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Das Enzym alpha-Dioxygenase (alpha-DOX) aus Erbsen (Pisum sativum) wurde mit folgenden Zielsetzungen untersucht: Isolierung und Charakterisierung der für die P. sativum alpha-DOX codierenden cDNA, Überproduktion der P. sativum alpha-DOX in Escherichia coli und nachfolgende Isolierung, Untersuchung der Interaktion der P. sativum alpha-DOX mit Fettsäuresubstraten sowie systematische Studie der Expression der P. sativum alpha-DOX während der Keimung und Entwicklung von Erbsenpflanzen. alpha-Dioxygenasen katalysieren in Pflanzen den Initialschritt der alpha-Oxidation von langkettigen Fettsäuren, die über die intermediäre Bildung von (R)-2-Hydroperoxyfettsäuren führt. Folgeprodukte dieser Reaktion sind die entsprechende (R)-2-Hydroxysäure sowie der um ein C-Atom kettenverkürzte Aldehyd. Es wurde die für die alpha-Dioxygenase aus Erbsen codierende cDNA mit einer Gesamtlänge von 2132 bp isoliert, die ein offenes Leseraster von 1929 bp beinhaltet. Sie codiert für ein Protein mit 643 Aminosäuren und einem errechneten Molekulargewicht von ca. 73 kD. Die Pisum sativum alpha-Dioxygenase wurde in E. coli als Fusionsprotein mit einem 6 x His-tag überproduziert und mittels Metallaffinitätschromatographie an Ni-NTA-Agarose isoliert. Studien zur Interaktion der P. sativum alpha-Dioxygenase mit Fettsäuresubstraten umfassten sowohl Versuche zu Anforderungen auf Seiten des Substrats als auch zu potentiellen Interaktionspartnern auf Seiten des Enzym. Es wurde gezeigt, dass für die Reaktion von alpha-Dioxygenasen mit Fettsäuren die freie Carboxylgruppe des Substrats unerlässlich ist. Aufgrund eines Aminosäuresequenzvergleichs zwischen der alpha-Dioxygenase aus Erbsen und PGHS-1 aus O. aries wurden vier Aminosäuren als potentielle Interaktionspartner auf Seiten der alpha-Dioxygenase aus Erbsen ausgewählt. Es handelte sich um die Arginin-Reste Arg-87, Arg-391, Arg-569 und Arg-570. Mit Hilfe der ortsspezifischen Mutagenese wurde gezeigt, dass der Aminosäurerest Arg-570 für die katalytische Aktivität unerlässlich ist. Die Expression der P. sativum alpha-Dioxygenase in keimenden Erbsen und jungen Erbsenpflanzen wurde sowohl in ihrem zeitlichen Verlauf als auch hinsichtlich der Gewebespezifität betrachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass Keimung zu einer deutlichen Akkumulation von alpha-Dioxygenase mRNA in Erbsen führte. Auch alpha-Dioxygenase Protein war in großer Menge in keimenden und jungen Erbsenpflanzen vorhanden. Ausgeprägte Gewebespezifität war festzustellen: alpha-DOX mRNA fand sich fast ausschließlich in Wurzeln von Erbsenpflanzen, in Sprossgewebe dagegen war sie kaum vorhanden. Im Gegensatz dazu lag alpha-DOX Protein gleichermaßen in Spross- und in Wurzelgewebe vor. Parallel zur Reifung der Pflanzen nahm die Menge an alpha-DOX mRNA und Protein ab. Alpha-Dioxygenase-Aktivität war bereits in trockenen Samen detektierbar, während der Keimung nahm sie deutlich zu. Im Vergleich von Spross- und Wurzelgewebe war die Aktivität in Wurzeln höher, bezogen sowohl auf das Frischgewicht der Pflanzen als auch auf die Menge an Gesamtprotein (spezifische Aktivität). Die Untersuchungen an Wurzeln zeigten, dass die Aktivität bezogen auf das Frischgewicht der Pflanzen über den betrachteten Zeitraum kaum variierte, während die spezifische Aktivität mit zunehmendem Alter der Pflanzen kontinuierlich zunahm. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass in Erbsen mehrere alpha-Dioxygenase-Isoenzyme vorhanden sind, so wie man dies für andere höhere Pflanzen bereits postuliert hat. Ein zellprotektiver Effekt von alpha-Dioxygenasen auf Pflanzen während der Interaktion mit Pathogenen ist bekannt. Möglicherweise ist dies auch der Grund für eine verstärkte Expression während der Keimung von Pflanzen. Die bevorzugte Expression in Wurzeln könnte auf eine Funktion als permanentes Schutzsystem gegen Infektion hindeuten.
In der vorliegenden Arbeit wurde nach Wegen gesucht, den Import peroxisomaler Matrixproteine, der über ein peroxisomales Targeting Signal Typ 2 gesteuert wird, zu messen. Es war vorgesehen, in erster Linie einen enzymchemischen Nachweis zu etablieren, da diese Methode den Vorteil einer Quantifizierbarkeit der Aktivität der gemessenen Enzyme bietet und somit Rückschlüsse auf den Grad einer Beeinträchtigung des Importes zulassen würden. Von dem Test wurde eine Sensitivität gefordert, die eine Messung auch in Homogenaten kultivierter Zellen, insbesondere von CHO-Zellen, erlaubt. Dieses war deswegen gefordert, weil der Test zur Charakterisierung induzierter CHO-Zell-Mutanten eingesetzt werden sollte, die die Merkmale eines PTS 2-Import-Defektes aufweisen. Dieser Nachweis sollte durch eine Messung der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase erfolgen. Dieses Enzym ist eines von drei derzeit bekannten Proteinen, die eine PTS 2 besitzen und über diesen Weg importiert werden. Das Substrat für die Hydroxylase war als Phytansäure mit einer 2,3-3H-Markierung in der Arbeitsgruppe vorrätig und wurde für den Test zum CoA-Thioester chemisch umgesetzt. Nach erfolgter enzymatischer Umsetzung von Phytonoyl-CoA zu a-Hydroxyphytanoyl-CoA durch die Hydroxylase waren dann sowohl Edukt wie auch das Produkt durch eine radioaktive Markierung gekennzeichnet und konnten nach einer dünnschicht-chromatographischen Trennung über Kieselgel durch einem Radiodünnschichtscanner nachgewiesen werden. Zunächst wurde mit Hilfe von Homogenaten aus Rattenlebergewebe ein bereits beschriebenes Verfahren zur Messung der Phytanoyl-CoA-Hydroxylase optimiert. Es stellte sich jedoch heraus, daß die Sensitivität dieses Testes nicht hoch genug ist, um die Hydroxylase-Aktivität in Homogenaten kultivierter CHO-Zellen zu messen. An dieser Stelle wurde die Etablierung eines immunchemischen Nachweises begonnen. Hierzu sollten Antikörper gegen die Hydroxylase des chinesischen Zwerghamsters, des Ursprungsorganismus der CHO-Zellen, generiert werden. Eine Reinigung des Enzyms kam nicht in Betracht, weil die Hamster nicht im Labortierhandel erhältlich waren. Folglich musste die cDNA der Hydroxylase aus einer Hamster-cDNA-Bank kloniert werden, nachdem sie durch ihre bekannten Homologe aus Mensch und Maus identifizierbar war. In den verfügbaren cDNA-Banken fand sich keine vollständige Sequenz, so daß mit einer partiellen Sequenz ohne 5´-Ende weitergearbeitet werden musste. Es bot sich im Institut die Möglichkeit, aus dieser Sequenz Pepetide zu bestimmen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit stark immunogen wirken. Solche Peptide wurden synthetisiert und nach Koppelung an Trägerproteine neuseeländischen weißen Kaninchen geimpft. Im Elisa wies das Antiserum zum Zeitpunkt seiner Gewinnung einen Titer von etwa 1:10000 auf, zeigte aber im Westernblot neben einer starken Detektion in Laufweite der Hydroxylase auch eine unspezifische Anfärbung der Proben. In der nun durchgeführten Affinitätsreinigung des Antiserums über einer mit den antigenen Peptiden beladenen Säule tauchte das Problem auf, daß die Antikörper so fest binden, daß sie von ihren Antigenen nicht mehr ohne dentaturierende Bedingungen zu lösen waren. Für die weitere Arbeit sollte sich nun eine affinitätschromatographische Reinigung über Peptide, die den Antikörper mit geringerer Avidität binden, anschließen, so daß nach Trennung der Immunkomplexe native Antikörper isoliert werden könnten. Hierzu wäre ein Epitop-mapping wünschenswert, damit auf dieser Grundlage Peptide mit den geforderten Eigenschaften synthetisiert werden können.