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Vaskuläre Komplikationen wie Atherosklerose sind bei Diabetikern weit verbreitet. Eine erhöhte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies trägt zu einer Dysfunktion des Endothels bei Diabetes und hohen Glukosespiegeln bei. Glutathion (GSH) ist das häufigste zelluläre Thiol und stellt ein bedeutendens Antioxidans des menschlichen Organismus dar. Das Multidrug Resistance Protein 1 (MRP 1) ist im Endothel der Haupttransporter von oxidiertem GSH. Blockiert man MRP 1, so wird unter oxidativem Stress der intrazelluläre GSH-Spiegel erhalten.
In dieser Arbeit wird der Einfluss von MRP 1 auf die endotheliale Funktion und Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei Diabetes und erhöhten Glukosespiegeln anhand von MRP 1-/- -Mäusen und Wildtyp-FVB-Tieren untersucht.
Acht Wochen nach Injektion von STZ wurde die endothelabhängige Vasorelaxation an den isolierten thorakalen Aorten bestimmt. Diabetische Wildtyp-Tiere wiesen eine signifikant verminderte endothelabhängige Vasorelaxation auf. In MRP 1-/- -Tieren hingegen kam es zu keiner Beeinträchtigung der Endothelfunktion. Die endothelunabhängige Vasorelaxation war nicht signifikant unterschiedlich. STZ-induzierter Diabetes führte zu einer signifikant erhöhten Produktion von Superoxidanionen sowie Wasserstoffperoxid in Wildtyp-Tieren. Diabetische MRP 1-/- -Mäuse hingegen zeigten keinen Anstieg der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies. Erhöhte Glukosekonzentrationen führten in vitro in humanen aortalen Endothelzellen ebenso zur erhöhten Superoxidanion-Produktion. In Zellen, in denen MRP 1 mittels siRNA herunterreguliert war, zeigte sich keine Erhöhung von Superoxidanionen. In Wildtyp-Mäusen führte Diabetes zu einer Verminderung des vaskulären GSH-Spiegels, wohingegen bei MRP 1-/- -Tieren keine Veränderung auftrat.
Diese Daten weisen auf die wichtige Rolle von MRP 1 bei der unter hohen Glukosekonzentrationen auftretenden endothelialen Dysfunktion hin. MRP 1 stellt somit einen neuen Ansatzpunkt in der Behandlung der durch Diabetes ausgelösten vaskulären Dysfunktion dar.
Die Qualitätskontrolle von pharmazeutisch verwendeten Substanzen ist eine Voraussetzung für die sichere Anwendung von Arzneimitteln. Sie ist eng mit der Bestimmung der Verunreinigungen einer Substanz im Rahmen der Reinheitsanalytik verknüpft. Dabei spielt das Europäische Arzneibuch (Ph. Eur.) eine wichtige Rolle. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Bestimmung des Verunreinigungsprofils waren auf die Neuerarbeitung oder Überarbeitung der im Ph. Eur. beschriebenen Prüfungen auf „Verwandte Substanzen“ ausgerichtet. Im Rahmen der Neuerarbeitung einer Monographie für Trimebutin und Trimebutin-Maleat wurde eine RP-HPLC-Methode entwickelt. Neben den bekannten Verunreinigungen war ein weiterer Peak nachweisbar, der N-Desmethyltrimebutin zugeordnet wurde. Die Trennung zwischen N-Desmethyltrimebutin und dem Hauptpeak sowie zwischen zwei bekannten Verunreinigungen ist kritisch. Für beide Peakpaare wurden Systemeignungskriterien festgelegt. Zur Definition von Akzeptanzkriterien in den erarbeiteten Monographieentwürfen wurden Chargen untersucht. Die Quantifizierung erfolgte über die „Externer-Standard“-Methode mit einer Verdünnung der Untersuchungslösung als Referenz. Falls erforderlich, wurden die Korrekturfaktoren in die Berechnung des Gehaltes einbezogen. Die DC-Methode zur Prüfung auf „Verwandte Substanzen“ von Adenosin sollte gegen eine HPLC-Methode ausgetauscht werden. In Übereinstimmung mit Ergebnissen des EDQM-Labors haben die Untersuchungen bestätigt, dass mit einer Ionenpaar-HPLC-Methode die Anwesenheit von Inosin, Guanosin, Uridin und Adenin in Adenosin kontrolliert werden kann. Durch die Festlegung einer Auflösung > 1.5 zwischen Adenin und Inosin als Systemeignungskriterium werden nicht geeignete HPLC-Säulen erkannt. Durch die DC-Prüfung des Ph. Eur. können verschiedene Nucleotide nachgewiesen werden. Die vorgeschlagene HPLC-Methode wurde durch Einführung eines Gradienten so geändert, dass Nucleotide, Nucleoside und Adenin gleichzeitig nachgewiesen werden konnten. Die Analyse der Proben bestätigte die Ergebnisse der DC, dass kleine Mengen Adenosin-5’-monophosphat in den Chargen vorhanden waren. Eine CE-Methode zur Reinheitsprüfung von Glutathion wurde entsprechend der Kommentare zum in Pharmeuropa veröffentlichten Monographievorschlag überarbeitet. Die kritischen Trennungen zwischen dem internen Standard und Cystein sowie zwischen L-γ-Glutamyl-L-cystein und dem Hauptpeak, die durch den Systemeignungstest überprüft werden, waren durch den pH-Wert des Trennpuffers kontrollierbar. Glutathion zeigt beispielhaft, dass das Verunreinigungsprofil fermentativ gewonnener Produkte komplex ist und von den Herstellungs- und Aufreinigungsprozessen abhängt. Gleiches gilt für Aminosäuren, die vermehrt biotechnologisch gewonnen werden. In den Aminosäure-Monographien ist zur Reinheitsprüfung eine DC auf „Ninhydrin-positive Substanzen“ vorgeschrieben. Diese Methode ist auf den Nachweis anderer Aminosäuren, die durch unvollständige Abtrennung bei der Extraktion aus Proteinhydrolysaten stammen können, ausgelegt. Die Analyse von Aminosäuren mittels CE nach Derivatisierung mit FMOC-Cl ermöglicht einen sensitiven und selektiven Nachweis anderer Aminosäuren. Durch den Einsatz von CBQCA als Derivatisierungsreagenz können auch Aminozucker und kleine Peptide erfasst werden. Mit beiden Methoden wurde das Verunreinigungsprofil von Histidin, Isoleucin, Phenylalanin und Serin bestimmt. Während in den Phe- und Ser-Proben keine Verunreinigungen erfasst wurden, wurden in den Ile-Proben nach Derivatisierung mit FMOC-Cl andere Aminosäuren gefunden. Alle untersuchten Aminosäuren zeigten nach Derivatisierung mit CBQCA viele Verunreinigungen. Wegen Peaküberlagerungen konnten Aminosäuren mit dem verwendeten Trennpuffer (25 mM Boratpuffer pH 9.20; 25 mM SDS) nicht bestimmt werden. Durch eine Variation des Puffers (20 mM Tetraboratpuffer pH 9.3; 100 mM SDS) war es möglich, die CBQCA-derivatisierten Aminosäuren zu trennen und zuzuordnen. Im Hinblick auf die Anwesenheit anderer Aminosäuren waren die Ergebnisse der beiden Verfahren vergleichbar. Insbesondere wurden in den Ile-, Phe- und Ser-Proben keine basischen Aminosäuren sowie Cystein gefunden. Deren FMOC-Derivate comigrierten mit einem Peak, der nach Strukturaufklärung mittels NMR-Spektroskopie als Nebenprodukt der Derivatisierungsreaktion mit FMOC-Cl identifiziert wurde. Als Verunreinigungen von biotechnologisch hergestellten Aminosäuren kommen organische Säuren in Frage. Durch eine RP-HPLC unter Zusatz von Heptafluorbuttersäure als Ionenpaarreagenz wurden Aminosäuren und organische Säuren getrennt. Die Detektion erfolgte mittels ELSD. Nach dem Hauptpeak wurden Störsignale detektiert, weshalb sich die Anwendung der Methode zur Reinheitsprüfung als schwierig herausstellte. Die durchgeführten Experimente deuten darauf hin, dass der ELSD mit der großen Substanzmenge überlastet ist und es zur Verschleppung von Substanz kommt.
Als Sekundärmetabolit verschiedener Schimmelpilze gehört das Mykotoxin Patulin zu den als Kanzerogene diskutierten Lebensmittelinhaltsstoffen natürlichen Ursprungs und kommt vor allem in braunfaulen Äpfeln und daraus verarbeiteten Lebensmitteln vor. Trotz zahlreicher in vitro- und in vivo-Studien zur Genotoxizität von Patulin, ist der Wirkmechanismus für das genotoxische Potential von Patulin weitgehend unbekannt.
Um die direkte DNA-Reaktivität von Patulin als mögliche genotoxische Wirkung zu betrachten, wurde im ersten Teil der Arbeit zunächst die direkte Reaktion von Patulin mit DNA-Basen untersucht.
Nach Inkubation von Patulin mit der DNA-Base Adenin wurden mittels (U)HPLC-Massenspektrometrie im Vollscan-Modus insgesamt fünf Addukte von Patulin mit Adenin identifiziert. Anhand der Fragmentierungsmuster ohne und nach Methylierung freier Carboxyl- und Ketogruppen wurde für drei Patulin-Adenin-Addukte eine Ketohexansäure-Derivat-Struktur des Patulin-Rückgrates und die Bindung des Adenin-Moleküls an C6 (C5) abgeleitet. Zusätzlich wurden zwei Addukte identifiziert, welche die gleiche Patulin-Struktur aufwiesen, jedoch je ein Molekül Adenin an C5 und C6 gebunden haben. Patulin reagierte folglich mit Adenin unter Bildung von Mono- und Diaddukten.
In Gegenwart von einer zu Adenin äquimolarer Konzentrationen an Glutathion im Inkubationsansatz wurden mittels (U)HPLC-Massenspektrometrie im Vollscan-Modus die gleichen Patulin-Adenin-Addukte wie in Abwesenheit von Glutathion beschrieben beobachtet. Weiterhin wurden drei bisher unbekannte Glutathion-Patulin-Addukte identifiziert. Es handelte sich, abgeleitet von deren Fragmentierungsverhalten ohne und nach Methylierung, um C6-monosubstituierte Addukte mit Ketohexansäure-Derivat-Struktur. In einem dieser Addukte lag das Glutathion-Molekül linear gebunden vor, wohingegen in den beiden anderen Addukten die α-Aminogruppe des Glutaminsäurerestes zudem an C1 oder C7 von Patulin verknüpft war und es sich somit um 6,1- bzw. 6,7-cyclische Glutathion-Patulin-Addukte handelte.
Interessanterweise, wurden sieben weitere Produktpeaks nur bei gleichzeitiger Anwesenheit beider Nukleophilkomponenten im Inkubationsansatz gebildet, was folglich auf gemischte Addukte aus Patulin, Glutathion und Adenin hinwies. Das Fragmentierunsmuster bestätigte die Anwesenheit von Adenin und Glutathion in der Adduktstruktur und zeigte zudem, dass die neuartigen Addukte Regioisomere mit Ketohexansäure-Derivat-Struktur waren, die ein 6,7-cyclisch gebundenes Glutathion-Molekül aufwiesen. Durch Methylierung der freien Carboxylgruppen innerhalb der Adduktstruktur und Analyse der Molekül- und Fragmentionen wurde die Bindung des Adenin-Moleküls lokalisiert. In zwei diastereomeren Adduktpaaren war das Adenin-Molekül an C1 über eine Amidbindung gebunden. In geringerer Intensität wurden auch zwei diastereomere gemischte Glutathion-Patulin-Adenin-Addukte mit linearem Glutathion-Molekül und C1-gebundenem Adenin-Molekül identifiziert.
Die Summenformeln aller postulierten Strukturen wurden mittels hochauflösender Massenspektrometrie bestätigt. Zudem wurde ein Reaktionsmechanismus für die Bildung der neuen (Glutathion-)Patulin(-Adenin)-Addukte hergeleitet. Die Bildung gemischter Glutathion-DNA-Basen-Addukte wurde bisher weder für Patulin noch für andere α,β-ungesättigte Carbonyle beschrieben. Die Reaktion der Mischadduktbildung unterscheidet sich zudem mechanistisch von den Reaktionen, welche zur Bildung bereits bekannter Glutathion-DNA-Basen-Addukte von 1,2-Dihaloalkanen, sowie 1,2,3,4-Diepoxybutan führen. ...