Refine
Has Fulltext
- yes (17)
Is part of the Bibliography
- yes (17) (remove)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (17) (remove)
Language
- German (17) (remove)
Keywords
- Biofilm (17) (remove)
Institute
- Institut für Molekulare Infektionsbiologie (8)
- Institut für Hygiene und Mikrobiologie (4)
- Abteilung für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde (1)
- Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Viszeral-, Gefäß- und Kinderchirurgie (Chirurgische Klinik I) (1)
- Klinik und Polikliniken für Zahn-, Mund- und Kieferkrankheiten (1)
- Lehrstuhl für Orthopädie (1)
- Poliklinik für Zahnerhaltung und Parodontologie (1)
Diese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung von aus Patientenisolaten gewonnenen S. aureus Kulturen und deren Biofilmbildung auf implantatähnlichen Titan-Oberflächen. Ziel war es, den zeitlichen Ablauf bakterieller periprothetischer Infektionen über einen Zeitraum von 21 Tagen zu beschreiben und besser zu verstehen. Dazu sollte überprüft werden, ob ein fluoreszenzspektrometrisch ausgewertetes LIVE/DEAD Assay eine zusätzliche Aussage zum Status der im Biofilm befindlichen Zellen liefern kann. Zudem wurde die Biofilmentwicklung anhand etablierter fluoreszenzspektrometrischer Methoden (Concanavalin-A-Markierung extrazellulärer Polymerer Substanzen, DNA-Markierung mit Hoechst 33342) untersucht. Es konnte ein reproduzierbarer Verlauf der Entwicklung des Biofilms, sowie der DNA-Menge aufgezeigt werden. Das LIVE/DEAD Assay lieferte keine signifikanten Ergebnisse in Bezug auf das Verhältnis lebender zu toter S. aureus Zellen im Biofilm.
Weiter wurde die Angreifbarkeit des frühen, am Titan adhärenten Biofilms (Alter 1-5 Tage) durch das in der Orthopädie gängig eingesetzte Antibiotikum Gentamicin untersucht. Die Wirksamkeit konnte zu jedem getesteten Zeitpunkt der ersten fünf Tage durch Anzucht von Kolonien bestätigt werden. Auch wurde die Wirksamkeit über das LIVE/DEAD Assay überprüft, jedoch konnten hier keine aussagekräftigen Daten gewonnen werden, die diese Methode zur Überprüfung der Antibiotikawirksamkeit empfehlen könnten.
Einleitung: Die Protheseninfektion ist in der Gefäßchirurgie eine seltene, aber gefürchtete Komplikation, da sie bis dato immer noch mit einer hohen Mortalität und Morbidität einhergeht. Protheseninfektionen werden in verschiedenen Klassifikationen dargestellt. Die Pathophysiologie des Infektes verläuft über die Aktivierung des Immunsystems und die Fähigkeit der Erreger, sich vor den Angriffen des Immunsystems zu schützen. Dabei ist der häufigste Kontaminationsweg die lokale Kontamination im OP-Gebiet. Der häufigste Erreger stellt der Biofilm bildende Staphylococcus aureus dar. Nach präoperativer Diagnostik erfolgt die vollständige Explantation der infizierten Gefäßprothese mit lokalem radikalem Debridement des Entzündungsgewebes und Wiederherstellung der Perfusion. Für diesen Gefäßersatz stehen verschiedene Materialien zur Verfügung.
Material und Methoden: Ziel dieser Arbeit ist es, retrospektiv die Therapie der tiefen Protheseninfektion mittels autologer In-Situ-Rekonstruktion durch die V. femoralis superficialis im Zeitraum von September 2003 bis Juni 2010 an der Universitätsklinik in Würzburg zu analysieren. Es wurden insgesamt 24 Patienten behandelt. Es erfolgte eine detaillierte Aufarbeitung der Krankengeschichte, der mikrobiologischen Befunde, sowie der Operationsberichte und Folgeeingriffe. Des Weiteren wurde eine Kontrolluntersuchung im Rahmen der gefäßchirurgischen Sprechstunde durchgeführt.
Ergebnisse: 20 Männer und vier Frauen wurden aufgrund einer Protheseninfektion (6x Frühinfekt, 14x Spätinfekt, 2x persistierender Infekt) operiert, nachdem ihnen eine aortoiliacale, aortofemorale oder iliacofemorale Kunststoffprothese zur Behandlung einer pAVK, eines Aneurysmas, oder aufgrund beider Entitäten implantiert worden war. Am häufigsten zeigte sich als klinisches Erstsymptom eine inguinale Wundheilungsstörung. Lymphfisteln und Infektblutungen belegten Platz zwei und drei. Jedes Mal wurde die V. femoralis superficialis (11x beidseits, 13x einseitig) entnommen, in acht Fällen kombiniert mit der V. saphena magna.
23x erfolgte die Rekonstruktion der Perfusion in-situ, lediglich einmal als extraanatomischer Obturator-Bypass. Bei 19 Patienten (79,2%) konnte ein Pathogen nachgewiesen werden, bei fünf Patienten (20,8%) nicht. In 54,2% der Fälle lag eine Monoinfektion vor, bei 12,5% eine Mischinfektionen. Der häufigste Erreger mit 25% Anteil war Staphylococcus aureus, zweimal gelang der Nachweis eines MRSA. Insgesamt kam es bei sieben Patienten zum Nachweis eines gram-positiven Pathogens, bei sechs Patienten eines gram-negativen Pathogens, was der allgemeinen Entwicklung entspricht.
Bei elf Patienten (45,8%) kam es zu einer postoperativen inguinalen Wundheilungsstörung. Deshalb erfolgten auch die meisten Folgeeingriffe mit chirurgischer Wundtoilette, Vakuum-Okklusiv-Verband, Sekundärnaht oder Meshgraft-Deckung als definitiven Wundverschluss. Fünf Patienten (20,8%) erlitten eine periphere Ischämie bzw. einen Bypass-Verschluss. Davon wurden zwei Patienten auf Höhe des Oberschenkels amputiert. Ein Viertel der Patienten verstarb noch während des stationären Aufenthaltes.
Das Gesamtüberleben am untersuchten Patientengut betrug bei Durchführung dieser Doktorarbeit die Zahl zehn.
Sieben Patienten stellten sich zur Kontrolluntersuchung vor, dreien war dies nur schriftlich möglich. Zweimal erfolgte poststationär eine Ischämie-bedingte Majoramputation. Alle Patienten waren infektfrei. Ein Patient erhielt eine PTA bei Stenose der A. femoralis superficialis rechts nach autologem aortobifemoralem Ersatz. Nach Venenentnahme besteht jedoch bei fünf von sieben Patienten ein mildes bis mittelschweres Phlebödem (1-2cm Umfangszunahme am Knöchel) nach Porter. Zwei Patienten erhalten bis dato eine Lymphdrainage.
Zusammenfassung: Die Protheseninfektion ist eine technische Herausforderung, insbesondere wenn die Aorta mitbetroffen ist. Die V. femoralis superficialis erscheint aktuell die erste Wahl bei Notwendigkeit eines großlumigen Gefäßersatzes zu sein. Sie garantiert bis dato eine Infektfreiheit und eine nahezu hundertprozentige Offenheitsrate. Jedoch ist eine präoperative Patientenselektion aufgrund der generell hohen Mortalität und Morbidität durchzuführen und es sind alle Alternativen zu prüfen, um im Individualfall die bestmögliche Lösung für Patient und behandelnden Arzt zu finden. Denn zur Behandlung einer Protheseninfektion gibt es zurzeit noch keinen Goldstandard. Ob es bei dieser komplexen Art der Erkrankung jedoch jemals EINEN Goldstandard geben wird, ist zu bezweifeln. Weitere Diskussionen und Entwicklungen werden und müssen folgen.
Neisseria meningitidis ist ein humaner Infektionserreger, der Meningitis und Sepsis hervorruft. Das asymptomatische Trägertum im Nasenrachenraum ist entscheidend für die Übertragung des Bakteriums und dessen Interaktion mit dem menschlichen Wirt. Frühere Beobachtungen legen die Annahme nahe, dass Meningo¬kokken im Tonsillengewebe in einem biofilmähnlichen Stadium vorliegen. Daher werden in vitro Biofilme als Modell für das Trägertum verwendet. Expressionsunterschiede zwischen Biofilmen und planktonisch gewachsenen pathogenen Neisserien wurden in wenigen Transkriptomanalysen untersucht, während bisher keine Proteomanalysen durchgeführt wurden. Kartierungen des Proteoms und des Immunoproteoms von Meningokokken liegen allerdings vor. In dieser Studie wurde das Biofilmproteom des unbekapselten N. meningitidis Stammes WUE3671 im Vergleich zum Proteom der planktonisch gewachsenen Bakterien untersucht. Dazu wurde ein auf Silikonschläuchen basierendes Biofilmmodell mit kontinuierlichem Fluss etabliert. Es erfolgte eine Anreicherung bakterieller Biomasse über 48 h, wobei die kolonie-bildenden Einheiten bei 24 h ein Plateau erreichten. Licht- und Elektronen¬mikroskopie belegten die deutliche Zunahme der Biomasse über 48 h und zeigten zudem eine Struktur-ierung des 48 h Biofilms in eine apikale Region mit überwiegend vitalen Meningokokken und eine basale Region mit einer verstärkten Anzahl von Bakterien mit avitalem Erscheinungs-bild. Das Proteom von N. meningitidis Biofilmen, die 24 beziehungsweise 48 h gewachsen waren, wurde mit dem einer exponentiell gewachsenen planktonischen Kultur mit 2D-Gelelektro¬phorese verglichen. Unterschiedlich exprimierte Proteine wurden mit Massen-spektrometrie identifiziert und die Ergebnisse mit Spectral Counting und, wenn möglich, mit spezifischen Antikörpern abgesichert. Die Expression von ungefähr 2 % aller Proteinspots im Biofilm unterschied sich von der in planktonischen Zellen wenigstens um das 2-fache. Es wurden Veränderungen beobachtet, die mit einem Nährstoff- und Sauerstoffmangel sowie einer Zunahme von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) in Verbindung gebracht werden können. Die Expression der Proteine SodC und MntC war im Biofilm deutlich erhöht, was mutmaßlich auf ROS im Biofilm zurückzuführen ist. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MntC in der Tat essentiell für Biofilmwachstum, nicht aber für planktonisches Wachstum ist. Die Daten zu SodC und MntC legen die Hypothese nahe, dass Meningokokken im Biofilm trainiert werden mit Mediatoren des Immunsystems, wie ROS, umzugehen. Zudem wird NMB0573, ein Lrp-Homolog, als wesentlicher globaler Regulator für metabolische Anpassungen im Biofilm postuliert. Es konnte über die Proteomanalyse hinaus gezeigt werden, dass die Adhäsine Opc und Opa, die unter der Kontrolle von NMB0573 stehen, im Biofilm vermindert exprimiert werden.
Escherichia coli ist ein Kommensale des menschlichen und tierischen Gastrointestinaltraktes. Einige E. coli-Stämme sind in der Lage, extraintestinale Erkrankungen beim Menschen wie Harnwegsinfekte, Neugeborenen-Meningitis und Sepsis, sowie beim Tier aviäre Coliseptikämien, hervorzurufen. Ein wichtiger Virulenzfaktor des Bakteriums ist dabei die aus α-2,8-verknüpften Sialinsäuremonomeren aufgebaute K1-Kapsel, die phasenvariabel mit einer hohen Frequenz O-acetyliert werden kann. Im Jahr 2005 konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem für die O-Acetylierung verantwortlichen Enzym um die O-Acetyltransferase NeuO handelt, die von dem K1-spezifischen Prophagen CUS-3 codiert wird. Die Verteilung von neuO in der E. coli K1-Population sowie die funktionelle Relevanz der K1-Kapsel O-Acetylierung für das Bakterium waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit weitestgehend unklar. Eine E. coli K1-Stammsammlung mit 183 Isolaten wurde aufgebaut. Die E. coli K1-Isolate stammten sowohl aus Stuhlproben gesunder Freiwilliger, humanen Harnwegsinfekten, humanen invasiven Erkrankungen (Neugeborenen-Meningitis und Bakteriämie) und aus an Coliseptikämie erkrankten Vögeln. Die Isolate der E. coli K1-Stammsammlung wurden mit der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) typisiert. Es konnten 39 Sequenztypen (ST) sowie fünf Sequenztyp-Komplexe (STC) identifiziert werden. Bei dem mit Abstand häufigsten STC handelte es sich um den STC95, dem 80 Stämme (44%) angehörten. Insgesamt 103 der 183 E. coli K1-Stämme waren neuO-positiv (56%). Das Gen wurde in 78 (98%) der STC95-Isolate, aber nur in 25 (24%) der 103 nicht-STC95-Stämme gefunden. NeuO war also mit dem STC95 assoziiert. Über Sequenzanalysen des CUS-3-Prophagen konnten CUS-3-Genotypen bestimmt werden. Die Gruppierung der CUS-3-Genotypen und der E. coli K1-ST sowie der anschließende Vergleich beider Gruppierungen miteinander offenbarte eine Segregation der Prophagen-Genotypen entsprechend der ST. Daher legen die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse eine Koevolution des Phagen mit seinem Wirt nahe. Einige humane und aviäre E. coli K1-Isolate waren weder auf Basis der MLST bzw. der CUS-3-Genotypisierung noch anhand des Vorhandenseins verschiedener, mit extraintestinal-pathogenen E. coli-assoziierter Gene voneinander unterscheidbar, was die Hypothese einer zoonotischen Transmission dieser Stämme unterstützt. In den in dieser Arbeit durchgeführten funktionellen Analysen konnte weder ein Effekt der NeuO-vermittelten E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung auf die Fähigkeit der Bakterien an humane mikrovaskuläre Gehirnendothelzellen zu adhärieren oder in diese zu invadieren, noch auf die in vivo-Virulenz der Bakterien im Hühnermodell beobachtet werden. Die K1-Kapsel O-Acetylierung verringerte die in vivo-Kolonisierung des Hühner-Gastrointestinaltraktes und die in vitro-Biofilmbildung durch das Bakterium, wohingegen sie die Austrocknungsresistenz von E. coli K1 erhöhte. Möglicherweise dient die phasenvariable neuO-Expression und damit die E. coli K1-Kapsel O-Acetylierung der Anpassung des Bakteriums an wechselnde Umweltbedingungen.
Multizelluläre Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. Häufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizelluläre Lebensweise von humanpathogenen Erregern zurückführen. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-Stämme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazelluläre polymere Substanzen, Adhäsine oder Oberflächen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft trägt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder ähnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Hierfür wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adhäsin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 ΔfimΔflu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypstämmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zusätzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah (‘Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase’) durchgeführt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladhäsionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I (‘Adhesin Involved in Diffuse Adherence’) enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte für Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adhäsin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalität des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante führte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinitäten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazität des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Domänen anderer Autotransporter auf. Für viele dieser Proteine konnte bereits eine adhäsive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine mögliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollständig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde für Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellulären Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erhöhter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint für die Funktionalität von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen ermöglicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur für die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abhängigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen.
1. Zusammenfassung Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger invasiver Infektionen bei Kindern und Heranwachsenden. Der in vielen Ländern niedrigen Inzidenz stehen hohe Raten asymptomatischer Kolonisation des menschlichen Nasopharynx mit Meningokokken gegenüber. Während die Pathogenese durch Meningokokken ausführlich untersucht ist, wurde dem Trägertum von Meningokokken bisher wenig Aufmerksamkeit geschenkt, nicht zuletzt auch wegen des Fehlens eines geeigneten Tiermodells. Kürzlich publizierte Daten lassen die asymptomatische Persistenz von Meningokokken in einem Biofilm-ähnlichen Stadium auf und innerhalb des Tonsillengewebes vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung eines Biofilmmodells für Meningokokken als ein Modell für asymptomatisches Trägertum. Es wurde zudem die Biofilmbildung von Meningokokken unterschiedlichster klonaler Linien mit dem Ziel untersucht, auf molekularer Ebene die Biofilmbildung bei Meningokokken zu verstehen. In statischen Biofilmtests konnte gezeigt werden, dass Biofilmbildung eine ubiquitäre Eigenschaft von Meningokokken ist, solange diese keine Kapsel exprimieren. Hierbei war es unerheblich, ob Trägerisolate oder Isolate aus invasiven Meningokokkenerkrankungen untersucht wurden. Durch die Konstruktion fluoreszierender Meningokokkenstämme und die Etablierung eines Minimalmediums konnte für Meningokokken ein standardisiertes Biofilmmodell unter Flussbedingungen erstellt werden. Das Flussmodell für Meningokokkenbiofilme erwies sich als äußerst robust und reproduzierbar. Es wurde deutlich, dass Meningokokken Biofilme unterschiedlicher Struktur ausbildeten, die teilweise über 120 Stunden in vitalem Zustand gehalten werden konnten. Die Mehrzahl der Stämme bildete heterogene Biofilme mit distinkten Mikrokolonien aus, während andere Stämme homogene Biofilme ohne Mikrokolonien ausbildeten. Diese strukturellen Unterschiede hatten keinen Effekt auf die Antibiotika-Empfindlichkeit der Biofilme. Es konnte gezeigt werden, dass Meningokokkenbiofilme durch Ciprofloxacin und Rifampicin, nicht aber durch Penicillin im Wachstumsmedium abgetötet werden konnten. Diese Ergebnisse passen zu in vivo-Befunden, die zeigen, dass Ciprofloxacin und Rifampicin im Gegensatz zu Penicillin sehr zuverlässig das Trägertum von Meningokokken eradizieren können. Durch die Untersuchung der Biofilmbildung von PilX- und PilE-Mutanten konnte die Bedeutung der Twitching Motility für die Mikrokoloniebildung im Meningokokkenbiofilm aufgezeigt werden. Ausgeprägte Motilität führte zu Mikrokoloniebildung, während weitgehend unbewegliche Stämme flache unstrukturierte Biofilme bildeten. In der vorliegenden Arbeit konnte der Verlust der Mikrokoloniebildung bei der PilX-Mutante durch Reduktion der Piliierung, die zu verminderter Motilität führte, erklärt werden. Autoaggregation der Zellen spielte für die Mikrokoloniebildung keine Rolle, was im Widerspruch zur kürzlich publizierten Rolle von PilX steht. Initiale Schritte der Biofilmbildung bei Meningokokken könnten von extrazellulärer DNA (exDNA) abhängen, da die Zugabe von DNase zur Vorkultur die Biofilmbildung verhinderte, jedoch bestehende reife Biofilme nicht auflöste. Die Funktion, der Mechanismus der Freisetzung, sowie die Menge und Verteilung dieser exDNA in Meningokokkenbiofilmen wird Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.
Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-Stämmen zu treffen, fällt häufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen Stämmen gefunden werden können. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren“ auf. Dazu gehören verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten lässt daher Rückschlüsse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen ökologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizelluläre Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Phänotyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsfähigkeit gegenüber anderen kommensalen E. coli erhöht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabhängig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen möglichen übergeordneten Regulator dieses Phänotyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht dafür bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. Während die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberflächenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colansäure, LPS) einen veränderten Phänotyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten Fällen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abhängig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine für die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die Stämme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel führte zur Aufhebung des zytopathischen Phänotyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abgetötete Bakterien oder Kulturüberstände zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Domänen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher Stärke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erhöhte Transkription oder Promotoraktivität einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabhängigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabhängigkeit konnte durch die Induktion bzw. Überexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schlüsselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem möglichen Regulator clbR nicht überwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivität einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zurückgeführt, welches über CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die natürliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis für einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und könnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen.
Mikrobiologische Untersuchungen zum Vergleich verschiedener Materialien für Mittelohrimplantate
(2007)
An Mittelohrimplantate werden hohe Ansprüche im Bezug auf die Bio- und Formstabilität, intraoperative Handhabung und Schallleitungseigenschaften gestellt. Die Besonderheit bei Mittelohrimplantaten stellt jedoch die potentielle bakterielle Besiedlung des Implantationsgebiets dar. Das Mittelohr hat durch die Tuba auditiva eine Verbindung mit den oberen Atemwegen. Dadurch kann es zum Beispiel durch eine aufsteigende Infektion der Atemwege zu einer bakteriellen Besiedlung der Mittelohrimplantate kommen. Ziel dieser Arbeit war es die Besiedlung von Polystyrol, Gold, Silber, Stahl und Titan durch die Bakterienstämme Escherichia coli, Staphylokokkus epidermidis, Streptokokkus pneumoniae zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden jeweils vier Plättchen eines Testmaterials mit einer Bakterienmonokultur besiedelt. Es wurden zwei Methoden ausgewählt um die Besiedlung der Versuchskeime auf den Testmaterialien zu bestimmen. Zum einem wurden die an den Plättchen adhärierenden Keime abgelöst und nach einer Verdünnungsreihe auf Nährböden ausgebracht. Nach der Bebrütung wurden die entstandenen Kolonien (CFU) ausgezählt. Bei der zweiten Methode wurden die adhärierenden Keime auf den Prüfkörpern belassen und mit einem fluoreszierenden DNA-Farbstoff angefärbt. Mit einem Photometer wurde die Besiedlung der Bakterien auf den Materialien statistisch bestimmt. Polystyrol und Silber dienten als Referenzmaterialien. Bei der Auswertung mittels Photometer musste aufgrund der Eigenfluoreszenz auf die Verwendung von Polystyrol verzichtet werden. Die Ergebnisse beider Methoden ergaben für alle Keime das höchste Adhäsionsverhalten auf Titan. Stahl wurde von den Versuchskeimen ebenfalls gut besiedelt. Auf der Goldoberfläche wurde die geringste Adhäsion der Keime festgestellt. Eine deutliche bakterizide oder bakteriostatische Wirkung von Stahl und Titan konnte bei keinem der verwendeten Bakterienstämme festgestellt werden. Gold hingegen konnte deutlich das Bakterienwachstum hemmen.
Das Gram-positive, Koagulase-negative Bakterium Staphylococcus epidermidis war viele Jahrzehnte als harmloser Kommensale der menschlichen Haut und der Schleimhäute bekannt. Jedoch hat sich S. epidermidis in den letzten zwanzig Jahren zu einem Haupterreger von Nosokomialinfektionen entwickelt. Dabei unterscheidet sich S. epidermidis im Vergleich zu anderen Erregern durch ein sehr begrenztes Spektrum an Pathogenitätsfaktoren, aber auch durch seine Fähigkeit, Biofilme auf künstlichen Oberflächen wie Kathetern und Implantaten formen zu können. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei Hauptaspekten, die in der Pathogenität von S. epidermidis eine wichtige Rolle spielen: (i) dem Quorum-sensing System Agr (accessory gene regulator) und (ii) dem zeitlichen Prozess des Aufbaus, sowie der Regulation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Das Quorum-sensing System Agr ist Teil eines komplexen regulatorischen Netzwerks. In der vorliegenden Arbeit wird durch Proteom- und Transkriptomanalysen gezeigt, dass das Agr-System in S._epidermidis den Hauptregulator für die Sekretion von extrazellulären Proteinen darstellt und darüber hinaus einen großen Einfluss auf die Regulation des Zentralmetabolismus und der Biosynthese von Aminosäuren hat. Mittels Mikroarray-Analyse konnte eine wichtige Verknüpfung des Agr-Systems mit dem pleiotrophen Repressor CodY identifiziert werden, der viele stationäre-Phase Gene im S._epidermidis Wildtyp reprimiert, jedoch nicht in der getesteten agr Mutante. Dieses führt zu einem stark veränderten Phänotyp der S. epidermidis agr Mutante, in Hinblick auf Wachstumskapazität, der Biofilmbildung, der Invasivität und dem Langzeitüberleben. Interessanterweise ergaben wissenschaftliche Studien, dass ca. 17 % der klinischen Isolate natürlich vorkommende agr Mutanten sind. Dieses könnte ein Hinweis darauf sein, dass S. epidermidis agr Mutanten aufgrund ihres stark veränderten Phänotyps und ihrer veränderten biochemischen Bedürfnisse und Kapazität in der Lage sind, andere ökologische Nischen im menschlichen Wirt zu besiedeln. Der zweite Teil dieser Arbeit hat die Biofilmbildung von S. epidermidis zum Thema. Durch die Etablierung eines standardisierten Modells der Biofilmbildung, war es möglich, über die Einführung einer Biofilm-Adhäsion-Ratio die Biofilmbildung als zeitlichen dynamischen Prozess darzustellen und verschiedenste Bedingungen und Stämme miteinander zu vergleichen. Dabei zeigte sich, dass die Biofilmbildung in S._epidermidis ein klar zeitlich strukturierter Prozess ist, der von Umweltfaktoren und der Nährstoffsituation abhängig ist, und dass verschiedene Stämme sehr unterschiedlich auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren. Die zeitliche Analyse der Biofilmbildung mittels konfokaler Lasermikroskopie ergab, dass viele der Bakterien im Biofilm sterben. Dieses macht den Biofilm wesentlich anfälliger für Strömungsscherkräfte, die dann ganze Bakterienverbände ablösen und zu neuen Infektionsherden schwemmen könnten. Somit ermöglicht der Tod einer einzelnen Zelle unter Umständen ein besseres klonales Überleben. Die Mikroarray-Analysen der Genexpression im Biofilm zeigten, dass dieser einen physiologisch klar definierten Prozess durchläuft, der zu einer sehr stark verminderten metabolischen Aktivität und einer erhöhten Antibiotika-Resistenz führt. Darüber hinaus zeigen Bakterien im Biofilm einen weniger aggressiven Charakter, wie die Expression von Proteasen oder anderer Pathogenitätsfaktoren, welches S. epidermidis dabei hilft, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Diese neuen Ergebnisse zur Regulation der Genexpression im Biofilm und zur Rolle des Quorum-sensing Systems Agr in S. epidermidis tragen wesentlich zum Verständnis der Pathogenität und der Physiologie dieses wichtigen nosokomialen Erregers bei. Sie bilden eine wichtige theroretische Grundlage für weiterführende Studien, mit dem Ziel in Zukunft neue Therapie- und Präventionsansätze gegen S. epidermidis-Infektionen zu entwickeln.