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Der adenovirale SOX9-Gentransfer induziert nach 3-wöchiger in vitro Pelletkultur die chondrogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Pelletkultur wirksamer als der TGFB1 Gentransfer mit geringerer Chondrozytenhypertrophie. Eine solche Technologie könnte zukünftig in vivo die Bildung von stabilerem hyalinem Knorpelregeneratgewebe ermöglichen.
Im seltenen Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP) treten aufgrund der Fehlfunktion der Gewebe-unspezifischen Alkalischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) skelettale und dentale Symptome in sehr variabler Ausprägung auf. Der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ist das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen ein erstes Anzeichen dieser Erkrankung. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Modell der HPP etabliert und der Fokus auf die dentalen Aspekte dieser Erkrankung gelegt. Hierzu wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Bereichen analysiert, die bei einer Erkrankung von dieser Mineralisierungsstörung betroffen sind. Es wurden dentale Stammzellen aus der Pulpa (dental pulp stem cells, DPSCs) und dem parodontalen Ligament (periodontal ligament stem cells, PDLSCs) isoliert und im Vergleich zu Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) charakterisiert. Um den Einfluss der Spendervariabilität zu reduzieren, wurden aus dem gesamten dentalen Probenmaterial nur vollständige Probenpaare aus DPSCs und PDLSCs von 5 Spendern für die vergleichenden Analysen verwendet. Die dentalen MSCs konnten somit paarweise direkt miteinander verglichen werden.
DPSCs gelten seit ihrer Entdeckung von Gronthos et al. im Jahr 2000 als geeignete Quelle für die Stammzellgewinnung mit vielversprechenden Anwendungsmöglichkeiten im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen muskuloskelettalen Medizin. PDLSCs sind aufgrund der parodontalen Problematik der HPP von besonderem Interesse in dieser Arbeit. Die Isolation von Stammzellen aus Pulpa und PDL konnte mit dem Nachweis der sogenannten Minimalkriterien für MSCs bestätigt werden.
In diesem durch Enzyminhibition mit Levamisol induzierten in vitro Modell der HPP wurde die TNAP-abhängige Genexpression, die Enzym-Aktivität und das osteogene Differenzierungspotenzial an diesen drei Mineralisierungs-assoziierten MSCs untersucht. Die erweiterte Genexpressionsanalyse in Kooperation mit der Core Unit Systemmedizin der Universität Würzburg mit einer RNA-Sequenzierung der PDLSCs ergab interessante Einblicke in die differentielle Genexpression nach der TNAP-Inhibition während der osteogenen Differenzierung und Ansatzpunkte für weitere Analysen. Die beobachteten Genregulationen waren nach dem derzeitigen Verständnis pathologischer Zusammenhänge nachvollziehbar und simulierten in vitro HPP-relevante Signalwege repräsentativ. Insbesondere die signifikante Genregulation von P2X7 und DMP1, sowie Zusammenhänge aus dem Wnt-Signalweg zeigen hinsichtlich der dentalen Aspekte der HPP neue Ansatzpunkte auf. Die erhöhte P2X7-Expression in diesem in vitro HPP-Modell scheint mit der Parodontitis-Problematik der HPP zu korrelieren und verdeutlicht unter anderem die multifaktorielle Ätiologie und Pathogenese der Parodontitis. Die Tatsache, dass die experimentellen Beobachtungen in Einklang mit dem klinischen Bild der HPP gebracht werden können, bestätigt die Relevanz des hier etablierten in vitro Modells. Zusammenfassend konnten anhand dieses in vitro Modells der HPP neue Aspekte aufgedeckt werden, die nicht nur im Hinblick auf die dentale Problematik der HPP aufschlussreich sind.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Verteilungsmuster von PG-Donorzellen in Gehirnen von Mäusechimären, die nach dem Aggregations- und dem ESC-Verfahren generiert wurden, im Embryonalstadium E14.5 untersucht und miteinander verglichen. Während in Aggregations-Chimären eine Präferenz von PG-Donorzellen für eine Besiedelung des Cortex und des Striatum zu beobachten ist, zeigen Gehirnbereiche in ESC-Chimären eine gleichmäßige Verteilung der PG-Donorzellen.
Um die unterschiedliche Besiedelung von PG-Stammzellen in den Chimären erklären zu können, wurden neuronale und gliale Zellfrequenzanalysen durchgeführt. Sowohl bei der relativen Neuronen- als auch bei der relativen Astrozytenhäufigkeit ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Aggregations- und den ESC-Chimären festzustellen. Beide Chimärtypen unterscheiden sich nicht in der Zahl der aus PG-Donorzellen differenzierten Nerven- und Stützzellen.
Das Potenzial von PG-Stammzellen, funktionsfähige dopaminerge Neuronen zu bilden, wurde in den beiden Chimärtypen vergleichend analysiert. In beiden Chimärtypen wurden von PG-Donorzellen abstammende dopaminerge Neuronen nachgewiesen. Sowie für die Neuronen- und die Astrozytenzahl konnte auch für die Anzahl dopaminerger Neuronen kein signifikanter Unterschied zwischen Aggregations- und ESC-Chimären beobachtet werden.
Fragestellung:
Die Therapie von Knochendefekten kritischer Größe mit kompromittiertem Regenerationspotential, stellt ein schwerwiegendes Problem dar. Die Forschung auf dem Gebiet der Knochenheilung hat sich in jüngster Vergangenheit daher auf die Anwendung mesenchymaler Vorläuferzellen (MSZ) zur Stimulierung des Knochenwachstums konzentriert. In der vorliegenden Studie wurde in humanen MSZ eine Überexpression spezifischer Wachstumsfaktoren induziert mit dem Ziel, deren osteogenes Potential zu steigern.
Methodik:
MSZ wurden nach etablierten Protokollen expandiert. Durch adenovirale Transfektion wurde eine überexpression von grün fluoreszierendem Protein (GFP, Kontrolle), indian hedgehog (IHH), bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) und IHH in Kombination mit BMP-2 induziert. Die MSZ wurden für 28 Tage mit osteogenem Differenzierungs- und Kontrollmedium kultiviert. Als weitere Kontrolle dienten native MSZ. Es wurden die Auswirkungen der jeweiligen genetischen Veränderungen auf die metabolische Aktivität (Alamar Blau), die Proliferation (Qubit dsDNA BR), die Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase (ALP)(p-Nitrophenylphosphat), die Mineralisierung (Alizarinrot S, Calcium O-Cresolphthalein) sowie auf die Expression charakteristischer Markergene untersucht (qRT-PCR).
Ergebnis:
In den ersten 72h nach Transfektion konnte eine leichte, im Vergleich zu nativen Zellen nicht signifikante Abnahme der metabolischen Aktivität in allen Gruppen beobachtet werden. Das Proliferationsverhalten transfizierter und nativer MSZ unterschied sich während des Untersuchungszeitraums nicht signifikant. Bei der Analyse der ALP-Aktivität zeigte sich ein typisches Rise-and-Fall Muster. Alle ost Gruppen wiesen sowohl im Assay als auch in der PCR eine signifikant höhere ALP-Aktivität auf. Die Überexpression von BMP-2 und IHH+BMP-2 bewirkte eine signifikant stärkere Mineralisierung an Tag 28. In der PCR zeigte sich für BMP-2 ost und IHH+BMP2 ost ein signifikanter Anstieg der Osteopontin und BMP-2 Expression über die Zeit. Zudem stieg bei allen ost Gruppen die Runx2 Expression bis Tag 21 an.
Schlussfolgerung:
Die virale Transfektion hatte keinen negativen Einfluss auf die metabolische Aktivität der Zellen oder deren Proliferationsverhalten. Die Überexpression von BMP-2 ohne oder in Kombination mit IHH führte zu einer vermehrten Produktion extrazellulärer Matrix und zu einer gesteigerten Genexpression osteogener Marker. Die virale Transfektion stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, das osteogene Potential von MSZ zu steigern.
Weißes Fettgewebe (WAT) stellt heute aus vielerlei Hinsicht ein interessantes Forschungsgebiet dar. Zum einen ist die Prävalenz der Adipositas weiterhin sehr hoch; mit ihr einher gehen Gesundheitsprobleme wie Bluthochdruck, Diabetes, Dyslipidämie und Atherosklerose, sowie deshalb das Bestreben, bessere Behandlungsmöglichkeiten zu entwickeln. Zum anderen hofft man im Bereich des Tissue Engineering, zukünftig mit in vitro hergestelltem weißem Fettgewebe Weichteildefekte decken zu können. Aus therapeutischer Sicht ist die weitere Erforschung von weißem Fettgewebe deshalb von großer Wichtigkeit. In vivo ist weißes Fettgewebe stark vaskularisiert. Die starken physiologischen Schwankungen von Fettgewebe erfordern deshalb ein besonders dynamisches Gefäßwachstum. Für ein genaueres Verständnis der Physiologie von WAT ist es unerlässlich das Zusammenspiel von Gefäß- und Fettzellen zu verstehen. 2-dimensionale Kultursysteme sind in ihrer Aussagekraft über die Bedingungen in vivo jedoch sehr limitiert. Deshalb kommt in der Erforschung von WAT zunehmend die 3-dimensionale Kultivierung zur Anwendung, welche bezüglich des Gewebekontextes einem lebenden Organismus näher kommt und damit eine größere Aussagekraft haben kann.
Ein Ziel dieser Arbeit war, die Voraussetzungen für die Untersuchung der einzelnen Zellfraktionen von Kokulturen aus mesenchymalen Stammzellen aus humanem Fettgewebe (ASC) und mikrovaskulären Endothelzellen (MVEC) zu schaffen. Hierfür wurde erfolgreich ein Protokoll zur Trennung solcher Zellsuspensionen mittels Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) etabliert. Während in vorangegangenen Arbeiten nur eine der beiden Zellfraktionen analysiert werden konnte, ermöglichte es dieses Protokoll nun beide Zellfraktionen einer Kokultur verunreinigungsfrei zu isolieren und zu analysieren.
Dies eröffnet neue Möglichkeiten in der Erforschung des Zusammenspiels dieser beiden Zelltypen. Um diese zu demonstrieren wurde in dieser Arbeit die Expression von vier Genen in ASC und MVEC aus gemeinsamer Kokultivierung in einem 3-dimensionalen Sphäroid-Modell analysiert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene Angiopoietin-2, Interleukin-1B, Interleukin-6 und Leukemia Inhibitory Factor in MVEC bei 3-dimensionaler Kokultivierung mit ASC nach zwei Tagen Kultur stark anstieg, während sich in der Fraktion der ASC kaum Veränderungen zeigten. Dies wiederum spricht für eine angiogene Aktivität der MVEC. Ohne ein Protokoll zur Trennung solcher ASC-MVEC-Kokulturen mittels MACS, welche die weitere Analyse beider Zelltypen erlaubt, wäre diese Untersuchung so nicht möglich gewesen
Ziel dieser Arbeit war auch, der Hypothese über eine Beteiligung des Wnt-Signalwegs an der Steuerung der Adipogenese durch Endothelzellen in ASC-MVEC-Kokultur-Sphäroiden nachzugehen. Zuvor konnte beobachtet werden, dass in diesen die Triglyceridsynthese lokal reduziert war, während sie in ASC-Monokultur-Sphäroiden homogen verteilt und nicht inhibiert war. Hierfür wurden Schnitte von adipogen induzierten ASC-MVEC-Kokultur-Sphäroiden und ASC-Monokultur-Sphäroiden immunhistochemisch auf aktives beta-Catenin gefärbt, wodurch der aktive Wnt-Signalweg innerhalb des Sphäroids dargestellt werden konnte. Tatsächlich konnte innerhalb der Kokultur-Sphäroide für die Hälfte der untersuchten Schnitte eine regionale Erhöhung von aktivem beta-Catenin festgestellt werden, welche auf der Seite der ASC-Monokultur-Sphäroide nicht nachweisbar war. In Betrachtung der Ergebnisse dieser Arbeit -- auch im Kontext weiterer Forschungsergebnisse -- erscheint eine Beteiligung des Wnt-Signalwegs an der Steuerung der Adipogenese in ASC-MVEC-Kokultur-Sphäroiden sehr wahrscheinlich.
In dieser Arbeit konnte ein Beitrag zum Verständnis des Zusammenspiels von ASC und MVEC in 3-dimensionaler Kokultivierung sowie dessen weiterer Untersuchung geleistet werden. Die gewonnenen Erkenntnisse unterstreichen die Anwendbarkeit und Wichtigkeit von 3-dimensionalen Kulturumgebungen in der Erforschung von weißem Fettgewebe, sowohl für die Adipositasforschung als auch für Adipose Tissue Engineering.
Die vorliegende Inaugural-Dissertation beschäftigt sich mit dem Einfluss der Eisenoxidpartikel-Markierung (VSOP) von Mesenchymalen Stammzellen (MSZ) auf Polylaktid-Trägern (OPLA) im Hinblick auf Morphologie, Vitalität und Differenzierung über einen Zeitraum von 28 Tagen.
Histologisch war der intrazelluläre Eisen-III Nachweis mit Hilfe der Berliner Blau Färbung als Zeichen der gelungenen Eisenoxid-Markierung in der VSOP-Gruppe bis zum 28. Tag positiv. Morphologisch zeigten sich im Groben keine Unterschiede zwischen VSOP- und Kontrollgruppe bei ähnlicher Besiedelungsstruktur der Scaffolds mit Betonung der Randbereiche in beiden Gruppen.
Die morphologische Struktur stand in Korrelation mit den Ergebnissen der DNA-Konzentrationsbestimmung in den Konstrukten. Es zeigte sich in beiden Gruppen ein vergleichbarer DNA-Ansteig am Tag 3 nach Besiedelung und ein Abfall der DNA-Konzentration ab Tag 7 in der Kontrollgruppe, bzw. Tag 14 in der VSOP-Gruppe auf ein ähnliches Niveau in beiden Gruppen, welches ungefähr der DNA-Konzentration vor Besiedelung entsprach. Diese Beobachtungen zeigen am ehesten, dass die Vitalität der Zellen in den Konstrukten nicht VSOP-bedingt eingeschränkt ist, sondern von den äußeren Kulturbedingungen abhängig ist.
In der RT-PCR Analyse zeigte sich ein ähnliches Expressionsmuster fast aller untersuchter osteogener Marker in beiden Gruppen. Als VSOP-induzierten Effekt könnte lediglich die vermehrte Expression von BSP in der VSOP-Gruppe verstanden werden bei eingeschränkter Vergleichbarkeit der Proben aufgrund der inhomogenen Expression des Housekeeping-Gens. Erstaunlicherweise wurden alle osteogenen Marker in beiden Gruppen exprimiert, obwohl die Zellen nicht in osteogenem Induktionsmedium kultiviert wurden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die VSOP-Markierung von MSZ, wie bereits in anderen Studien gezeigt, auch in der dreidimensionalen Kultur auf OPLA-Scaffolds eine sichere und wenig zellbeeinflussende Methode ist, die damit zum Nachweis der Stammzellen nach Applikation in Form von Tissue Engineering Konstrukten dienen kann.
Primäre Nestin-positive adulte Stamm-/Vorläuferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Phänotypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Primärzellen in Kultur begründet, das in der vorliegenden Arbeit ausführlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und führt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorläuferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen könnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile Überex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 fördernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-überexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zurückzuführen. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und Überlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zellähnlichen Phänotypen differenzierbarer Vorläuferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur Lösung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie für den Diabetes mellitus leisten.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden humane mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark (mhMSCs) und aus trabekulären Knochenfragmenten (bhMSCs) isoliert und in einem neurogenen Prädifferenzierungsmedium mit BME gefolgt von einem Differenzierungsmedium mit BHA und DMSO kultiviert. Anschließend wurden die differenzierten hMSCs mit den jeweiligen undifferenzierten, im normalen Wachstumsmedium kultivierten, mhMSCs bzw. bhMSCs verglichen. Im Verlauf der 6-tägigen neurogenen Differenzierung zeigte sich eine deutliche Veränderung der Zellmorphologie. Die meisten differenzierten Zellen erschienen kleiner und bildeten lange, für Nervenzellen typische Zellfortsätze aus, die sich teilweise mehrfach verzweigten. Weiterhin fand sich bei den differenzierten mhMSCs und bhMSCs eine Expressionszunahme bzw. eine de novo Expression der neuronalen Marker NSE und tau auf Gen- bzw. Protein-Ebene. Es konnte jedoch keiner Expressionsänderung von NF-M auf Protein-Ebene und in mehr als der Hälfte der Fälle sogar einer Expressionsabnahme auf RNA-Ebene gefunden werden. Die Differenzierung zeigte keinen reproduzierbaren Effekt auf die Expression des Astrozyten-Markers GFAP. Diese Ergebnisse zeigten sich sowohl bei den mhMSCs als auch bei den bhMSCs und lassen vermuten, dass bhMSCs ein ähnliches Potential besitzen wie mhMSCs und nicht wie ursprünglich vermutet, auf die Differenzierung in Zellen mesenchymalen Ursprungs beschränkt sind. Die Tatsache, dass bereits undifferenzierte hMSCs neurogliale Marker (NF-M, NSE, GFAP) exprimieren konnte in dieser Arbeit für mhMSCs bestätigt und erstmals auch für bhMSC beobachtet werden. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass es sich bei mhMSCs und bhMSCs um Neuroglia-Vorläuferzellen handelt, die in der Lage sind in neuronale Zellen (Nerven- und Gliazellen) zu differenzieren, und dass die neurogene Differenzierung eher eine quantitative Modulation der Genexpression als ein einfaches An-/Abschalten Neuronen-spezifischer Gene bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zunächst Zellen vom peripheren Nerven isoliert und anschließend charakterisiert. Die aus dem peripheren Nerven herausgewachsenen spindelförmigen bzw. multipolaren Zellen bildeten mit ihren zahlreichen langen Fortsätzen ein regelrechtes Netzwerk und zeigten eine Expression der für Myelinmarker MPZ und PMP 22 sowie des Schwann-Zell-Markers S 100. Abschließend wurden mhMSCs und bhMSCs für 6 Tage in einem Schwann-Zell-Differenzierungsmedium mit Forskolin kultiviert. Die differenzierten spindelförmigen Zellen zeigten eine für Schwann-Zellen typischen fischzugartige Ausrichtung. Es fand sich eine starke Expressionszunahme der von den undifferenzierten Zellen nur schwach exprimierten Myelinmarker MPZ und PMP 22 auf RNA-Ebene sowie eine kräftige Expressionszunahme bzw. de novo Expression des Schwann-Zell-Markers S 100. Diese Ergebnisse zeigen, dass bhMSCs ebenso wie mhMSCS unter geeigneten Bedingungen in der Lage sind, eine für Schwann-Zellen typische Morphologie zu entwickeln und die Expression einzelner Schwann-Zell-Marker zu steigern. In wie weit sie auch funktionell Schwann-Zellen gleichen und damit entscheidend zur peripheren Nervenregeneration beitragen können, bleibt jedoch noch zu klären.
Zusammenfassung Im Zuge der Säugerentwicklung entsteht aus der totipotenten Eizelle ein Organismus aus mehr als 200 verschiedenen Zelltypen. Dabei wird die Entwicklung und der Erhalt des Tieres von Stammzellen gewährleistet. Während der Embryonalentwicklung gibt es nur transient vorkommende Stammzelltypen, während der adulte Körper die Homoeostase mittels permanent vorhandener somatischer Stammzellen aufrechterhält. Als kennzeichnend für die somatischen Stammzellen galt, dass sie nur die Zellen ihres Gewebes ersetzen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob SSZ tatsächlich auf die Bildung von Zellen ihres Stammzellkompartiments beschränkt sind. Dazu wurden drei verschiedene Stammzelltypen, murine hämatopoetische und humane HSZ sowie murine NSZ in murine Präimplantationsblastozysten injiziert. Da dies die Zellen mit einer Umgebung exponiert, von der die Bildung aller Zelltypen des erwachsenen Tieres ausgeht. Es konnte gezeigt werden, dass zur Mitte der Schwangerschaft Nachkommen aller drei injizierten Stammzelltypen sich präferentiell in den fötalen hämatopoetischen Geweben befinden. Für humane hämatopoetische und murine NSZ wurde gezeigt, dass diese hämatopoetische Vorläufer in hämatopoetischen Geweben der Embryonen bilden, sowie dass Nachkommen dieser Zellen ein erythroides Genexpressionsmuster aktivieren. Der Vergleich adulter chimärer Tiere zeigte, dass HSZ zu nahezu gleichen Teilen neurale und hämatopoetische Gewebe besiedelt hatten. Nachkommen neuraler Stammzellen dagegen vor allem in neuralen Geweben adulter Tiere gefunden wurden. Aus diesen Ergebnisssen lässt sich ableiten, dass SSZ durch die Exposition mit der frühen embryonalen Mikroumgebung zur Bildung heterologer Zelltypen angeregt werden können. Außerdem demonstrieren diese Ergebnisse das unterschiedliche Entwicklungspotenzial von HSZ und NSZ und grenzen es gegenüber dem pluripotenten Differenzierungspotenzial von ES-Zellen ab.