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Die Alzheimer'sche Erkrankung wird derzeit durch die Gabe von Acetylcholinesterase- Inhibitoren (AChEI) symptomatisch behandelt. Durch die AChE-Hemmung steht mehr Acetylcholin (ACh) für die Neurotransmission zur Verfügung. Bei Progression der Erkran-kung nimmt der Anteil an AChE drastisch ab, so dass die Enzymisoform Butyrylcholin- esterase (BChE) die Hydrolyse des Neurotransmitters ACh übernimmt. In späten Phasen der Alzheimer'schen Erkrankung ist daher der Einsatz selektiver BChE-Hemmer erfolgsver- sprechend.
Inhibitoren können verschiedene Bindestellen in der Cholinesterase-Bindetasche adressie-ren und dadurch in dieser stabilisiert werden. Zu den Bindestellen zählen die katalytisch aktive Stelle (CAS) am Ende eines 20 Å langen Bindetaschentunnels, die Oxyanion-Vertie-fung, die Cholinbindestelle, sowie die periphere anionische Bindestelle (PAS), welche am Bindetascheneingang lokalisiert ist.
In der vorliegenden Arbeit wurden durch in silico Dockingstudien gezielt Protein-Ligand- Interaktionen untersucht, um Strukturmerkmale hochaffiner Inhibitoren von Cholinesterasen zu identifizieren. Damit soll die zukünftige Entwicklung von Cholinesteraseinhibitoren hinsichtlich der Affinität zum Enzym verbessert werden. Ferner dienten synthetische Untersuchungen eines Naturstoffes dazu, Chinazoliniumverbindungen als Leitstruktur für die Inhibition der Cholinesterasen zu etablieren.
Für hochaffine tri- und tetrazyklische aminsubstituierte AChE-selektive Chinazolin- und Chinazolinoninhibitoren sollte die bevorzugte Orientierung der Liganden in der Bindetasche ermittelt werden. Hierfür ist die Lokalisation des Aminsubstituenten in der CAS (invertierter Bindemodus) oder die dortige Bindung des Chinazolin-/Chinazolinongerüstes (klassischer Bindemodus) denkbar. Anhand eines präferierten einheitlichen Bindemodus sollten die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen erklärt werden.
Dockingstudien zeigten die klare Präferenz für den invertierten Bindemodus, bei dem der Aminsubstituent in der Nähe der CAS platziert wird. Ein strukturelles Merkmal für hochaffine Inhibitoren ist ein unter Assaybedingungen protoniertes Amin, welches eine Kation-π-Wechselwirkung zu dem Indolringsystem des Tryptophans der Cholinbindestelle eingehen kann. Für das Ligandengrundgerüst wurde lediglich für tetrazyklische Verbindungen eine π-π-Interaktion mit der peripheren Bindestelle (PAS) am Bindetascheneingang identifiziert. Der Datensatz umfasste auch chirale Chinazolinon- und Chinazolinderivate mit hydrierter C=N-Doppelbindung, die eine schwächere Affinität zu AChE zeigten. Diese ist vermutlich auf das nicht-planare Ligandengrundgerüst zurückzuführen, da vor allem für tetrazyklische chi-rale Verbindungen die Stabilisierung des Ligandengrundgerüstes durch π-π-Interaktionen am Bindetascheneingang aufgrund der Sterik entweder gar nicht, oder nur für ein Enantio-mer möglich ist.
Aufgrund der nanomolaren Affinität der achiralen Chinazolin- und Chinazolinonverbindungen wurden weitere gerichtete Wechselwirkungen in der Bindetasche erwartet. Derartige Wechselwirkungen konnten in Form von Wasserstoffbrücken durch die Verwendung von sieben ausgewählten strukturellen Wassermolekülen im Docking identifiziert werden. Durch diese Wassermoleküle werden Wasserstoffbrücken vom Ligandengrundgerüst zum Protein vermittelt. Diese Wechselwirkungen scheinen essentiell für die Stabilisierung hoch-affiner Chinazolin- und Chinazolinoninhibitoren in der AChE-Bindetasche zu sein.
Zwei photochrome Bis-Tacrin-Konstitutionsisomere (Ring-geöffnete und Ring-geschlossene Form) inhibieren die AChE und zeigen einen unterschiedlichen Effekt in der Hemmung der Amyloid-β Fibrillenbildung. Die Fibrillenbildung wird durch eine unbesetzte periphere Bindestelle (PAS) am Eingang der AChE-Bindetasche katalysiert, weshalb eine unterschiedliche Interaktion der Liganden mit ebendieser Bindestelle vermutet wird.
Dockingstudien lieferten für beide Konstitutionsisomere einen ähnlichen Bindemodus, der vor dem Hintergrund der ähnlichen IC50-Werte von 4.3 und 1.8 nM für die Ring-geöffnete und Ring-geschlossene Form plausibel erscheint. Durch die Auswahl einer geeigneten Röntgenstruktur wurden Dockinglösungen erhalten, bei denen ein Tacrinsubstituent in der PAS bindet und dort π-π-Interaktionen mit einem Tryptophan und einem Tyrosin eingeht. Eine solche Lage des PAS-bindenden Tacrinsubstituenten ist energetisch bevorzugt und drückt sich durch bessere Scores gegenüber Dockinglösungen, bei denen dieser auf der Protein-oberfläche lokalisiert ist, aus. Der andere Tacrinsubstituent bindet in der CAS wie dies von bereits kristallisierten Tacrinderivaten bekannt ist. Mittels molekulardynamischer Simulati-onen wurde die Stabilität der Protein-Dockinglösungs-Komplexe beider Konstitutionsiso-mere verglichen. Dabei wurde die bessere Stabilisierung des CAS-bindenden Tacrinsubsti-tuenten für die Ring-geöffnete Form des Liganden ermittelt. Ferner zeigt sich für die Ring-geöffnete Inhibitorform während der Simulation der Einstrom von sechs Wassermolekülen in einen Hohlraum der PAS. Dies hat zur Folge, dass der PAS-bindende Tacrinsubstituent während der Hälfte der Simulationszeit durch Wasserstoffbrücken in der PAS stabilisiert wird. Ein Wasserstoffbrückennetzwerk diesen Ausmaßes kann für die Ring-geschlossene Inhibitorform nicht ermittelt werden. Die bessere Hemmung der Amyloid-β Fibrillenbildung der Ring-geöffneten Inhibitorform wird daher auf die bessere Stabilisierung des Liganden durch Wasserstoffbrücken in der AChE-Bindetasche zurückgeführt.
Für carbamatsubstituierte Tetrahydrochinazolinverbindungen sollten die bevorzugten Interaktionen in der BChE-Bindetasche ermittelt werden. Die Carbamatverbindungen sind pseudo-irreversible Inhibitoren und zeigen eine zeitabhängige Hemmung mit diversen Interaktionszuständen zwischen Protein und Ligand. Darüber hinaus stellen Dockingstudien in der BChE bislang eine Herausforderung dar, da es derzeit nur zwei Röntgenstrukturen dieses Enzyms mit reversiblen Liganden gibt, weshalb kaum Studien zur Identifikation einer geeigneten Bewertungsfunktion durchgeführt werden können.
Im Docking wurde sich für die Analyse des reversiblen Anlagerungskomplexes entschieden, da das Docking des tetraedrischen Übergangszustandes energetisch entartete Dockinglösungen lieferte. Eine weitere Herausforderung stellte die Größe der BChE-Bindetasche dar, die auch im reversiblen Docking entartete Dockinglösungen lieferte. Aufgrund einer ähnlichen Übertragungsrate aller getesteten Inhibitoren wurde eine konservierte Lage des Carbamates in der Bindetasche angenommen. Deshalb wurde eine repräsentative Dockinglösung einer Referenzverbindung als Ausgangspose für einen Modelling-Ansatz gewählt, die hinsichtlich der Interaktionen in der Bindetasche ausgewählt wurde. Diese Interaktionen sind: 1) Eine Wasserstoffbrückendistanz zwischen der Carbamat-Carbonylgruppe und der Oxyanion-Vertiefung sowie 2) eine Distanz, die den nucleophilen Angriff des Serins auf den Carbamatkohlenstoff erlaubt. Im Modelling-Ansatz wurde die repräsentative Bindepose dazu verwendet die entsprechenden Inhibitoren in der Bindetasche aufzubauen.
Die bevorzugte Position der N-Methylgruppe wurde für beide Enantiomere über die berechneten Spannungsenergien der Bindeposen abgeschätzt. Für die S-Enantiomere ergab sich die präferierte Bindung mit quasi-„axialer“ Methlygruppe und für die R-Enantiomere mit quasi-„äquatorialer“ Stellung dieser. Die Carbamatstrukturen liegen somit mit der Heptylkette in der Acyltasche und die Ligandengrundgerüste werden in einer Seitentasche der BChE-Bindetasche platziert, in der hydrophobe Wechselwirkungen dominieren.
Zusätzlich zu den hochaffinen Chinazolinonverbindungen sollten artverwandte Chinazolini-umverbindungen als Leitstruktur für Cholinesteraseinhibitoren untersucht werden.
Zunächst erfolgten Studien zur chemischen Reaktivität und Stabilität des Naturstoffes Dehydroevodiamin (DHED) sowie seines Benz-Derivates (Benz-DHED). Insbesondere Benz-DHED war unter den bisher verwendeten und in der Literatur beschriebenen Synthesemethoden instabil. Die Untersuchungen erforderten daher zunächst die Einführung einer geeigneten Syntheseroute, in diesem Fall die Oxidation mit KMnO4, einhergehend mit der Verbesserung der Ausbeute und ohne Nebenproduktbildung. Für die zukünftige Synthese von Derivaten wurde die Verwendung einer geeigneten Lewis-Säure-labilen Schutzgruppe herausgearbeitet.
Die untersuchten Chinazoliniumverbindungen zeigen die Eigenschaft, dass sie in Abhängigkeit der Reaktionsbedingungen in zwei Formen (Ring-geöffnet und Ring-geschlossen = Chi-nazoliniumsalz) isoliert werden können. Mittels UV/Vis-Untersuchungen wurde das Gleich-gewicht dieser Spezies aufgeklärt und in wässrigen alkalischen Lösungen die Anreicherung einer dritten, bislang nicht in diesem Zusammenhang beschriebenen, Spezies beobachtet. Als biologisch aktive Spezies konnte die Chinazoliniumform identifiziert werden. In Dockingstudien der Chinazoliniumform von Benz-DHED, nach dem für Carbamatverbindungen entwickelten Modelling-Ansatz, konnte auch hierfür die Stabilisierung der Docking- lösung über eine Wasserstoffbrücke in der BChE-Bindetasche zu einem strukturellen Wassermolekül identifiziert werden. Dies verdeutlicht erneut, dass die Berücksichtigung von Wassermolekülen in Dockingstudien dazu dienen kann zusätzliche Protein-Ligand-Interaktionen festzustellen.
Auf Grundlage der Forschung zu Chinazoliniumverbindungen kann die zukünftige Inhibitorentwicklung von Strukturen basierend auf dieser Substanzklasse erfolgen.
Die durchgeführten synthetischen und theoretischen Studien liefern wichtige Beiträge zum Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Inhibitoren und Cholinesterasen, die in der zukünftigen Inhibitorentwicklung Anwendung finden können.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein synthetischer Membrantransporter für acetylierte Aminosäurecarboxylate entworfen und hergestellt. Als Bindungsstelle für die Carboxylate wurde das Guanidiniocarbonylpyrrol-Motiv von Schmuck verwendet. In den Seitenarm des Pyrrols wurde ein L-Valinamid-Rest eingebracht, um die Möglichkeit zu zusätzlichen Wasserstoffbrückenbindungen zu bieten und gegebenenfalls Substrat- und Enantioselektivität zu erreichen. Zur Herstellung der Löslichkeit in unpolaren Medien wie dem Inneren der Zellmembran musste eine lipophile Gruppe eingebracht werden. Als löslichkeitsvermittelnder Rest wurde Tris-(Dodecyloxy)phenylmethylen ausgewählt, das drei lange unpolare Alkylreste trägt. Zusammengenommen ergab sich so ein Rezeptor für Oxo-Anionen und speziell für Aminosäurecarboxylate mit erhöhter Löslichkeit in organischen Medien. Somit war die Fähigkeit zu Membrantransport gegeben. In Kraftfeldrechnungen erhielt man die vermutliche Struktur des Rezeptor-Substrat-Komplexes, der eine Kombination aus einer Salzbrücke, Wasserstoffbrückenbindungen und einer Stapelwechselwirkung von Guanidinum-Kation, Benzylgruppe und ggf. aromatischem Rest des Aminosäuresubstrates aufweist. Nach erfolgreicher Synthese wurde in Extraktionsexperimenten die Fähigkeit des Rezeptors erprobt, Aminosäurecarboxylate aus einer wässrigen in eine organische Phase aus zu überführen. Man erhielt das beste Extraktionsvermögen für Ac-Trp-OH, gefolgt von Ac Phe OH und Ac Tyr OH. Es wurde eine neue Formel aufgestellt, mit der aus den pKS-Werten der Substrate und den Extraktionsdaten mit und ohne Rezeptor die Bindungskonstanten der Rezeptor-Substrat-Komplexe berechnet werden konnten. Die Größe der Bindungkonstanten entsprach der Reihenfolge Trp > Tyr > Phe ~ Val mit den höchsten Bindungskonstanten für das Tryptophanderivat mit 1.5*10E4 1/M. Zur Bestätigung der Bindungskonstanten wurden ITC-Messungen durchgeführt. Es wurden Messungen des Rezeptors in Chloroform mit den tert-Butylammoniumsalzen der acetylierten Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Valin durchgeführt. Für die Werte von Enthalpie und Entropie konnten bei dieser Auswertung konsistente Werte ermittelt werden. Die höchsten Werte der Enthalpie erhielt man für das Tyrosinderivat mit 3.7*10E3 cal/mol, gefolgt vom Phenylalaninderivat mit 2.8*10E3 cal/mol und Valinderivat mit 1.3*10E3 cal/mol. Diese Abstufung entspricht dem Einfluss des aromatischen Restes, der durch die Stapelwechselwirkung mit dem Guanidinium-Kation die Bindungswärme erhöht und durch den damit verbundenen engeren Komplex den Wert für die Entropie senkt. Für die Evaluierung des Transportvermögens wurden U-Rohr-Versuche verschiedener Art durchgeführt. Es wurde ein Gradient von pH 6 in der Ausgangsphase auf pH 8 in der Zielphase eingesetzt, wodurch der Rezeptor an der Grenzfläche zur Zielphase deprotoniert wurde, was zu gerichtetetem Transport führte. Es ergaben sich recht starke Unterschiede für die Fluxwerte der einzelnen Substraten, die der Reihenfolge Val > Phe > Ala > Trp > Tyr folgten. Dabei wurde das Valinderivat um den Faktor 17 schneller als das Tyrosinderivat befördert, mit dem recht hohen Flux von 1.11*10E-6 mol/m2*s, was nahe an den höchsten literaturbekannten Wert für acetylierte Aminosäuren heranreicht. Durch Verwendung gleicher Substratkonzentrationen in Start- und Zielphase konnte aktiver Transport nachgewiesen werden, d.h. Transport gegen das Konzentrationsgefälle. Die Triebkraft des Transportes war der Gradient von pH 6 auf pH 8 zwischen Ausgangs- und Zielphase, der durch den Symport von Substrat und einem Proton ausgeglichen wurde. Bei einem kompetitiven Versuch mit einer Mischung der verschiedenen Substrate in der Ausgangsphase wurden veränderte Fluxwerte und Selektivitäten festgestellt. Die neue Reihenfolge der Transportgeschwindigkeit war nun Trp > Phe > Val > Tyr > Ala, wobei die Fluxwerte fast durchgehend niedriger waren als im Einzelversuch. Die Veränderung der Werte erschließt sich bei Vergleich mit den thermodynamischen Daten aus den Extraktionsexperimenten. Bei direkter Konkurrenz um den Rezeptor wurden diejenigen Substrate mit den höchsten Bindungskonstanten bevorzugt, unabhängig von ihrer Transportgeschwindigkeit. Die schwächer bindenden Substrate wurden aus dem Komplex verdrängt und wiesen deswegen niedrigere Transportwerte auf. Der kompetitive Versuch ist somit eine stärkere Abbildung der Bindungsstärke und entspricht eher der Situation in einer realen Zelle.
Bedingt durch ihre strukturelle Diversität und biologischen Eigenschaften sind Naturstoffe seit jeher Quelle und Inspiration für Arzneimittel vor allem im therapeutischen Bereich der Onkologie und der Infektionskrankheiten. Ihr einzigartiges pharmakologisches Potenzial wird durch die selektive Interaktion mit einer Vielzahl von Zielmolekülen hervorgerufen. Aufgrund der zentralen Bedeutung von Naturstoffen in der Entdeckung und Entwicklung von neuen Arzneimitteln sind nach wie vor die Isolierung und Strukturaufklärung, die totalsynthetische Darstellung und Derivatisierung sowie die Identifizierung der Zielmoleküle und die Aufklärung des Wirkmechanismus dieser natürlichen Wirkstoffe unabdingbar.
Die kleine, aber spannende Klasse der Naphthylisochinolin-Alkaloide, die ausschließlich aus den beiden Pflanzenfamilien der Dioncophyllaceae und der Ancistrocladaceae gewonnen werden, zeichnet sich mit ihren mehr als 200 Vertretern nicht nur durch ihre strukturelle Vielfalt aus, sondern zeigt vor allem pharmakologisch interessante Wirksamkeiten. Neben ausgeprägten In-vitro-Aktivitäten gegen protozoische Erreger wie Leishmanien, Plasmodien und Trypanosomen besitzen die Vertreter dieser einzigartigen Naturstoffklasse nach neuesten Untersuchungen auch vielversprechende antitumorale Aktivitäten. Für deren Weiterentwicklung zu möglichen Arzneistoffen ist es daher unabdingbar, ihr pharmakologisches Potenzial tiefergehend zu untersuchen.
Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung totalsynthetischer Zugänge zu biologisch interessanten Naphthylisochinolin-Alkaloiden mit Hilfe unterschiedlicher Synthesestrategien. Ebenfalls sollten durch die Darstellung strukturell vereinfachter Derivate sowie markierter Naturstoffe in Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern mögliche Zielmoleküle identifiziert und Beiträge zum Wirkmechanismus untersucht werden.
Als Vorlage für diese Inhibitoren diente der kovalent gebundene Inhibitor 9IN aus der Kristallstruktur 2AMD. Die Entwicklung der neuen Leitstruktur (Abbildung 7-1) erfolgte dabei durch Fragmentierung mit dem Programm FRED im Arbeitskreis Prof. Knut Baumann (Univ. Braunschweig). Die dargestellten Verbindungen wurden als nicht-kovalent gebundene Inhibitoren entwickelt und sowohl an SARS-CoV-Mpro als auch an SARSCoV-PLpro getestet. Da die Basisverbindung 34j (R = H) in durchgeführten Dockingstudien die Enzym-Bindetaschen S1, S2 und S4 bereits ausreichend besetzt hatte, war das Ziel v.a. die noch freie Bindetasche S1‘ mit eingefügten Resten R zu besetzen. Dazu wurden in der Reihe 34a-t verschiedene Alkylreste eingefügt. Die Verbindungen 37a-cc bzw. 38a-p besitzen hingegen die Reste C(O)NHR, CO2R, CH2C(O)NHR und CH2CO2R. Im Verlauf der Synthese wurde der teure Baustein 4-Methylcyclohexancarbonsäure durch die günstigere Verbindung Cyclohexancarbonsäure ersetzt. Keine der dargestellten Verbindungen wies eine besondere Hemmung auf. Trotz geringer Hemmung konnte Verbindung 34e mit dem Enzym SARS-CoV-Mpro co-kristallisiert werden. Die genaue Lage des Inhibitors in der Bindetasche ist bislang noch nicht eindeutig geklärt. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von kovalent-reversiblen Inhibitoren von Cysteinproteasen auf Grundlage von Vinylsulfonen. Bisherige bekannte Vinylsulfone reagieren wie ein Michaelsystem in einer irreversiblen Addition. Es wurden durch QM-Rechnungen in der Arbeitsgruppe Prof. Bernd Engels substituierte Vinylsulfone vorgeschlagen, die fähig sein sollten, mit Cysteinproteasen eine kovalent-reversible Bindung eingehen zu können. Durch die Wahl sowohl eines geeigneten Substituenten als auch einer geeigneten Abgangsgruppe sollte die Reaktion reversibel sein, wenn sie thermoneutral bis schwach endergon verläuft. Um diese Berechnungen zu bestätigen, wurden die dargestellten Verbindungen mit einem Überschuss 2-Phenylethanthiol umgesetzt und der Reaktionsverlauf durch NMR-Spektroskopie verfolgt. Dabei konnte die Einstellung eines Gleichgewichts und damit auch die Reversibilität der Reaktion beobachtet werden. Aus den berechneten Gleichgewichtskonstanten konnten die freien Reaktionsenergien ΔG berechnet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reaktionen nahezu thermoneutral verlaufen und bestätigen damit die QM-Berechnungen.
No abstract available
Kohlenstoffmonoxid ist ein wichtiges kleines Signalmolekül das im menschlichen Körper durch die enzymatische Wirkung von Häm-Oxygenase (HO) auf Häm produziert wird. Für eine thera-peutische Anwendung werden Metallcarbonyl-Komplexe als CO-releasing molecules (CORMs) untersucht, die eine kontrollierte Freisetzung in biologischen Zielstrukturen erlauben. Dafür wird entweder die Ligandenperipherie ("drug sphere") modifiziert oder die CORMs an bio-molekulare Trägersysteme konjugiert.
Im Rahmen dieser Arbeit stand dabei die lichtinduzierte Freisetzung von Kohlenstoffmonoxid aus Mangan(I)tricarbonyl-Komplexen im Vordergrund. Die oktaedrische Koordinationssphäre des Metallzentrums wurde dabei durch verschiedene faciale tridentate Liganden komplettiert, welche außerdem eine einfache und modulare Verknüpfung mit biologischen Träger-molekülen ermöglichen sollten. Als Chelatoren wurden Derivate von N,N-Bis(pyridin-2-ylmethyl)amin (bpa) ausgewählt, in denen das zentrale Stickstoffatom mit Alkylaminen unterschiedlicher Kettenlänge funktionalisiert ist, welche über Amid-Bindungen mit Carboxylat-modifizierten Trägermolekülen verknüpft werden können. Diesen bpa-Liganden sollte ein neuartiges Ligandensystem auf der Basis von N-(Phenanthridin-6-ylmethyl)-N-(chinolin-2-ylmethyl)ethan-1,2-diamin (pqen) gegenübergestellt werden, in denen die Phenanthridin-Gruppe interessante photophysikalische und photochemische Eigenschaften erwarten lässt. Die CO-releasing molecules sollten zudem mit den isostrukturellen Rhenium(I)tricarbonyl-Komplexen verglichen werden, die als Marker für die Fluoreszenz-mikroskopie dienen.
Bei der Biofabrikation werden Zellen mit einem Biomaterial versetzt (vereint werden diese als Biotinte definiert) und durch additive Fertigungsmethoden wie dem 3D-Druck zu hierarchischen Strukturen aufgebaut. Zur Herstellung von künstlichen Gewebe und zukünftig auch von funktionalen Organen ist ein detailliertes Zellverständnis essentiell. Im Rahmen dieser Dissertation wurden Systeme generiert, um die Zellmembranen von mesenchymalen Stromazellen gezielt zu verändern und um die Modifikationen zu charakterisieren. Durch Inkubation mit unnatürlichen Zuckern werden diese von Zellen aufgenommen und in den Zellmetabolismus eingeschleust und auf die Glycoproteine übertragen. Diese Methode ist als metabolic glycoengineering bekannt.
Dazu wurden diverse humane Saccharid-Analoga mit bioorthogonalen Gruppen (Azid oder Alkin) synthetisiert. Alle in dieser Arbeit vorgestellten Moleküle wurden NMR-spektroskopisch als auch massenspektrometrisch charakterisiert.
Die acetylierten Mannosamin-Derivate konnten über zwei Stufen und die Sialinsäure-Derivate über sechs Stufen synthetisiert werden. Sialinsäuren sind die terminalen Zucker an Glycanketten von Proteinen mit wichtigen biologischen Funktionen. Im Rahmen des SFB TRR225 konnte in Kooperation mit der Gruppe von Prof. Dr. R. Ebert der Einbau der Saccharide in mesenchymalen Stromazellen durch Fluoreszenzmikroskopie evaluiert werden. Aufgrund des effizienteren Einbaus der Sialinsäure mit Alkingruppe gegenüber der mit Azidgruppe, wurde dieser in den folgenden massenspektrometrischen Analysen eingesetzt. Die Messungen der markierten Glycoproteine wurden von Dr. Marc Driessen durchgeführt und der metabolische Einbau von SiaNAl und Ac4ManNAl in den Stromazellen gegenübergestellt. 55 Glycoproteine konnten durch SiaNAl und 94 durch Ac4ManNAl charakterisiert werden. Ein Abgleich der Proteindatenbanken eine Anreicherung von Proteine durch Fütterung von SiaNAl die in Signaltransduktion, Zellkontakte und Differenzierung involviert sind, womit metabolic glycoengineering prinzipiell zur Optimierung von Biofabrikationsprozessen genutzt werden kann.
Ziel der Dissertation „Entwicklung von Cysteinproteaseinhibitoren – ein klassischer und ein kombinatorischer Ansatz zur Inhibitoroptimierung“ war die Optimierung von neuen Inhibitoren von Falcipain-2 und Rhodesain als neue potentielle Wirkstoffe gegen Malaria bzw. die Schlafkrankheit über zwei verschiedene Methoden. Es handelt sich hierbei um einen klassischen und einen kombinatorischen Ansatz. Der klassische Ansatz basiert auf einer Struktur, deren Aktivität per Zufall entdeckt wurde. In Screenings von synthetisierten Strukturanaloga, gestützt durch virtuelle Docking-Experimente am aktiven Zentrum der Cysteinproteasen, wurden Struktur-Aktivitäts-Beziehungen erarbeitet. Bei der kombinatorischen Methode wurde zunächst ein peptidischer Inhibitor entworfen, der durch Festphasensynthese an einem geeigneten Harz synthetisiert wurde. Durch den kombinatorischen Einsatz von Aminosäuren konnte auf diese Weise unter enormer Zeitersparnis eine Bibliothek von 150 Inhibitoren synthetisiert werden. In einem Screening dieser harzgebundenen Inhibitoren wurden anschließend die potentesten Inhibitoren identifiziert. Die Aktivität der gefundenen Inhibitoren aus beiden Ansätzen an den protozoischen Erregern wurde durch in-vitro-Experimente an Plasmodien und Trypanosomen untersucht. Beim klassischen Ansatz wurde eine neue Substanzklasse entwickelt, die sehr gute Hemmeigenschaften an beiden Cysteinproteasen mit IC50-Werten im niedrigen mikromolaren Bereich zeigten. Außerdem besaßen sie eine hohe in-vitro-Aktivität gegenüber den Erregern im gleichen Konzentrationsbereich. Einige der Inhibitoren zeigten keine Zytotoxizität an Makrophagen. Aus dem klassischen Ansatz konnten also hochaktive Substanzen mit geringer Zytotoxizität entwickelt werden, deren Einsatz als Wirkstoffe gegen Malaria oder der Schlafkrankheit denkbar ist. Für den kombinatorischen Ansatz wurde zur Inhibitoroptimierung eine Screeningmethode für Falcipain-2 und Rhodesain direkt an einem geeigneten Harz zur Festphasensynthese entwickelt. Neu bei dieser Screeningmethode war es, dass erstmals ein quantitatives Screening einer Inhibitorbibliothek möglich sein sollte, und nicht nur die besten Inhibitoren identifiziert werden können. Aus den Ergebnissen der Festphasenscreenings an beiden Proteasen wurden 14 besonders interessante Inhibitoren der Bibliothek ausgewählt und synthetisiert. Diese Verbindungsklasse zeigte ebenfalls sehr gute Ergebnisse an den isolierten Enzymen, in den mikrobiologischen Tests an den Erregern jedoch fielen alle Ergebnisse vergleichsweise schlechter aus. Die schlechte Löslichkeit, die Bioverfügbarkeit und der Metabolismus durch den Erreger der peptidischen Inhibitoren schienen von großer Bedeutung zu sein. Der bearbeitete kombinatorische Ansatz lieferte eine neuartige Screeningmethode, die auch auf andere Targets anwendbar ist.
Einen möglichen Ansatzpunkt für eine antivirale Therapie gegen SARS-Coronaviren bildet die Hemmung der Cysteinproteasen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro. Diese übernehmen die Polyprotein-Spaltung während der Virusreplikation und sind damit essentiell für das Überleben und die Verbreitung des Virus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden potentielle Inhibitoren der SARS-CoV-Mpro synthetisiert, die Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin-, Pyridylessigsäure- und Thiazol-Derivate als Grundbausteine enthalten. Durch Strukturmodifikationen wurde eine Serie neuer Verbindungen erhalten, deren inhibitorische Aktivitäten in fluorimetrischen Assays (FRET-Assays) an den Enzymen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro untersucht wurden. Weiterhin wurden Testungen an Coronaviren, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei und an Makrophagen durchgeführt. Die synthetisierten Verbindungen wurden in sechs Strukturklassen eingeteilt. Strukturklasse 1 enthält Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin- und Pyridylessigsäure-Derivate ohne Seitenkette in α-Position. Diese bestehen aus einem peptidischen Carbonsäure-Fragment mit N-Heterozyklus. Die Strukturklasse 2 bilden Pyridylessigsäure-Derivate mit einer zusätzlichen aliphatischen Seitenkette in α-Position zur Carboxylfunktion. Die Seitenkette sollte durch Adressierung der S1‘- bzw. S2‘-Bindetasche der SARS-CoV-Mpro die Affinität zum Enzym erhöhen. In den Strukturklassen 3 bis 6 bilden Thiazolamide das bestimmende Strukturelement. In der Strukturklasse 3 kamen dabei unterschiedlich substituierte aromatische Carbonsäuren zum Einsatz, die mit einer Reihe 4,5-substituierter Thiazolamine verknüpft wurden. In den übrigen Stoffklassen, in denen ausschließlich 5-Acetyl-4-methylthiazolamin als Amin-Fragment diente, wurde der Einfluss von Säure-Bausteinen ohne Michael-System (Strukturklasse 4) bzw. mit Michael-System (Strukturklasse 5), sowie die Einführung einer Seitenkette am Benzolring oder am Michael-System (Strukturklasse 6) untersucht. Bei den durchgeführten Enzymassays an der SARS-CoV-Mpro zeigten die synthetisierten Verbindungen insgesamt nur eine geringe Hemmung der Protease (<30 %, 20 µM). Daher lassen sich aus den erhaltenen Ergebnissen keine Struktur-Wirkungsbeziehungen ableiten. Dennoch sind in den Ergebnissen Trends erkennbar. Alle aktiven Verbindungen (Hemmung >10 % bei 20 μM) der Pyridin-, Pyrrolidin-, Piperidin- und Pyridylessigsäure-Derivate enthielten als Strukturmerkmal größere Seitenketten wie n-Pentyl, Cyclopropylmethyl und Crotyl (Strukturklasse 2). Bei den Thiazolamiden der Strukturklassen 3-6 führte die Einführung eines Michael-Systems in der Strukturklasse 5 zu etwas aktiveren Verbindungen. Den größten Einfluss auf die Aktivität zeigte jedoch die Einführung einer Seitenkette in α-Postion zur Carboxylgruppe (Strukturklasse 6). In den Strukturklassen 3 und 4 erwiesen sich nur sehr wenige Verbindungen als aktiv.
Seit der Strukturaufklärung der grünen Blattpigmente Chlorophyll a und Chlorophyll b sowie des roten Blutfarbstoffes Häm durch Richard Willstätter und Hans Fischer zu Beginn des 20. Jahrhunderts stehen tetrapyrrolische Naturstoffe weltweit im Fokus unzähliger biologischer, medizinischer, physikalischer und chemischer Forschungsarbeiten. Heute spielen insbesondere Porphyrine – die prominentesten Vertreter der synthetischen Tetrapyrrol-Makrocyclen – eine bedeutende Rolle in der modernen angewandten Chemie, etwa als metallorganische Katalysatoren, als Photosensibilisatoren in der photodynamischen Krebstherapie oder auf dem Gebiet der Materialwissenschaften. Neben monomeren Porphyrinen sind dabei v.a. Multiporphyrine mit maßgeschneiderten photophysikalischen Eigenschaften und definierter dreidimensionaler Struktur höchst attraktive Syntheseziele. Im Gegensatz zum immensen Forschungsinteresse an achiralen Porphyrin-Systemen wurde der Darstellung und stereochemischen Charakterisierung chiraler Porphyrinoide bislang vergleichsweise wenig Beachtung geschenkt. Insbesondere optisch aktive Vertreter mit stereo-genen Porphyrin-Aryl-Achsen und intrinsisch axial-chirale Oligoporphyrine wurden bislang kaum untersucht. Aufgrund eines Mangels an geeignet funktionalisierten tetrapyrrolischen Vorläufern sind hierbei Strukturmotive mit β-Verknüpfung besonders unterrepräsentiert. Die generell spärliche Beschreibung axial-chiraler Porphyrin-Systeme und ihrer chiroptischen Eigenschaften liegt hauptsächlich in der oft extrem schweren Zugänglichkeit entsprechender Verbindungen – insbesondere in optisch reiner Form – begründet. Aufgrund der derzeit rapide ansteigenden Bedeutung chiraler Porphyrinoide sind die Synthese und stereochemische Analyse sowie eine Erweiterung des bis dato mehr als begrenzten methodischen Repertoires zur stereoselektiven Darstellung von chiralen Porphyrin-Derivaten von größtem Interesse. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung effizienter und vielseitig ein-setzbarer Verfahren zum Aufbau komplexer axial-chiraler Mono- und Multiporphyrine mit maßgeschneiderten chemischen, physikalischen und chiroptischen Eigenschaften sowie unter-schiedlicher räumlicher Anordnung der Chromophore. Desweiteren sollten erstmals verschiedene Konzepte zur stereoselektiven Synthese axial-chiraler Porphyrin-Systeme entwickelt und vergleichend erprobt werden. Bei allen bearbeiteten Fragestellungen standen ein tieferes Verständnis stereochemischer Aspekte sowie die eingehende Untersuchung der chiroptischen Eigenschaften (z.B. unter Anwendung moderner HPLC-Kopplungstechniken) der neuartigen synthetisierten Verbindungen im Vordergrund.