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In der vorliegenden Arbeit wurden Lymphoproliferationen und maligne Non-Hodgkin-Lymphome der B-Zellreihe, die eine Infektion der Tumorzellen mit dem Epstein-Barr Virus aufwiesen, hinsichtlich ihres Immunphänotyps und ihrer zytogenetischen Aberrationen durch Fluoreszenz in-situ Hybridisierung charakterisiert. Von besonderer Bedeutung war es, durch eine detaillierte Analyse der klinischen Daten Vorerkrankungen/Zweiterkrankungen mit einer möglichen Immunsuppression zu identifizieren. Die erhaltenen Daten wurden mit denen EBV-negativer diffuser grosszelliger B-Zell Lymphome verglichen. In der Gewebe-Array-Technik konnten letztlich 69 Fälle detailliert charakterisiert werden. Von 53/69 (77%) dieser Lymphoproliferationen, die sämtlich eine EBV-Assoziation aufwiesen, konnten klinische Daten erhalten werden. Die detaillierte Analyse dieser Daten zeigte, dass in der grossen Mehrzahl der Fälle eine für eine EBV-Infektion prädisponierende Vor- bzw. Grunderkrankung vorlag (44/69 Fälle, 64%). Dabei handelte es sich in 9 Fällen um eine HIV-Infektion, in 12 Fällen um eine Post-Transplantations lymphoproliferative Erkrankung, in 19 Fällen um einen Zustand nach vorangegangener, therapierter Lymphomerkrankung und in vier Fällen um einen Zustand bei Methotrexatbehandlung oder vergleichbarer medikamentöser Immunsuppression. In neun Fällen war nachweislich keine zu einer möglichen Immunsuppression führende Grunderkrankung eruierbar; diese Tumoren, die bei Patienten mit einem Durchschnittsalter von 72,7 Jahren auftraten, entsprechen wahrscheinlich den in der Literatur beschriebenen „senilen“ EBV-assoziierten Lymphoproliferationen, bei denen eine durch das fortgeschrittenen Lebensalter bedingt reduzierte Fähigkeit des Immunsystems zu einer adäquaten Viruskontrolle diskutiert wird. Klinische Angaben, die auf eine mögliche Immunsuppression und damit auf eine mögliche EBV-Assoziation hindeuten, lagen zum Zeitpunkt der Vorstellung des Falles im Referenzzentrum bemerkenswerterweise nur in 26/69 Fällen (38%) vor.EBV-assoziierte Lymphoproliferationen und Lymphome gehören signifikant häufiger dem (immunhistochemisch definierten) non-GCB-Subtyp als dem GCB-Subtyp der DLBCL an (73% versus 37%; p<0,0001). Hier lag ein zusätzlicher interessanter Aspekt vor: EBV-assoziierte Lymphoproliferationen, die aufgrund ihrer Reaktivität der Tumorzellen für CD10 dem GCB-Typ zugeordnet worden waren, exprimierten nur in einer Minderzahl der Fälle (1 von 12; 8%) gleichzeitig auch BCL-6, ein Befund, der bei sporadischen, EBV-negativen DLBCL nur äußerst selten zu finden war (1 von 50; 2%). Weitere immunhistochemische Unterschiede zwischen EBV-assoziierten und EBV-negativen DLBCL lagen für die Expression des Aktivierungsmarkers CD30, der bei EBV-negativen DLBCL eher selten exprimiert wird, aber bei EBV-positiven DLBCL/-Lymphoproliferationen signifikant häufiger positiv ist, und auch für CD138 vor. Auch dieser Marker einer plasmazellulären Differenzierung war bei EBV-positiven DLBCL häufiger exprimiert, wohingegen die Expression von BCL-2 und BCL-6 in den Tumorzellen EBV-assoziierter LPD seltener war. Der häufigere non-GCB-Status, die vermehrte Expression von CD138 und die geringere Reaktivität für BCL-6 legen nahe, dass EBV-assoziierte DLBCL/Lymphoproliferationen offensichtlich aus B-Zellen bestehen oder hervorgegangen sind, die die Keimzentrumsreaktion bereits durchlaufen hatten. Die Analyse der interphasenzytogenetischen Daten und ihr Vergleich zu klassischen zytogenetischen Daten einer Kontrollgruppe von sporadischen DLBCL zeigte, dass chromosomale Bruchereignisse und auch eine TP53 Mutation (ausgewiesen durch die immunhistochemisch nachgewiesene Überexpression des Gens) nur bei denjenigen Fällen auftrat, die konventionell-morphologisch als DLBCL charakterisiert worden waren. Im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde eine signifikant häufigere Rearrangierung von CMYC in EBV-assoziierten DLBCL gefunden; im Gegensatz hierzu waren Bruchereignisse im BCL2- und im BCL6-Locus ohne signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe. Als „Nebenbefund“ konnte in dieser Studie eine Infektion eines – offenbar primär nodalen – DLBCL vom immunoblastisch-plasmoblastischen Subtyp bei einem HIV-positiven Patienten durch das humane Herpesvirus 8 (HHV8) nachgewiesen werden. Diese Konstellation stellt insofern eine Rarität dar, da HHV8-positive DLBCL zumeist extranodal, z.B. in Form des sogenannten „Primären Effusions-Lymphoms“ (PEL) oder in Assoziation zu einer multizentrischen Castleman-Erkrankung bei HIV-positiven Patienten auftreten.
Während der Entstehung von Tumoren können zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivität der Onkogene abhängig sind und die Tumorgenese einschränken. Für das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umständen Seneszenz auslösen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabhängigen Teilprojekten beschäftigen. Eine erhöhte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbrüche an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgelöst, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr führt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abhängig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit für den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und hält deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu können. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein für pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erhöht eine verstärkte Reduktion seiner Proteinmengen die zelluläre Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abhängige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abhängig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abhängige Seneszenz zu umgehen. Darüber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabhängig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur für die Transrepression essentiell ist.
Das Proto-Onkoprotein Myc ist an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer Vielzahl humaner Tumore entscheidend beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde Serin 227 in Fbw7 als Ziel für eine PI3K-abhängige Phosphorylierung identifiziert. Diese Phosphorylierung führt zur Stabilisierung von Fbw7 und steigert die Fähigkeit von Fbw7, Substratproteine zu ubiquitinieren und abzubauen. Um die Bedeutung von Usp28 in der Myc-induzierten Tumorentstehung und in der normalen Gewebehomöostase zu untersuchen, wurde ein konditionales Knockout-Mausmodell für Usp28 charakterisiert. Mäuse mit einer Keimbahndeletion von Usp28 sind lebensfähig, fertil und phänotypisch unauffällig. Weder in Organen der Usp28-negativen Tiere, noch in entsprechenden murinen embryonalen Fibroblasten kann eine Destabilisierung von Myc festgestellt werden. Allerdings zeigen Fibroblasten mit heterozygotem Usp28-Verlust einen Proliferationsdefekt und in Eμ-Myc-Lymphomen dieses Genotyps werden tendenziell niedrigere Myc-Proteinmengen gefunden. Das tumorfreie Überleben ist bei den Eμ-Myc; Usp28 +/- Tieren verlängert.
Das Y-Box-bindende Protein 1 (YB-1) ist ein Vertreter der hochkonservierten Familie eukaryotischer Kälteschockproteine und ein DNA/RNA-bindendes Protein. In Abhängigkeit von seiner Lokalisation übernimmt es Aufgaben bei der DNA-Transkription oder mRNA-Translation. YB-1 ist ein potentielles Onkogen beim Multiplen Myelom (MM), dass in primären MM-Zellen exprimiert ist. Für die funktionellen Untersuchungen von YB-1 in der vorliegenden Arbeit wurden humane Myelomzelllinien (HMZL) verwendet, die als in vitro Modell dieser malignen B Zell-Erkrankung dienen. Aufgrund der potentiellen Expression von YB-1 im Zellkern und/oder Zytoplasma von HMZL, wurde zunächst die Lokalisation des Proteins bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass YB 1 in den HMZL ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine Translokation von YB-1 in den Nukleus kann durch die Serin-Phosphorylierung (Aminosäure 102) in der Kälteschockdomäne induziert werden. Die analysierten Myelomzelllinien zeigen jedoch kein nukleäres YB 1 und keine S102-Phosphorylierung. Diese Ergebnisse stützen die These, dass die Regulation der mRNA-Translation im Zytoplasma die vorherrschende Funktion von YB-1 beim MM ist. YB-1 könnte über diesen Mechanismus seine anti-apoptotische Wirkung vermitteln und die MM-Zellen vor genotoxischem Stress schützen. Um YB-1-regulierte mRNAs zu identifizieren wurden YB 1-Immunpräzipitationen mit zwei HMZL, einer Maus-Plasmozytomzelllinie und einem primären Maus-Plasmazelltumor durchgeführt. Zu den YB-1-gebundenen mRNAs gehören Translationsfaktoren und ribosomale Proteine, die eine starke Beteiligung von YB-1 beim RNA-Metabolismus bestätigen. In der vorliegenden Arbeit wurden spezifisch zwei mRNA-Kandidaten untersucht, die für den malignen Phänotyp von MM-Zellen wichtig sein können: das translationell kontrollierte Tumorprotein TCTP und MYC. Sowohl TCTP als auch MYC wurden bereits in Zusammenhang mit der Proliferation und Apoptose-Resistenz von malignen Zellen beschrieben. Die immunhistochemische Untersuchung der Knochenmarkbiopsien von MM-Patienten ergab eine gute Ko-Expression von YB-1 und TCTP in intramedullären MM-Zellen, während MYC erst in extramedullärem MM-Tumormaterial verstärkt mit der hohen YB 1-Expression korreliert. Die funktionellen Analysen der Arbeit haben gezeigt, dass YB 1 für die Translation der TCTP- und MYC-mRNA essentiell ist. Es kontrolliert die Verteilung dieser mRNAs zwischen translationell aktiven und inaktiven messenger Ribonukleoprotein-Partikeln. Die shRNA-vermittelte Reduktion von YB-1 führte zur Hemmung der TCTP- und MYC-Translation in der Phase der Initiation. Um den Einfluss der Kandidaten auf das Überleben der HMZL zu untersuchen, wurden proteinspezifische Knockdown-Experimente durchgeführt. Beim shRNA-vermittelten TCTP-Knockdown konnten keine Auswirkungen auf die Proliferation oder Viabilität von MM-Zellen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ist MYC für das Überleben und Wachstum der HMZL ausschlaggebend, denn der MYC-Knockdown induzierte Apoptose. Wie beim YB 1-Knockdown war ein Anstieg der Caspase-Aktivität und der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials in den HMZL nachweisbar. Da es beim MYC-Knockdown gleichzeitig zur einer Reduktion der YB 1-Protein- und mRNA-Expression kam, wurde der Einfluss von MYC auf die Transkription des YB-1-Gens untersucht. Mit Hilfe von embryonalen Mausfibroblasten, die ein induzierbares MYC als Transgen besitzen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von MYC mit einer Zunahme der YB-1-mRNA einher geht. YB-1 ist somit ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors MYC. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben zum ersten Mal ein gegenseitiges regulatorisches Netzwerk aufgezeigt, in dem YB 1 transkriptionell durch MYC reguliert wird und YB-1 für die Translation der MYC-mRNA essentiell ist. Die Ko-Expression beider Proteine trägt zum Wachstum und Überleben von malignen Plasmazellen bei.
Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein charakteristisches Merkmal für eine Vielzahl von humanen Tumoren. Durch die transkriptionelle Aktivierung von Genen, die im Zusammenhang mit Metabolismus, Translation und Proliferation stehen, wird dadurch das Tumorwachstum begünstigt. Myc bildet zudem mit dem Zinkfinger-Protein Miz1 einen Komplex, der hemmend auf die Transkription von Zielgenen wirkt. Bisher sind nur wenige Myc/Miz1-reprimierte Zielgene bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten genomweit die DNA-Bindestellen von Myc und Miz1 durch Chromatin-Immunpräzipitationen gefolgt von Hochdurchsatzsequenzierung in einer Zervixkarzinomzelllinie bestimmt werden.
Es konnte gezeigt werden, dass Myc an Promotoren aller drei RNA-Polymerasen sowie in enhancer-Regionen bindet, während Miz1 Kernpromotoren von RNA-Polymerase II- und III-transkribierten Genen besetzt. reChIP-Experimente zeigten, dass Myc und Miz1 als Komplex an Promotoren von Zielgenen binden. Zudem wurde ein Miz1-DNA-Bindemotiv identifiziert und der transaktivierende Einfluss von Miz1 auf Gene mit diesem Motiv nachgewiesen. Das überwiegende Vorhandensein von Myc/Max-Komplexen führt zu einer Transaktivierung von E-Box-haltigen Promotoren. Andererseits erfolgt die transkriptionelle Repression von Myc/Miz1-Zielgenen an Promotoren, an denen der Myc/Miz1-Komplex vorherrscht.
In aktuellen Publikationen konnte gezeigt werden, dass nach mitogener Stimulation von Lymphozyten es zu einer Erhöhung der Myc-Expression kommt, wodurch Myc als ein genereller Transkriptionsaktivator fungiert, der alle Gene gleichermaßen induziert. Trotz hoher Myc-Mengen in Tumorzellen konnte die generelle Myc-vermittelte Transaktivierung nicht nachgewiesen werden. Zusätzlich zur Myc-abhängigen Transaktivierung von E-Box-haltigen Genen, z. B. beteiligt an Translation und RNA-Prozessierung, und der Miz1-vermittelten transkriptionellen Aktivierung von Genen mit Miz1-Motiv (z. B. involviert in Autophagie), konnte entgegen dem Modell der generellen Genamplifikation durch Myc eine Myc/Miz1-abhängige Repression von Zielgenen belegt werden. Die neu gewonnenen Erkenntnisse des Bindeverhaltens des Myc/Miz1-Komplexes und der daraus resultierenden transkriptionellen Regulation von Myc/Miz1-Zielgenen ermöglichen ein besseres Verständnis der Myc-Funktion in Tumorzellen und könnte zur Verbesserung von Tumortherapien führen.
Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein zentraler Mechanismus in der kolorektalen Karzinogenese. Die Myc-Deletion in Tumormodellen hemmt das Wachstum von Kolonkarzinomen, somit stellt die Inaktivierung von Myc einen Ansatzpunkt in der Behandlung von kolorektalen Tumoren dar. Die direkte Inhibition von Myc ist schwierig, da Myc keine katalytische Aktivität besitzt und stattdessen für die Myc-Funktion nötige Protein-Protein- oder Protein-DNA-Interaktionen angegriffen werden müssen. Die E3-Ubiquitin-Ligase Huwe1 interagiert sowohl mit Myc als auch mit dem Myc-interagierenden Protein Miz1 und ist im Kolonkarzinom überexprimiert. Huwe1 ubiquitiniert Myc und induziert darüber dessen Transaktivierungsfunktion. Die Inaktivierung von Huwe1 ist somit eine vielversprechende Möglichkeit für die Inhibition der Myc-Funktion und die Therapie des Kolonkarzinoms.
In dieser Arbeit wird mittels shRNA-vermittelter Depletion von Huwe1 in Zellkulturexperimenten gezeigt, dass Huwe1 für die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien und für die Transaktivierung von Myc-Zielgenen benötigt wird. Mit zwei von Boehringer Ingelheim identifizierten niedermolekularen Huwe1-Inhibitoren (BI8622 und BI8626) ist es möglich, die Huwe1-Funktion spezifisch in Zellen zu blockieren. Die Huwe1-Inhibitoren induzieren einen Proliferationsarrest in kolorektalen Karzinomzelllinien, wohingegen die Substanzen auf embryonale Stammzellen keine Auswirkungen haben. Die Inaktivierung von Huwe1 führt zu einer Akkumulation von Miz1 an Promotoren Myc-aktivierter Zielgene und darüber zu einer vermehrten Bildung repressiver Myc/Miz1-Komplexe, was mit einer Deacetylierung von Histon H3 und einer transkriptionellen Repression Myc-gebundener Gene assoziiert ist. Miz1 akkumuliert nach Huwe1-Inhibition ebenso an direkten Miz1-Zielgenen, deren Expression bleibt aber unbeeinflusst. Diese Daten weisen darauf hin, dass eine kontinuierliche Degradierung von Miz1 durch Huwe1 zur Transaktivierung von Myc-Zielgenen in Kolonkarzinomzellen nötig ist. Damit wurde ein neuer Mechanismus identifiziert, über den Huwe1 die Myc-Transaktivierung reguliert und der eine tumorzellspezifische Repression der Myc-Funktion mit Hilfe von Huwe1-Inhibitoren ermöglicht.
Der Tumorsupressor APC ist in der Mehrzahl aller Fälle kolorektaler Karzinome bereits in
der initialen Phase der Karzinogenese mutiert. Diese Mutationen führen zu einer aberranten Aktivierung des Wnt-Signalweges sowie zu weiteren die Karzinogenese vorrantreibenden Aktivitäten, beispielsweise einem veränderten Migrationsverhalten. Dieser Dissertation
zu Grunde liegt die Idee, dass durch die Trunkierung des APC-Proteins aber auch Abhängigkeiten von Genaktivitäten entstehen, die zuvor entbehrlich waren. Solche synthetisch
letalen Gene sollten in einem high-content shRNA-Screen gefunden werden.
Für die Durchführung des Screens wurde ein von der SW480 Kolonkarzinomzelllinie
abgeleitetes, isogenes Zellsystem generiert, welches durch Induktion mit Doxyzyklin das
vollständige APC-Allel (FL-APC) exprimiert. Infolge dieser Expression zeigen die Zellen
einen weniger malignen Phänotyp. Dies spiegelt sich darin wider, dass die Zellen durch
FL-APC Expression in ihrer Wnt-Signalwegsaktivität eingeschränkt werden. Doxyzyklininduzierte Zellen sind schlechter in der Lage ohne Adhäsion zu proliferieren als nicht induzierte Zellen. Andererseits ist ihre Fähigkeit einem FKS-gradienten entlang zu migrieren
verbessert.
Der shRNA-Screen wurde mit der Decipher shRNA-Bibliothek durchgeführt. Diese
enthält 27.500 verschiedene shRNAs mit Interferenzaktivität gegen 5.000 mRNAs, die potentiell pharmakologisch inhibierbare Proteine kodieren. Die besten zwei Kandidaten für
eine synthetisch letale Interaktion mit trunkiertem APC, BCL2L1 und EIF2B5 wurden im
Verlauf einer Masterarbeit bzw. direkt in dieser Disseration validiert. EIF2B5 zeigte in vitro nach Depletion durch unterschiedliche shRNAs einen di erentiellen Proliferationse ekt
bei FL-APC induzierten im Vergleich zu kontrollbehandelten Zellen. Dieser di erentielle
E ekt konnte in einem weiteren Modellsystem, SW480 Zellen mit konstitutiver FL-APC
Expression, ebenfalls validiert werden.
Durch Expression einer shRNA mit Aktivität gegen EIF2B5 werden in beiden Zellsystem die unfolded protein response (UPR) Gene DDIT3 und splXBP1 aktiviert. Interessanterweise werden durch die Expression von FL-APC diese Gene reprimiert. Im Promotor
der EIF2B5-mRNA be ndet sich eine Bindestelle für MYC. Es ist denkbar, dass durch die
Expression von FL-APC eine globale Veränderung der Genexpression vorgenommen wird,
die einerseits eine Repression von EIF2B5 nach sich zieht aber andererseits eine hierdurch
ausgelöste ER-Stress Antwort verhindert. Eine Inhibition von EIF2B5 ohne diese Adaption
andererseits führt nach diesem Model zu einer UPR-aktivierten Apoptose.
In einem zweiten Projekt wurde das überraschende Verhalten von Kolonkarzinomzellen untersucht, die nach Zugabe von BEZ235, einem dualen PI3K/mTOR Inhibitor, trotz
gegenteiliger Erwartungen MYC-Proteinmengen erhöhen. Eine Repression wurde erwar-
tet, weil die Inhibition von PI3K einerseits zu einer proteasomalen Destabiliserung und
andererseits die mTOR Inhibition zu einer verringerten Synthese von MYC führen sollte.
Während bereits gezeigt werden konnte, dass durch einen FOXO-vermittelten Mechanismus MAPK-abhängig die MYC-Expression verstärkt wird, wurde in dieser Dissertation
die erwartete Translationsinhibition untersucht. BEZ235 inhibiert zwar CAP-abhängige
Translation, das MYC Protein wird jedoch aufgrund einer IRES-vermittelten Translation
weiterhin exprimiert. Silvestrol, ein Inhibitor der Helikase eIF4A andererseits interveniert
mit CAP- und IRES-abhängiger Translation und kann die MYC-Proteinkonzentrationen
verringern. Wir konnten zudem feststellen, dass die Applikation von Silvestrol auch in vivo
möglich und wirksam ist und zudem tolleriert wird. Dies gibt Anlass zur Ho nung, dass
eine Intervention der Translation auch im Menschen eine valide Strategie zur Behandlung
MYC-getriebener Tumore sein könnte.
Eine veränderte Expression des Transkriptionsfaktors MYC wird als entscheidender Faktor für Tumorentstehung und -progress im kolorektalen Karzinom gesehen. Somit ist die Hemmung dessen Expression und Funktion ein zentraler Ansatz bei der zielgerichteten Tumortherapie.
Als geeignete Strategie, sowohl die Halbwertszeit als auch die Translation von MYC zu verringern, erschien eine duale PI3K-/mTOR-Hemmung durch den small molecule-Inhibitor BEZ235. Gegenteilig ist jedoch unter Behandlung mit BEZ235 eine verstärkte MYC-Expression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu beobachten. Neben verstärkter Transkription, konnte eine verstärkte IRES-abhängige Translation von MYC nach Hemmung der mTOR-/5´Cap-abhängigen Translation durch BEZ235, als Ursache der MYC-Induktion nachgewiesen werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die Induktion von MYC nach PI3K-/mTOR-Hemmung durch eine kompensatorische Aktivierung des MAPK-Signalwegs in Folge einer FOXO-abhängigen Induktion von Rezeptortyrosinkinasen, stattfindet.
Eine mögliche Strategie, diese Feedback-Mechanismen zu umgehen, ist die direkte Hemmung der Translationsinitiation. Hierfür wurden Rocaglamid und dessen Derivat Silvestrol als small molecule-Inhibitoren der eIF4A-Helikase verwendet. Im Gegensatz zur PI3K/mTOR-Hemmung, ist durch eIF4A-Inhibition eine Reduktion der MYC-Proteinexpression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu erreichen – ohne einhergehende MAPK-Aktivierung.
Anhand der Ergebnisse kann postuliert werden, dass Silvestrol das Potential besitzt, sowohl die Cap-/eIF4F-abhängie als auch die somit eIF4A-abhängige IRES-vermittelte Translation von MYC zu hemmen.
Weiterhin kann eine proliferationshemmende Wirkung durch Silvestrol auf Kolonkarzinom-Zellen in vitro, via Zellzyklusarrest und Induktion von Apoptose, gezeigt werden. Dies stellt die Voraussetzung für eine potentielle Eignung als tumorhemmender Wirkstoff in der Therapie des kolorektalen Karzinoms dar.
Das kolorektale Karzinom ist eines der häufigsten beim Menschen vorkommenden
Karzinome [2]. Diesem liegen unterschiedliche Mutationen zugrunde, die in knapp 100%
der kolorektalen Karzinome zu einer Überexpression von MYC führen, welches als
Transkriptionsfaktor maßgeblich den Zellzyklus, Proliferation und Vaskularisierung
beeinflusst [10,16]. Damit stellt MYC ein potenzielles Therapieziel in der Behandlung des
Kolorektalen Karzinoms dar. Zusätzlich konnte in den letzten Jahren ein Onkoprotein
namens CIP2A identifiziert werden, welches nach Depletion mit einem Verlust von MYC
Protein einhergeht [69]. Zusätzlich ist CIP2A ein unabhängiger prognostischer Faktor im
Kolorektalen Karzinom [70].
Diese Arbeit konnte zeigen, dass CIP2A-depletierte Zellen einen deutlichen
Wachstumsnachteil gegenüber unbehandelten Zellen zeigen. Dieser Unterschied kann nicht
durch eine gesteigerte Apoptose, sondern vielmehr durch einen verlängerten Zellzyklus
erklärt werden. Weiterhin konnte eine neue Zelllinie mit DOX-induzierbarer shCIP2A
hergestellt werden, die für weitere Experimente genutzt werden kann. Entgegen der
Wirkweise im Zervixkarzinom [69], konnte im kolorektalen Karzinom kein Einfluss auf die
Stabilität von MYC Protein durch CIP2A nachgewiesen werden. Auch konnte der Verlust
von MYC nach CIP2A Knockdown nicht durch gleichzeitige Inhibierung des Abbaus, durch
Okadasäure, MG132 oder in den FBWX7-defizienten Zellen, verhindert werden. Stattdessen
resultiert die Herunterregulation von CIP2A in einem leichten Rückgang der MYC-mRNA
Menge und einem deutlichen Verlust an MYC-Protein. In Zellen mit verschiedenen
Konstrukten der MYC Transkripte kann dieser Verlust an MYC Protein auf eine
translationelle Regulation in der 5’UTR zurückgeführt werden, was eine bisher nicht
beschriebene Wirkweise von CIP2A darstellt. Da CIP2A in normalen Zellen praktisch nicht
exprimiert ist [78], könnte dies ein mögliches Ziel in der Tumortherapie darstellen. Dieses
gilt es in weiteren Experimenten noch genauer zu untersuchen.