orc2p und Orc6p. Cdc7p und Orc6p sind mit Plk1p am Midbody während der Telophase in vivo colokalisiert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Messung der Mobilität des murinen Transkriptions-Terminationsfaktors TTF-I mittels FRAP. EGFP-TTF-I und EGFP-NRD waren diffus in den Nucleoli verteilt, einzelne Areale waren ausgespart. EGFP-TTFdeltaN185 war hingegen in distinkten nucleolären Stellen akkumuliert. Mit FRAP-Studien konnte gezeigt werden, dass EGFP-TTFdeltaN185 in einer 10 %igen immobilen Fraktion vorlag während das Gesamtprotein EGFP-TTF-I zu 100% mobil war. Das Protein TIP5 interagiert mit TTF-I. EGFP-TIP5 war diffus im Nucleoplasma verteilt, die Ncleoli waren ausgespart. Durch Cotransfektionen verschiedener EYFP-TTF-I-Konstrukte mit EGFP-TIP5 konnte gezeigt werden, dass EGFP-TIP5 von EYFP-TTFdeltaN185 nicht in Nucleoli cotransportiert wird. Mit BRET-Studien ergaben, dass Orc6p mit TTF-I in vivo interagiert. Eine Interaktion mit TTFdeltaN185 war nicht nachweisbar.
Viele Membranrezeptoren liegen als über Disulfidbrücken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen Fällen methodisch klar und einfach zu erbringen. Für die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopräzipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivität besitzen diese Methoden einige Grenzen und können je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilität der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverlässig ermittelt werden. Auch die Größe der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabhängige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu können. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching“ basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilität von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu können, müssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilität vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellulär mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellulär mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellulären Antikörpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellulär-markierten Rezeptoren und den intrazellulär-markierten Rezeptoren durch eine Mobilitätsänderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellulär-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antikörper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellulär-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilität nicht durch die extrazellulären Antikörper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellulär-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellulär-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverhältnis unabhängige Mobilität. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellulär-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilität des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abhängig vom CFP–YFP-Expressionsverhältnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten für ein Dimer überein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere höherer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu überprüfen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren höherer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei höheren YFP-Rluc-Expressionsverhältnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverhältnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage über eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden.