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Viele Organoide sind bisher nur stark vereinfachte Modelle der Originalgewebe, da sie nur aus dem Gewebsparenchym bestehen. Um neurale Organoide näher an das Originalgewebe zu bringen, ist ein wichtiger Schritt mesenchymale Anteile zu integrieren. In dieser Arbeit war die wichtige Fragenstellung, ob neurale Organoide sich mit mesodermalen Progenitorzellen zu einem gemeinsamen Gewebe vereinigen lassen.
Um die Generierung von neuro-mesenchymalen Organoiden zu erreichen, wurden geeignete Differenzierungsprotokolle zur Erzeugung neuroepithelialer und mesodermaler Aggregate aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen etabliert. Anschließend wurden die Sphäroide vereinigt und eingehend histologisch charakterisiert. Darüber hinaus wurde die Organoidentwicklung unter dem Einfluss von Hypoxie analysiert. Um die Organoide anschaulich mit der tatsächlichen Embryogenese vergleichen zu können, wurden Schnitte von Hühnerembryonen angefertigt. Die neuro-mesenchymalen Organoide wurden insgesamt 280 Tage kultiviert und an verschieden Zeitpunkten untersucht.
Die hier präsentierten Daten zeigen, dass die erzeugten neuro-mesenchymalen Organoide viele Aspekte der natürlichen Embryogenese in Zellkultur nachahmen können. So wurde die Ausbildung neuralrohrähnlicher Strukturen, die von einem perineuralen Gefäßplexus umgeben sind, gezeigt. Des Weiteren wurde eine Interaktion von Astrozyten/radiale Gliazellen mit dem entstehenden Gefäßnetz beobachtet. Schließlich zeigten sich das Einwandern von mikrogliaartigen Zellen aus dem mesenchymalen Organoidteil in das Nervengewebe.
Diese Arbeit bildet die Basis für die Generierung neuro-mesenchymaler Organoide als realistisches Modellsystem für die Entwicklung des Nervensystems. Solche Modellsysteme können für die Erforschung von Krankheiten, Toxizitätsstudien sowie Medikamententests verwendet werden.
Rekrutierung von Stromazellen aus gefäßwandresidenten Vorläuferzellen während der Tumorgenese
(2021)
Tumore bestehen nicht nur aus malignen Zellen, sondern ebenfalls aus einer Vielzahl an nicht tumorigenen Zellen, die den Tumor auf vielfältige Weise unterstützen und den Tumor vor therapeutischen Maßnahmen schützen. Die Frage der Herkunft dieser Zellen insbesondere in einem nicht vaskularisierten Tumor ist daher auch für die Entwicklung zukünftiger Therapeutika relevant. In dieser Arbeit wurde eine Methode etabliert, die im dreidimensionalen Raum die Untersuchung des Einflusses von Tumorzellen auf die vaskuläre Adventitia am Model der Mausaorta ermöglicht. Dazu erfolgte die Einbettung von Alginatbeads aus verschiedenen Tumorzelllinien in eine gemeinsame Kollagenmatrix mit murinen Aortenringen. Während des zehntägigem Versuchszeitraums wurde die Aussprossung von Zellen aus den Aortenringen beobachtet und quantifiziert. Es wurde festgestellt, dass die Auswanderung während des Versuchszeitraums zunimmt und dass die Konfrontation mit der Zytokinmischung der Tumorzellen zu einer stärkeren Aussprossung führt, als die Stimulation mit VEGF oder keine Stimulation. Eine gerichtete Auswanderung der Zellen in Richtung der Tumorbeads konnte nicht nachgewiesen bzw. bestätigt werden. Kapilläre Aussprossungen waren nur in geringem Ausmaß zu beobachten. Bei Charakterisierung der ausgewanderten Zellen mittels immunhistochemischer Färbungen waren keine F4/80-positiven und nur einzelne CD34-positive Zellen zu finden. CD31-positive Endothelzellen stellten die Mehrheit der ausgewanderten Zellen bei Tumorzellkonfrontation. Perizyten, die mit dem Marker NG2 gefärbt wurden, stellten eine Mehrheit der migrierten Zellen bei allen Bedingungen.
Die in dieser Arbeit etablierte Methode des Aortenring-Bead-Konfrontationsassays ermöglicht es, in Echtzeit den Einfluss von Tumorzellen auf die Gefäßwand im dreidimensionalen Raum zu beobachten. Der Aortenring-Bead-Konfrontationsassay bietet eine Vielzahl an Variationsmöglichkeiten und stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, die Lücke zwischen zweidimensionalen in vitro-Experimenten und kostenintensiven in vivo-Versuchen zu schließen.
5.1 Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden Tumore bestehen nicht nur aus Tumorzellen, sondern auch aus der sie umgebenden extrazellulären Matrix (EZM), und Stromazellen wie Fibroblasten (cancer-associated fibroblast; CAF) und Endothelzellen (tumor endothelial cell; TEC). Diese Stromazellen haben durch die Ausschüttung von Zytokinen, proteolytischen Enzymen, Wachstums- und Angiogenesefaktoren einen entscheidenden Einfluss auf die Tumorprogression. Sie unterscheiden sich von den Stromazellen der normalen Gewebe durch die Expression von sogenannten Tumorstroma-assoziierten Antigenen (TSAA). Damit sollten Therapien, die auf TSAA abzielen, universell einsetzbar und weniger anfällig gegenüber Resistenzentwicklungen (immune escape Mechanismen) sein, da Stromazellen im Gegensatz zu neoplastischen Zellen genetisch relativ stabil sind. Für eine Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden wählten wir die TSAA Endoglin und Fap, welche während der Wundheilung und im Tumorstroma induziert werden. Dabei sollte überprüft werden, ob prophylaktische Vakzinierungen in C57Bl/6j Mäusen Peptid-reaktive T-Zellen induzieren können, und das Wachstum von transplantieren Grm1-transgenen Tumoren reduziert werden kann. In der Tat konnten wir sowohl bei Endoglin- als auch bei Fap Peptid vakzinierten Tieren in vivo Peptid-reaktive Lymphozyten im Blut und zu einem geringeren Anteil auch in der Milz nachweisen, welche Peptid-gepulste syngene Milzzellen lysieren konnten. Allerdings konnte in beiden Fällen keine Reduktion des Tumorwachstums gegenüber der Kontrollgruppe beobachtet werden. Bei der Fap-Peptid-vakzinierten Gruppe war das Tumorwachstum gegenüber der Kontrollgruppe sogar gesteigert. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Induktion Fap-Peptid-reaktiver T-Zellen tumorpromovierend wirkt. Möglicherweise könnte aber durch eine Modifikation des Vakzinierungsprotokolls bzw. durch eine Kombination mit anderen Immuntherapeutika ein verbessertes Ansprechen auf eine Endoglin bzw. Fap basierte Immuntherapie erzielt werden. 5.2 Immunsuppressive Mechanismen im Grm1-transgenen Melanom-Modell Grm1-transgene Mäuse entwickeln spontan kutane Melanome. Dieses Modell erlaubte es uns in der vorliegenden Arbeit spontane Immunantworten im Laufe der Melanomentstehung zu untersuchen. Hierfür analysierten wir sowohl ex vivo als auch in vitro aus Milz und Lymphknoten gewonnene Lymphozyten von Mäusen, welche keine Tumorläsionen bzw. eine niedrige oder hohe Tumorlast aufwiesen. Dabei konnten wir ex vivo einen Anstieg der Frequenz aktivierter CD4+ und CD8+ Lymphozyten mit zunehmender Tumorlast zeigen. Bei tumortragenden Tieren exprimierten jedoch hauptsächlich CD4+ T-Zellen Aktivierungsmarker nach in vitro Stimulation. Interessanterweise waren diese Zellen tumortragender Tiere auch funktionell beeinträchtigt, was sich in einer verminderten Proliferationskapazität nach in vitro Stimulation zeigte. Weitere Analysen ergaben, dass die erhöhte Frequenz regulatorischer T Zellen bei tumortragenden Tieren ein frühes Ereignis im Laufe der Tumorentstehung ist. Gleichzeitig konnte auch ein starker Anstieg der immunsupprimierenden Zytokine Tgf-β1 und Il-10 sowohl in den Lymphknoten als auch im Tumorgewebe beobachtet werden. Dabei war die Tgf-β1-Expression sowohl im Tumor als auch im tumor-drainierenden Lymphknoten erhöht, während Il-10 im Tumor nur moderat exprimiert wurde, was eine komplexere Regulation der Il-10-Expression nahe legt. Dies bedeutet, dass in Grm1-transgenen Mäusen ähnlich wie auch bei Melanompatienten zelluläre und zytokinabhängige Mechanismen zur Tumorentstehung beitragen und dieses Modell daher geeignet ist, um präklinisch immunmodulierende Therapieansätze zu testen.
In dieser Arbeit wurde die Tauglichkeit des Excimer-Lasers zur Präparation von Spendertransplantaten für die posteriore lamelläre Keratoplastik ex vivo untersucht. Von besonderem Interesse war daher der Effekt des Lasers auf die stromale Oberflächenbeschaffenheit und das Endothel des Transplantates. Material und Methoden: Zur Untersuchung wurden frisch enukleierte Schweinebulbi zunächst vor und nach einer Epithelabrasio mittel OLCR pachymetrisch vermessen. Die Korneae der Bulbi wurden dann unter standardisierten Bedingungen einer Excimer-Laserablation unterzogen und nach erneuter pachymetrischer Vermessung einer der Untersuchungsgruppen zugeordnet. Nach Präparation eines Hornhautlentikels, wie für eine posteriore lamelläre Transplantation erfolgte für 63 Präparate eine Alizarinrot-Trypanblau-Doppelfärbung, für 10 Präparate eine Inkubation für 48 Std. in Kulturmedium, um danach einen Spätschaden beurteilen zu können, für 12 Präparate eine Fixation für die histologische bzw. für 6 Präparate ein Fixation für die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung. Ergebnisse: Die Beurteilung der Endothelvitalität ergab, dass der Schaden der gelaserten Lentikel der Restdicken 50 bis 400 µm (n = 54) mit im Mittel 7,1% untereinander nicht signifikant unterschiedlich war (p > 0,05). Bei bis zur Perforation behandelten Lentikeln wurde das Signifikanzniveau mit im Mittel 62,8 % Schaden (p < 0,05) allerdings erreicht, da eine erhebliche Endothelschädigung zu finden war. Die Endothelvitalität der Restdicken 50 bis 400 µm war am Präparat zentral und peripher gleichermaßen gegeben (p > 0,05). Das Signifikanzniveau mit p < 0,05 wurde erreicht beim Vergleich der gelaserten Lentikel (7,1% Schaden) mit der unbehandelten Kontrollgruppe (0,6% Schaden). Ebenfalls bei der Beurteilung des Spätschadens der Endothelvitalität zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen der Kontroll- und der Lasergruppe (p < 0,05). Allerdings war der Spätschaden der Lasergruppe im Vergleich mit dem Sofortschaden der Lasergruppe nicht signifikant größer (p > 0,05). Es zeigten sich keine histologischen Unterschiede zwischen den Hornhautlentikeln die mittels Excimer-Laser-Ablation präpariert worden waren und den nichtbehandelten Kontrollhornhäuten Die Oberflächenbeschaffenheit des Stromas stellte sich im Rasterelektronenmikroskop unabhängig von der Tiefe der Laserablation einheitlich dar. Diskussion: Die Laser-Präparation könnte im Vergleich zu den herkömmlich Methoden eine weitere, ggf. schonendere Möglichkeit darstellen, Präparate für eine posteriore lamelläre Keratoplastik herzustellen. Die Vorteile eines solchen Vorgehens lägen in einer besonders präzisen/kontrollierten Präparationstechnik, die eine exakte Wahl der Spenderlentikeldicke ermöglichen würde. Die Ergebnisse belegen die Möglichkeit mit dem Laser saubere, kontrollierte Ablationen bis 8,75 mm Durchmesser ohne in der Histologie oder Oberflächenbeschaffenheit nachweisbaren Schaden durchzuführen, so dass aus diesen 8 mm große lamelläre Transplantate für eine posteriore lamelläre Keratoplastik trepaniert werden können. Selbst bei einer Restdicke deutlich unter 100 µm blieben dabei Schäden aus. Auch die Endothelvitalität nach Laserablation war von der Ablationstiefe unabhängig und lag mit 7,1 % noch in einem akzeptablen Bereich.