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Krebs durch gezielte Zerstörung seiner Energien zu besiegen, ist einer von mehreren vielversprechenden neuen experimentellen Therapieansätzen, die insbesondere in den letzten Jahren in den Fokus des Interesses gerückt sind. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, ein Modell zu entwickeln, mit dem die Wirkung von 2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP), ein Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung, auf den Wärmehaushalt einer Vielzahl an benignen und malignen Zelllinien mit der Methode der Mikrokalorimetrie analysiert werden kann. Nach zahlreichen Vorversuchen konnte schließlich ein adäquates Messsystem definiert werden, das den Anforderungen eines großen Stichprobenumfangs gerecht wurde: die zu untersuchenden Zellen wurden auf 200 mm2 großen Glasplättchen als Monolayer kultiviert und in sonderangefertigten Stahlampullen in einem Mediumvolumen von 3.6 ml unter Verwendung eines geschlossenen Mikrokalorimetriesystems hinsichtlich ihrer Wärmeproduktion für eine Dauer von 9 Stunden untersucht. Störfaktoren wie insbesondere Mediumveränderungen oder Substratlimitierungen konnten durch ergänzende Untersuchungen ausgeschlossen werden. Die Vorversuche und erste Datenanalysen der Versuchsreihen mit der pA1-Zelllinie identifizierten einen unerwarteten Störfaktor: die Plättchendichten variierten trotz strikter Standardisierung bei der Kultivierung der Monolayer erheblich. Um diesen Störfaktor in den Datenanalysen zu berücksichtigten, wurde daher eine verlässliche und exakte Methode zur Ermittlung der Plättchendichten gesucht. 3 verschiedenen Methoden wurden hierfür auf ihre Eignung überprüft, bis schließlich der LDH-Test als adäquates Verfahren zur Bestimmung der Plättchendichten ausgewählt wurde. Anschließend erfolgte ein Testdurchlauf mit 4 Zelllinien und 4 unterschiedlichen Dosisstufen 2,4-DNP (zuzüglich der Nulldosis). Nach Durchführung der ersten Versuchsreihen mit der pA1 Zelllinie konnte ein weiterer Störfaktor identifiziert werden: der ‚crowding-Effekt’. Dieser beschreibt das Phänomen, dass mit zunehmender Zellzahl in einer Kultur die Stoffwechselrate und somit auch die Wärmeproduktion einer Zelle abnimmt. Der crowding-Effekt wurde im Rahmen mikrokalorimetrischer Arbeiten unter Verwendung offener Systeme und somit Zellsuspensionen mehrfach beschrieben und diskutiert. Die vorliegende Arbeit konnte einen crowding-Effekt nun auch für Monolayer nachweisen. Für die vorliegenden Daten konnte der Zusammenhang zwischen Wärmeproduktion und Zellzahl mittels Regressionsanalyse mit der mathematischen Funktion lgY=-0.83lgX+6.31 bei einer Verlässlichkeit der Schätzung von R2=0.9003 beschrieben werden. Als spezifische Ursachen für einen crowding-Effekt bei Monolayern wurden angenommen: - Diffusionsprobleme bedingt durch ungerührtes Medium um die Plättchen herum, - wider Erwarten dreidimensionales Wachstum auf den Plättchen, oder, - Wachstumsinhibition durch Kontakthemmung der Zellen auf den Plättchen. Der Störfaktor crowding-Effekt ist auf Grund seines dynamischen Charakters schwierig zu eliminieren. Dennoch konnten Möglichkeiten aufgezeigt werden, das Ausmaß des crowding-Effekts deutlich zu reduzieren, so dass das Modell optimiert werden konnte. Der multivariate Charakter sowie der große Umfang der Daten stellte hohe Anforderungen an eine geeignete Methodik für eine Auswertung der Daten. Auf Erfahrungen anderer Arbeiten konnte nicht zurückgegriffen werden, da bis dato keine Arbeiten von solch großem Stichprobenumfang durchgeführt wurden. Einfache statistische Analysen stellten sich als nicht geeignet heraus. Mit dem Wilcoxon-Mann-Whitney-Kennwert und dem Verfahren nach Wei und Lachin konnten jedoch schließlich zwei Instrumente für eine adäquate Datenanalytik bestimmt werden, die eine Datenanalyse im Sinne der Fragestellung des Projektes umfassend erlauben. Eine erste Auswertung der Daten des Testdurchlaufs zeigte, dass vor allem niedrigere Dosisstufen im Konzentrationsbereich bis 50 µM 2,4-DNP interessant sind. Ergänzende Datenanalysen wiesen darauf hin, dass 2,4-DNP offenbar die Stoffwechselaktivität von Zellen unmittelbar nach Zugabe um einen bestimmten Betrag erhöht und diese dann auf diesem Niveau kontinuierlich für eine bestimmte Zeit anhält, bis schließlich ein Wirkmaximum erreicht wird, das von der Höhe der Dosis abhängt. Als Ursachen für die je nach Dosisstufe unterschiedlich lange Wirkung von 2,4-DNP wurden verschiedene Ursachen diskutiert, die es weiter abzuklären gilt. Wahrscheinlich scheint jedoch eine Zytotoxizität höherer Dosierungen. Durch die ergänzende Analytik bestimmter Stoffwechselparameter gelang es, den crowding-Effekt auch für den spezifischen Glucose-Verbrauch nachzuweisen. Zudem konnte gezeigt werden, dass 2,4-DNP nicht nur durch Kurzschluss des Protonengradienten die Wärmeproduktion erhöht, sondern auch den Substratverbrauch der Zelle steigert: bei einer Konzentration von 100 µM 2,4-DNP erhöhte sich der spezifische Glucoseverbrauch um etwa 50%. Untersuchungen der Laktatproduktion ließen außerdem vermuten, dass die Stoffwechselsteigerung von 2,4-DNP eher oxidativ bedingt ist. Durch die vorliegenden Arbeit konnte erfolgreich ein geeignetes Messsystems für die mikrokalorimetrische Analyse einer Vielzahl an Zellen etabliert werden. Durch einen anschließenden Testdurchlauf mit 4 unterschiedlichen Zelllinien konnte zudem das System optimiert und eine adäquate Methodik für eine aussagekräftige Datenanalyse bestimmt werden. Es steht somit ein Modell zur Verfügung, mit dem die Wärmeproduktion einer Vielzahl an Zelllinien auf die Wirkung von 2,4-DNP, aber auch von anderen Substanzen, untersucht werden kann, was schließlich die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen ermöglicht.
Ziel der vorliegenden Arbeit waren pharmakologische Untersuchungen zum antiproliferativen Effekt der beiden Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin sowie des MRP1-Inhibitors Reversan einzeln und in Kombination bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen in vitro zu untersuchen. Zusätzlich wurde der antiproliferative Effekt der drei Inhibitoren mit dem antiproliferativen Effekt von 5-FU verglichen.
Das Konzept zu dieser Arbeit basiert auf Gemeinsamkeiten zwischen LDH und MRP1 in malignen Zellen. Eine ist, dass beide Moleküle von zahlreichen Tumoren überexprimiert werden. Weiter sind beide an der Ausbildung von Chemoresistenz beteiligt und beide werden auch in Hypoxie exprimiert. Zudem wird das für die Funktion von MRP1 notwendige ATP in malignen Zellen hauptsächlich mit der hyperaktiven Glykoloyse gebildet, deren Stoffumsatz auch von der LDH-Aktivität abhängig ist. Eine kombinierte Inhibition beider Zielstrukturen scheint somit geeignet zu sein, um die Proliferation maligner Zellen gezielt zu hemmen. Da in großen Teilen solider Tumoren hypoxische bzw. anoxische Bedingungen vorherrschen, wurde die Wirksamkeit der drei Inhibitoren auch bei 5 % und 1 % Sauerstoff, die als tumorphysiologisch gelten, untersucht.
Die wichtigsten Ergebnisse aus dieser Arbeit sind, dass die beiden LDH-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin und der MRP1-Inhibitor Reversan einen antiproliferativen Effekt bei kolorektalen Karzinomzellen auslösen, der auch für tumorphysiologische Sauerstoffkonzentrationen nachzuweisen war. So verringerte sich durch Natriumoxamat bzw. Galloflavin der Anteil vitaler Zellen um bis zu 45 % und durch Reversan um bis zu 60 % bei 5 % und 1 % Sauerstoff im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.
Auch unterschiedliche Kombination aus Natriumoxamat, Galloflavin und Reversan führten zu einer Steigerung des antiproliferativen Effektes, der auch immer bei tumorphysiologischen Konzentrationen nachzuweisen war. Den stärksten antiproli-ferativen Effekt wies die Dreifachkombination aus Galloflavin, Natriumoxamat und Reversan auf. So verringerte sich der Anteil vitaler Zellen bei 1 % Sauerstoff durch diese Kombination auf bis zu 28 % bei vier der fünf kolorektalen Karzinomzelllinien. Die Dreifachkombination wies einen gleichstarken bzw. stärkeren antiproliferativen Effekt auf als das Chemotherapeutikum 5-FU und zwar ebenfalls bei 5 % und 1 % Sauerstoff.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zum antiproliferativen Effekt von Natriumoxamat, Galloflavin (beides LDH-Inhibitoren) und Reversan (MRP1-Inhibitor) in vitro lassen den Schluss zu, dass das Konzept der Arbeit, einen antiproliferativen Effekt auch bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen zu induzieren, grundsätzlich bestätigt wurde. Auch löste die gemeinsame Hemmung von LDH und MRP1 einen teilweise stärkeren antiproliferativen Effekt aus als 5-FU. Weitere Untersuchungen sind aber ohne Frage nötig, um die molekularen Interaktion zwischen LDH und MRP1 sowie ihrer Inhibition im Detail zu verstehen.