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alpha2-adrenerge Rezeptoren, von denen drei verschiedene Subtypen (alpha2A, alpha2B, alpha2C) kloniert wurden, gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und vermitteln vielfältige physiologische Funktionen der Transmitter Adrenalin und Noradrenalin. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Rezeptorsubtypen, die subzelluläre Lokalisation von Rezeptoren oder der Differenzierungsstatus einer Zelle für die funktionelle Diversität der alpha2-Rezeptor-Effekte in vivo verantwortlich sind. Im ersten Teil des Projektes wurde ein transgenes Mausmodell untersucht, bei dem selektiv alpha2A-Rezeptoren unter Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase Promotors in adrenergen Neuronen exprimiert wurden. In diesem Modell sollte getestet werden, ob ein einzelner Rezeptorsubtyp in den verschiedenen Neuronen des sympathischen Nervensystems in vivo identische Funktionen hat. Transgene alpha2A-Rezeptoren hemmten in vivo zwar die Freisetzung von Noradrenalin aus sympathischen Nervenfasern nicht aber die Exozytose von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Deshalb stellte sich die Frage, ob die Rezeptorfunktion von der Morphologie, dem Differenzierungsstatus der Zellen oder von der subzellulären Lokalisation der Rezeptoren abhängt. Hierfür wurden alpha2A-Rezeptoren durch Varianten des grün fluoreszierenden Proteins markiert und mittels FRET-Fluoreszenzmikroskopie untersucht. In PC12 Phäochromozytomzellen, die durch NGF zum Auswachsen neuronaler Fortsätze stimuliert wurden, waren die Agonist-bedingten Konformationsänderungen von alpha2A-Rezeptoren jedoch weder vom Differenzierungsstatus der Zellen noch von deren subzellulärer Lokalisation abhängig. Lediglich in transient transfizierten Zellen waren im Vergleich zu stabil transfizierten Zellen höhere Agonist-Konzentrationen zur Rezeptoraktivierung erforderlich. Diese Befunde zeigen, dass zusätzlich zur Diversität der Rezeptorsubtypen auf Proteinebene der zelluläre Kontext, in dem ein Rezeptor exprimiert wird, eine ganz wesentliche Rolle für dessen Funktion spielt.
Obwohl radioaktiv markiertes meta-Iodbenzylguanidin (MIBG) häufig in der Diagnose und bei der Behandlung von Neuroblastomen in der Klink Verwendung findet, ist bis heute sehr wenig über seine Pharmakologie bekannt. In der Literatur finden sich öfters Andeutungen, die aber nicht belegt wurden. So fehlten Untersuchungen über indirekt-sympathomimetische Wirkungen von MIBG. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir am isoliert perfundierten Kaninchenherzen die Wirkung von MIBG im Vergleich zum Prototyp eines indirekten Sympathomimetikums (Tyramin). Dabei zeigte sich, daß MIBG zwar etwas potenter aber nicht so effektiv wie Tyramin war. Dies zeigte sich sowohl beim Paramter Herzfrequenz als auch beim Parameter Noradrenalin-Freisetzung. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Zeitverlauf, daß die Wirkung von MIBG wesentlich länger anhielt als die von Tyramin. Der Unterschied zwischen MIBG und Tyramin bezüglich der Effektivität als indirekte Sympathomimetika konnte mit unterschiedlichen Wirkstärken beider Substanzen als Hemmstoff des vesikulären Monoamin-Transporters erklärt werden. Tyramin und MIBG wurden in Versuchen mit Neuroblastomzellen mit gleicher Geschwindigkeit durch Uptake1 aufgenommen, Tyramin war aber ein wesentlich potenterer Hemmstoff des vesikulären Monoamin-Transporters als MIBG. Da aber MIBG im Gegensatz zu Tyramin kein Substrat der neuronalen Monoaminoxidase ist, hielt seine Wirkung auch deutlich länger an als die von Tyramin. Die indirekt sympathomimetische Wirkung von MIBG wurde anschließend auch in-vivo untersucht. Dort zeigte sich auch, daß MIBG trotz im Vergleich zu klinischen Anwendungen hoher Dosen wesentlich schwächer indirekt-sympathomimetisch wirkt als Tyramin. In diesen Versuchen wurde auch beobachtet, daß die indirekt-sympathomimetische Wirkung auf die Herzfrequenz durch eine Gegenregulation des Nervensystems (nämlich den Barorezeptor-Reflex) maskiert wurde. Obwohl MIBG in der Literatur von Anfang an als adrenerger Neuronenblocker bezeichnet wurde, fand sich in der Literatur kein direkter Beweis für diese Behauptung. Mit Hilfe eines in-vitro Modells konnte in der vorliegenden Arbeit der Beweis erbracht werden, daß MIBG ein adrenerger Neuronenblocker ist. Dazu benutzten wir als Parameter die durch elektrische Stimulation induzierte Freisetzung von Noradrenalin im spontan schlagenden, perfundierten Kaninchenherzen. Die stimulationsbedingte Abgabe von Noradrenalin ins Perfusat wurde durch MIBG zeit- und konzentrationsabhängig blockiert. Da viele adrenerge Neuronenblocker das Enzym Monoaminoxidase (MAO) hemmen, wurde in-vitro untersucht, ob MIBG die beiden Iso-Enzyme MAO-A und MAO-B hemmt. Es konnte gezeigt werden, daß MIBG die MAO kompetitiv hemmt und zwar bevorzugt die Isoform MAO-A. Diese MAO-Hemmung wurde auch in-vivo in den Versuchen mit narkotisierten Kaninchen beobachtet. MIBG verminderte nämlich dosisabhängig die Konzentration des desaminierten Noradrenalin-Metaboliten DOPEG im Blutplasma der Tiere. Die Beobachtung, daß für die Hemmung der MAO-A im perfundierten Herzen eine IC50 von 17 nM, im Gewebehomogenat von Herzen dagegen eine IC50 von 18 µM gefunden wurde, spricht dafür, daß MIBG als Substrat von Uptake1 im Axoplasma der sympathischen Neurone des Herzens um den Faktor 1000 angereichert wird. Somit konnten in der vorliegenden Arbeit einige offene Fragen zur Pharmakologie von MIBG im Bereich des sympathomimetischen Nervensystems beantwortet werden, die auch für den klinischen Einsatz von MIBG wichtig sein könnten.
ß-Arrestin/Rezeptor-Interaktionen - Ein endogenes "Werkzeug" ligandenspezifischer Signaltransduktion
(2010)
Die Bedeutung der β-Arrestine als multifunktionelle Adapterproteine GPCR-vermittelter Signaltransduktion hat in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. In der vorliegenden Arbeit lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung der molekularen Basis und der Ligandenabhängigkeit sowohl der β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion als auch β-Arrestin- (un-)abhängiger Signaltransduktionsmechanismen. Im ersten Teil wurde der Einfluß potentieller Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des β2AR bzw. im C-Terminus und der TM3 des P2Y1R auf die agonisteninduzierte β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, Internalisierung und Desensibilisierung untersucht. Durch Mutationsanalysen konnten Ser 352/Thr 358 im distalen C-Terminus des P2Y1R als Schlüsselstellen der β-Arrestin-Translokation und Internalisierung identifiziert werden, während ein oder mehrere Phosphorylierungsstellen im proximalen P2Y1R C-Terminus die molekulare Grundlage der Rezeptordesensibilisierung darstellen. Darüber hinaus machte die Anwendung verschiedener PKC- oder CaMK-Inhibitoren sowie der Einsatz des PKC-Aktivators PMA deutlich, dass die P2Y1R-Desensibilisierung und β-Arrestin-Translokation durch unterschiedliche Kinasen kontrolliert werden. Zudem konnte mit Hilfe der FRET-Technik gezeigt werden, dass die Phosphorylierungsstellen zwischen den Positionen 355 und 364 im proximalen β2AR C-Terminus essentielle Bereiche der β-Arrestin-Translokation darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Agonisten am β2-adrenergen Rezeptor bzw. dem P2Y2R auf ihre Fähigkeit hin untersucht verschiedene mit dem jeweiligen Rezeptor verknüpfte G-Protein- bzw. β-Arrestin-Funktionen in unterschiedlichem Ausmaß zu aktivieren („biased agonism“). Da eine solche ligandenselektive Aktivierung rezeptorvermittelter Signalwege bis dato nur mit synthetischen Liganden detailliert untersucht wurde, galt das besondere Interesse der Analyse der durch die endogenen Substanzen induzierten Signalmuster. Die Betrachtung der Noradrenalin- bzw. Adrenalin-induzierten β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, β-Arrestin2-Translokation, Rezeptorinternalisierung, G-Protein-Aktivierung sowie cAMP-Produktion am β2AR machte deutlich, dass es sich beim Phänomen des „biased agonism“ um einen endogenen Mechanismus handelt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch zur Tokolyse eingesetzte β2AR-Agonisten spezifische Signalmuster induzieren. Die Beobachtung, dass UTP und ATP sowohl unterschiedliche β-Arrestin1/2-Translokationsals auch ERK-Aktivierungsmuster am P2Y2R induzieren bestärkte das Konzept des „biased agonism“ als endogenes Phänomen. Das ligandenabhängige β-Arrestin-Translokationsverhalten des P2Y2R ließ zudem die agonistenbedingte Zuteilung des Rezeptors zu den „Klasse A“ oder „Klasse B“ Rezeptoren zu. Die detaillierte Untersuchung agonisteninduzierter Rezeptor/Effektor-Interaktionen und Signalmuster dürfte helfen die Anwendung klinisch relevanter Substanzen zu optimieren.