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Die ersten Landpflanzen standen vor der Herausforderung sich mit der wechselnden Verfügbarkeit von Wasser an Land arrangieren zu müssen. Daraus ergab sich die Notwendigkeit den Wasserverlust zu minimieren und dennoch ausreichend CO2 für die Photosynthese aufzunehmen (Raven, 2002). Im Laufe der Evolution der Pflanzen entstanden mehrere Anpassungen an diese neuen Gegebenheiten, die schließlich auch zur Entstehung von regulierbaren Öffnungen, den Stomata, in der Blattepidermis führte. Zwei Schließzellen umschließen das Stoma und regulieren über die Aufnahme oder Abgabe von osmotisch-aktiven Teilchen ihren Turgordruck und damit die Öffnungsweite des Stomas. Das Kation Kalium und die Anionen Chlorid und Nitrat repräsentieren die Hauptosmotika, die je nach Bedarf durch Transportproteine über die Plasmamembran der Schließzellen geschleust werden. In den Samenpflanzen wie zum Beispiel der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, ist der Signalweg in Schließzellen, der bei Trockenheit zu einem schnellen Schluss des Stomas führt bereits sehr gut untersucht. Bei Wassermangel synthetisiert die Pflanze das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure). Das Hormon wird durch ABA-Rezeptoren erkannt und resultiert schließlich in der Aktivität der Proteinkinase OST1. Daraufhin reguliert diese Kinase zum einen die Transkription ABA-abhängiger Gene, die der Pflanze eine langfristige Adaptation an Trockenheit und Austrocknungstoleranz verleiht. Zum anderen, phosphoryliert OST1 den Anionenkanal SLAC1 und aktiviert ihn so. Die Aktivität des Kanals initiiert schließlich den Stomaschluss durch einen Ausstrom von Anionen aus den Schließzellen, der mit einer Depolarisation der Schließzellmembran einhergeht.
Der ABA-Signalweg, der zur transkriptionellen Regulation von Genen und der damit verbunden Trockentoleranz führt ist ein sehr stark konservierter und evolutiv sehr alter Signalweg, der in allen Geweben von Pflanzen bei Trockenheit beschritten wird. Der schnelle ABA-Signalweg, der die Aktivität der SLAC1 Anionenkanäle reguliert, ist auf Schließzellen begrenzt. Da sich Schließzellen aber erst spät in der Evolution von Landpflanzen etablierten, erhob sich die Frage, wann in der Evolution geriet SLAC1 unter die Kontrolle das ABA-Signalwegs? Geht diese Regulation von SLAC1 mit der Entstehung von Schließzellen einher oder bestand dieser Regulationsmechanismus bereits in Pflanzen, die keine Schließzellen besitzen. Zur Beantwortung dieser Frage untersuchte ich die einzelnen Komponenten des Signalwegs und ihre Beziehungen zu einander im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten.
Im Laufe dieser Arbeit wurden Schlüsselelemente des ABA-Signalwegs aus sechs verschiedenen Versuchspflanzen kloniert und in Oozyten charakterisiert. Für die Untersuchung der Evolution des schnellen ABA-Signalwegs wurden die sechs Versuchspflanzen aus je einem rezenten Vertreter der Grünalgen (Klebsormidium nitens), der Lebermoose (Marchantia polymorpha), der Laubmoose (Physcomitrella patens), der Lycophyten (Selaginella moellendorffii) und der Farne (Ceratopteris richardii) ausgewählt und mit der Samenpflanze Arabidopsis thaliana verglichen. Die sechs Pflanzengruppen spalteten sich an unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe der pflanzlichen Evolution von der Entwicklung der restlichen Pflanzen ab und erlauben so einen bestmöglichen Einblick in den jeweiligen Entwicklungsstand der Landpflanzen während der Entstehung der einzelnen Pflanzenfamilien. Obwohl sich die ersten Stomata erst in den Laubmoosen entwickelten, besitzen schon die Grünalgen OST1-Kinasen und SLAC1-Kanäle. Interessanterweise konnte wir zeigen, dass schon die frühen OST1-Kinasen aus Algen und Moosen dazu in der Lage sind, in den höher entwickelten Samenpflanzen die Rolle in der Regulation der ABA-abhängigen Expression von Genen zu übernehmen. Außerdem zeigte sich im Laufe meiner biophysikalischen Untersuchungen, dass alle dreizehn getesteten OST1-Kinasen aus den sechs unterschiedlichen Versuchspflanzenarten in Lage sind, den Anionenkanal SLAC1 aus Arabidopsis in Xenopus Oozyten zu aktivieren. Diese Austauschbarkeit von den AtSLAC1-aktivierenden Kinasen deutet auf eine sehr starke Konservierung der Struktur und Funktion von OST1 hin. Anders verhielt es sich bei der funktionellen Analyse der Anionenkanäle aus den verschiedenen Versuchspflanzen: Hier bildete nur der evolutionär gesehen jüngsten SLAC-Kanal AtSLAC1 aus Arabidopsis ein funktionelles Pärchen mit OST1. Die SLAC1 Kanäle aus der Grünalge, dem Lebermoos, den Lycophyten und dem Farn blieben ohne messbare Aktivität bei einer Co-expression mit den verschiedenen OST1 Kinasen. Nur beim Laubmoos (Physcomitrella patens) konnte noch ein funktionelles Kinase-Anionenkanal Pärchen gefunden werden. Struktur-Funktionsuntersuchungen erlaubten mir schließlich zu zeigen, dass bestimmte funktionelle Domänen sowohl im N-terminus als auch im C-terminus von SLAC1 erforderlich sind, um eine Aktivierung des Kanals durch OST1 Kinasen sicherzustellen.
Lokalisation, Funktion und Regulation pflanzlicher Tandem-Poren-Kaliumkanäle in Arabidopsis thaliana
(2007)
Lokalisation - Alle TPKs bis auf TPK4, der in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind im Tonoplasten lokalisiert. - Das 14-3-3-Bindemotiv bzw. der komplette N-Terminus spielt im Gegensatz zu den tierischen TPK´s keine Rolle beim Targeting (und evtl. auch beim Assembly), da ein Austausch der N-Termini bzw. Mutationen im 14-3-3- Bindemotiv keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation hat. - Im C-Terminus ist möglicherweise ein strukturelles Motiv bzw. eine Erkennungssequenz für das Targeting in unterschiedliche Zielmembranen lokalisiert. Eventuell ist hier auch eine Assembly-Domäne für den Zusammenbau der unterschiedlichen Kanaluntereinheiten vorhanden. TPK4 - Der Kaliumkanal TPK4 wird nach Agro-Infiltration in dem pflanzlichen Expressionssystem Nicotiana benthamiana exprimiert. - TPK4 ist auch in diesem Expressionssystem in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert. - Die Ströme, welche aus Mesophyllzellen von TPK4 infiltrierten Blättern abgeleitet wurden, gleichen denen, von TPK4 exprimierenden Oocyten von Xenopus laevis. Somit hat TPK4 in beiden Expressionssystemen die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften. TPK1 - TPK1 bindet über die C-terminalen EF-Hände Calcium und wird durch diese Interaktion aktiviert. - TPK1 interagiert phosphospezifisch und isotypspezifisch mit dem 14-3-3- Protein GRF6. Diese Interaktion führt zur Aktivierung des Kanals. - Die Kinasen CPK3 und CPK29, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 phosphorylieren um eine Interaktion mit 14-3-3-Proteinen zu ermöglichen, gehören zur Familie der CDPKs - Diese Kinasen sind selbst Calcium aktiviert und aller Wahrscheinlichkeit nach unter physiologischen Bedingungen inaktiv. Erst ein Anstieg der freien Calciumkonzentration führt zur Aktivierung der Kinase in der Zelle und damit zur Aktivierung des Kanals. - Das 14-3-3-Bindemotiv ist das einzige Target der CDPK´s im N-Terminus von TPK1 - Die Phosphatase, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 dephosphoryliert gehört zur Familie der PP2A-Proteinphosphatasen. - Es ist möglich, dass die Kinase und damit auch der Kanal durch Salzstress und durch Kaliumunterversorgung aktiviert werden und somit die Signalkaskade für die Aktivierung von TPK1 über Kinasen/14-3-3/Calcium in einen stressphysiologischen Kontext involviert ist. - tpk1.3- und cpk3.1-Verlustmutanten zeigen eine Reduktion in der Keimungsrate unter Salzstress und limitierten Kaliumangebot. Es kann über einen funktionalen Komplex bestehend aus TPK1 und TPC1 zur Aufrechterhaltung der Na+/K+-Homeostase und der elektroneutralen Aufnahme von Na+ in die Vakuole unter Salzstressbedingungen spekuliert werden.
Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht.
Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht.
Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat.
Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren.
Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen.
Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein.
Die vorliegende Arbeit behandelt TRAIL-induzierte Apoptose und Nekroptose in verschiedenen Zelllinien. Im Speziellen wurden die verschiedenen Funktionen des TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) untersucht. Hierzu wurde ein transienter Knockdown etabliert und dessen Wirkung auf die Suszeptibilität der Zellen gegenüber dem Zytokin TRAIL untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von TRAF2 nicht nur zur Sensitivierung für Apoptose führt, sondern auch in Nekroptose-kompetenten Zellen zu einer Verstärkung der durch Caspaseinhibition mittels zVAD-fmk nach TRAIL-Stimulation induzierten Nekroptose führt. Mittels des Zytokins Fc-TWEAK wurde Fn14-vermittelt TRAF2 aus dem Zytosol in ein Triton X100-unlösliches Kompartiment rekrutiert und dadurch physiologisch depletiert. Dies führte zwar kaum zu gesteigerter TRAIL-abhängiger Apoptose, sensitivierte jedoch analog zum TRAF2-Knockdown RIP3-exprimierende Zellen für Nekroptose. Durch Vergleich RIP3-negativer (HeLa-Leervektor) mit RIP3-exprimierenden Zellen (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) konnte die Essentialität von RIP3 für die Nekroptose herausgestellt werden und Einsatz des RIP1-Kinase-Inhibitors Necrostatin-1 sowie des MLKL-Inhibitors Necrosulfonamide belegte die Beteiligung der Nekroptosomkomponenten RIP1 und MLKL. Antagonismus putativen autokrinen TNFs bewies, dass es sich bei dem durch Fc-TWEAK verstärkten Zelltod um einen direkten TRAIL-Effekt handelte und Inhibition kanonischen NFkBs durch IKK2-Inhibitor TPCA-1, dass die TRAF2-Knockdown-vermittelte Sensitivierung gegenüber TRAIL nicht auf verändertes NFkB-Signalling zurückzuführen ist. Einsatz des SMAC-Mimetikums BV6 rekapitulierte zudem stark das im TRAF2-Knockdown Gesehene und unterstrich die Bedeutung der cIAPs. Immunpräzipitation von Caspase 8 unter nekroptotischen Bedingungen zeigte bei TRAF2-Knockdown eine Depletion von TRAF2 und cIAP1/2 sowie RIP1 und RIP3 aus dem Komplex mit Caspase 8. Insgesamt wird deutlich, dass TRAF2 einerseits antiapoptotisch wirkt als K48-Ubiquitinligase, die die Halbwertszeit aktiver Caspase 8-Komplexe determiniert und andererseits eine antinekroptotische Funktion hat, da es durch Rekrutierung von cIAP1/2 an RIP1 die TRAIL-induzierte Nekroptose verhindert, wenn die Caspasen inhibiert sind.
Abscisinsäure-Glucoseester (ABA-GE) kann nach der vorliegenden Untersuchung nicht mehr ausschließlich als Endmetabolit der Abscisinsäure (ABA) gelten. Der unter Stressbedingungen im Xylem verstärkt transportierte ABA-GE trägt in Kombination mit einer extrazellulären ß-D-Glucosidaseaktivität im Blattapoplast zu einer Stabilisierung und Intensivierung des ABA-Langstreckensignals bei.
Das Adapterprotein TRAF2 und seine Bedeutung für die Todesrezeptor-vermittelte Signaltransduktion
(2020)
Während die Rolle des tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)2 in der Signaltransduktion der TRAF-interagierenden Rezeptoren der TNF Receptor (TNFR)- Superfamily (TNFRSF) bereits in der Vergangenheit umfassend erforscht wurde, ist die Rolle und Funktion dieses Adapterproteins für die Signalgebung der Todesrezeptoren nicht vollständig aufgeklärt. Die unklare Funktion der Really Interesting New Gene (RING) E3 Ligase Domäne in TRAF2 und die Abhängigkeit von Caspasen für die Aktivierung des klassischen nuclear factor κB (NFκB)-Signalweges führten in dieser Arbeit zur Herstellung von CRISPR/Cas9 knockout (KO) Zellen, bei denen TRAF2 in der Kolorektalkarzinomzelllinie HCT116 als auch in den Fibrosarkomzellen HT1080 ausgeschaltet wurde. Diese Zellen wurden zuvor so modifiziert, dass die Apoptose „downstream“ der Caspase-8-Aktivierung nicht weiter induzierbar war. HCT116-Zellen exprimierten hierzu ein mutiertes Allel der Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) und HT1080-Bcl2-TNFR2 Zellen das anti-apoptotische Protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2).
Im Fokus dieser Arbeit waren die Todesrezeptoren TNFR1, TNF-Related Apoptosis Inducing Receptor (TRAILR)1/2 und Cluster of Differentiation(CD)95. In den TRAF2-KO Zelllinien war der alternative NFκB Signalweg konstitutiv aktiv und der TNFR1-induzierte klassische NFκB-Signalweg inhibiert. Die proinflammatorische Signalgebung in Form der Interleukin (IL)8 Produktion war in den CD95-artigen Todesrezeptoren signifikant, aber nicht vollständig, reduziert und erfolgte Caspase-8-Aktivität unabhängig. Der Effekt der TRAF2-Deletion konnte durch eine Rekonstitution von TRAF2, jedoch nicht durch eine Überexpression von TRAF1 wiederhergestellt werden.
Des Weiteren führte die TRAF2-Defizienz zu einer verstärkten Procaspase-8- Prozessierung nach Aktivierung von Todesrezeptoren, die überraschenderweise mit einer Reduktion der Caspase-8-Aktivität einherging. Die Prozessierung der Procaspase-8, jedoch nicht die Aktivierung des klassischen NFκB-Signalweges wurde vermutlich durch eine verringerte Rekrutierung von cellular inhibitor of apoptosis protein (cIAP)1 an den TNFR1 erreicht. Die Expression der anti-apoptotischen Proteine FADD-like ICE (FLICE) Inhibitory Protein (FLIP)Long(L), FLIPShort(S) und cIAP1 wurde nicht von der TRAF2-Depletion beeinflusst.
Somit konnte in dieser Arbeit ein nicht-obligatorischer Effekt von TRAF2 auf die Regulation der proinflammatorischen Todesrezeptor-vermittelten Signaltransduktion nachgewiesen werden, die durch TRAF1 nicht ersetzt werden kann. Des Weiteren wurde eine bisher nicht beschriebene, stabilisierende Wirkung von TRAF2 auf die Capsase-8-Aktivität gezeigt.