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Aufklärung der molekularen Struktur und Funktion des R-Typ Anionenkanals QUAC1 in Schließzellen
(2016)
Zum Gasaustausch mit Ihrer Umgebung besitzen höhere Pflanzen stomatäre Komplexe. Die Turgor-getrieben Atmungsöffnungen in der Epidermis der Blätter werden von zwei Schließzellen umsäumt. Um bei Trockenheit einen exzessiven Verlust von Wasser zu verhindern, synthetisieren/importieren Schließzellen das Stresshormon ABA (Abszisinsäure), das über eine schnelle ABA-Signalkaskade plasmamembrangebundene Ionenkanäle steuert. Dabei wird der Stomaschluss durch die Aktivität von R-(rapid) und S-(slow)Typ Anionenkanälen initiiert. Obwohl die R- und S-Typ Anionenströme in Schließzellen seit Jahrzehnten bekannt waren, konnte erst kürzlich das Gen identifiziert werden, das für den S-Typ Anionenkanal (SLAC1, Slow activating Anion Channel 1) kodiert. Daraufhin wurde schnell der Zusammenhang zwischen dem Stresshormon ABA, der ABA-Signalkette und der Aktivität des SLAC1 Anionenkanals im heterologen Expressionssystem der X. laevis Oozyten als auch in Schließzellprotoplasten aufgeklärt. Es konnte gezeigt werden, dass ABA durch einen zytosolischen Rezeptor/Phosphatasekomplex (RCAR1/ABI1) erkannt wird und die Aktivität von kalziumabhängigen Kinasen (CPK-Familie) sowie kalziumunabhängigen Kinasen der SnRK2-Familie (OST1) steuert. In Anwesenheit von ABA phosphorylieren diese Kinasen SLAC1 und sorgen so für die Aktivierung von Anionenströmen und damit für die Initiierung des Stomaschlusses.
Die genetische Herkunft der ABA-induzierten R-Typ Ströme in Schließzellen war zu Beginn der vorliegenden Arbeit noch nicht bekannt. R-Typ Ströme zeichnen sich durch eine strikte Spannungsabhängigkeit und sehr schnellen Aktivierungs- sowie Deaktivierungskinetiken aus. Die Charakterisierung von Verlustmutanten des Schließzell-exprimierten Gens ALMT12 (Aluminium-aktivierter Malattransporter 12) konnte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Martinoia (Zürich) erste Hinweise auf die Beteiligung dieses Gens an der Stomabewegung demonstrieren. Anschließende Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten aus Wildtyppflanzen und ALMT12-Verlustmutanten zeigten, dass ALMT12 für die Malat-aktivierte R-Typ Anionenstromkomponente verantwortlich ist. Deshalb wurde der Anionenkanal QUAC1 (Quickly activating Anion Channel 1) benannt - in Anlehnung an die Benennung des Anionenkanals SLAC1. Mit der Identifizierung von QUAC1 in planta war es nun meine Aufgabe, die elektrischen Eigenschaften von ALMT12/QUAC1 und dessen Aktivitätskontrolle durch die ABA-Signalkaskade im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten zu untersuchen.
Protein-Protein Interaktionsstudien mit der Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenz-Technik, sowie die Beobachtung von markant erhöhten QUAC1 Anionenströmen in Anwesenheit der SnRK2 Kinase OST1 und den Calcium-abhängigen Kinasen CPK2 und CPK20, ließen den Schluss zu, dass QUAC1, ebenso wie SLAC1, unter der Kontrolle des schnellen ABA-Signalwegs steht. Eine zusätzliche Expression des negativen Regulators ABI1 unterdrückte die aktivierenden Eigenschaften der QUAC1-aktivierenden Kinasen, was die Hypothese der Koregulation von S- und R-Typ Anionenkanälen durch die gleiche ABA-Signalkaskade weiter unterstützt.
Zur weiteren Aufklärung der elektrischen Eigenschaften von QUAC1 wurden tiefgreifende elektrophysiologische Untersuchungen mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen Technik durchgeführt. Durch die Wahl von geschickten Spannungsprotokollen konnte sowohl die schnelle Aktivierungskinetik als auch die schnelle Deaktivierungskinetik von QUAC1 bestimmt und quantifiziert werden. Diese Stromantworten waren sehr ähnlich zu den R-Typ Strömen, die man von Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten kannte, was ein weiteres Indiz dafür war, dass es sich bei QUAC1 tatsächlich um eine Komponente des R-Typ Kanals aus Schließzellen handelt. Weiterführende Untersuchungen bezüglich der Spannungsabhängigkeit und der Selektivität von QUAC1 charakterisierten das Protein als einen Depolarisations-aktivierten Anionenkanal mit einer starken Präferenz für Dicarbonsäuren wie Malat und Fumarat. Zudem konnte auch eine Leitfähigkeit für Sulfat und Chlorid nachgewiesen werden. Interessanterweise erwies sich Malat nicht nur als ein permeierendes Ion, sondern auch als ein regulierendes Ion, welches das spannungsabhängige Schalten von QUAC1 maßgeblich beeinflusst. Extrazelluläres Malat verschob die Offenwahrscheinlichkeit von QUAC1 sehr stark zu negativeren Membranspannungen, so dass der Anionenkanal bereits bei typischen Ruhespannungen von Schließzellen (ca. -150 mV) aktiviert werden konnte. Eine Beladung von QUAC1-exprimierender Oozyten mit Malat bewirkte zum einen höhere Anioneneffluxströme, aber auch eine Verschiebung der spannungsabhängigen Offenwahrscheinlichkeit zu negativeren Membranpotentialen.
Struktur-Funktionsanalysen sollten die umstrittene Topologie von ALMT-ähnlichen Proteinen beleuchten und die molekulare Herkunft der Phosphorylierungsaktivierung aufzeigen, sowie die Malatabhängigkeit und die starke Spannungsabhängigkeit von QUAC1 aufklären. Es zeigte sich jedoch schnell, dass Punktmutationen und Deletionen im C-Terminus von QUAC1 sehr häufig zu nicht-funktionellen Mutanten führten. Diese Tatsache weist darauf hin, dass es sich um einen hoch-strukturierten und funktionell sehr wichtigen Bereich des Anionenkanals handelt. Auch die Topologie des Anionenkanalproteins wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Sowohl die Lage des N- und C-Terminus (extrazellulär oder intrazellulär), als auch die Anzahl der membrandurchspannenden Domänen war nicht abschließend geklärt. Deshalb wurde in einem Fluoreszenz-basiertem Ansatz die Lage der Termini bestimmt. Im Rahmen meiner Arbeit konnte somit eindeutig gezeigt werden, dass sich beide Termini im Zytosol der Zelle befinden. Auf Grundlage von Modellen aus der Literatur und meiner Topologiebestimmungen konnte schließlich ein erweitertes Modell zur Struktur von QUAC1 entwickelt werden. Dieses Modell kann in Zukunft als Ausgangspunkt für weiterführende Struktur-Funktionsanalysen dienen.
Diese Arbeit hat somit gezeigt, dass das Gen QUAC1 tatsächlich eine Komponente der R-Typ Ströme in Schließzellen kodiert. Ebenso wie SLAC1 steht der Malat-induzierte Anionenkanal QUAC1 unter der Kontrolle der schnellen ABA-Signalkaskade. In Zukunft bleibt zu klären, welche weiteren Gene für die R-Typ Kanalproteine in Schließzellen kodieren und welche strukturelle Grundlage für die besonderen Eigenschaften von QUAC1 hinsichtlich seiner schnellen Kinetiken, seiner Selektivität und Aktivierbarkeit durch Malat.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es den Zusammenhang zwischen dem endogenen und internen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem radialen ABA- und Wasserfluss zu untersuchen und zu überprüfen ob diese Faktoren durch unterschiedliche Nährstoffbedingungen beeinflusst werden. Der radiale Transportweg von ABA wurde ebenfalls untersucht. • In dieser Arbeit konnte das erste Mal gezeigt werden, dass ein direkter Zusammenhang zwischen dem endogenen und internen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem radialen Wasser- und ABA-Transport besteht. Unter vergleichbaren Bedingungen können aus einem gegebenen ABA-Gehalt Rückschlüsse auf die radialen Wasser- und ABA-Flüsse gezogen werden. • Während Kalium- und Calciummangel und die Kultur in CaSO4 den radialen Wasserfluss von Maiskeimlingen stimulierten, war Jv unter Nitratmangel reduziert. Phosphat- und Sulfatmangel wirkten sich nicht auf den Wasserhaushalt von Maiskeimlingen aus, trotz einem deutlich reduzierten P- bzw. S-Gehalt konnten keine klaren Defizienzsymptome festgestellt werden. • Der endogene ABA-Gehalt im Wurzelgewebe von Maiskeimlingen war nur unter Kalium- und Nitratmangel erhöht. • Der radiale ABA-Transport wurde unter Kalium-, Nitrat-, Calciummangel und in CaSO4-Kultur gesteigert. Der erhöhte ABA-Fluss in Kaliumdefizienten Keimlingen resultiert aus einer gesteigerten ABA-Biosynthese und dem erhöhten Wassertransport. Unter Nitratmangelbedingungen lässt sich der gesteigerte ABA-Fluss anhand des erhöhten ABA-Gehaltes im Wurzelgewebe erklären. Die erhöhte ABA-Konzentration im Xylemsaft von Keimlingen aus Calciummangel- und CaSO4-Kultur ist das Ergebnis des gesteigerten Wassertransportes. Phosphat- und Sulfatmangel hatten keine Auswirkungen auf den ABA-Fluss. • Salzstress (50 mM) reduzierte den radialen Wasserfluss deutlich. Der erhöhte endogene ABA-Gehalt im Wurzelgewebe hatte keinen Einfluss auf Jv und JABA. Die Auswirkungen von Salzstress waren voll reversibel. • 100 nM externe ABA wirkte sich unter allen untersuchten Nährstoffbedingungen gleichermaßen stimulierend auf Jv und JABA aus. In NaCl-gestressten Keimlingen zeigte externe ABA keinen Effekt. • Eine Möglichkeit zur Immunolokalisation von ABA in Wurzelquerschnitten von Maiskeimlingen wurde entwickelt und optimiert. • Die Visualisierung des radialen ABA-Transportes anhand der Immunolokalisation mit monoclonalen Antikörpern zeigte, dass Endo- und Exodermis eine apoplastische Barriere für den ABA-Transport darstellen. Die Ergebnisse lassen den Rückschluss zu, dass die Exodermis die wirksamere Barriere für den ABA-Transport ist. • Wurzeln von Maiskeimlingen bildeten unter Nitratmangelbedingungen eine Exodermis aus und verstärkten die Suberinisierung der Endodermis. Unter Kaliummangel konnten keine verstärkten Barriereeigenschaften beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal aufgezeigt werden, dass eine signifikant hohe Korrelation zwischen dem endogenen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem ABA- bzw. Wassertransport besteht. Die ebenfalls positiv signifikant hohe Korrelation zwischen dem radialen Wasser- und ABA-Transport zeigt einen apoplastischen ABA-Transport an. Mit zunehmendem Wasserfluss steigt auch die ABA-Konzentration im Xylem. Ein apoplastischer radialer bypass der ABA konnte auch mit Hilfe der Immunolokalisation nachgewiesen werden.
Pflanzen regulieren ihren Gasaustausch mit der Atmosphäre, indem sie die Öffnungsweite von Poren in der Epidermis von Blättern, sog. Stomata, verändern. Bei Wassermangel werden die stomatären Poren geschlossen, um den Verlust von Wasser zu minimieren. Dieser Vorgang wird durch das Phytohormon ABA ausgelöst, welches eine Aktivierung von Anionenkanälen in der Plasmamembran der Schließzellen induziert. Obwohl die Aktivierung der Anionenkanäle ein zentrales Element in der ABA-Antwort darstellt, ist der Signalweg, der zu der Aktivierung der Anionenkanäle führt, nur lückenhaft verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle von Signalintermediaten wie Proteinkinasen, -phosphatasen, Lipid-abgeleiteten Botenstoffen und Ca2+ bei der Aktivierung der Anionenkanäle untersucht. Hinsichtlich Ca2+ lag ein spezieller Fokus auf der Generierung von Ca2+-Signalen und auf der Frage, inwieweit ein Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration für eine Aktivierung der Anionenkanäle ausreicht. Für diese Studien wurde hauptsächlich die Zwei-Elektroden-Spannungsklemm- (DEVC) Technik in Kombination mit Ca2+-Konzentrationsmessungen durch den Ca2+-sensitiven Farbstoff FURA-2 angewendet. Die Möglichkeit Anionenkanäle durch Ca2+ zu aktivieren wurde getestet, indem Ca2+-Signale in intakten Schließzellen von Nicotiana tabacum durch hyper- und depolarisierte Spannungen ausgelöst wurden und gleichzeitig die Ströme, die über die Plasmamembran flossen, gemessen wurden. Dabei führte eine Hyperpolarisation zu einer transienten Erhöhung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration während des Spannungssprunges, wohingegen eine Depolarisation zunächst eine Erniedrigung der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration auslöste und das Ca2+-Signal bei Repolarisation der Plasmamembran auftrat. Dies weist darauf hin, dass in beiden Fällen hyperpolarisations-aktivierte Ca2+-Kanäle beteiligt sind, wobei das Schwellenpotential der Schließzellen, bei dem ein Ca2+-Signal ausgelöst wird, nach einer langen Depolarisation zu positiveren Spannungen verschoben ist. Die Modulation der Spannungssensitivität der Schließzellen während einer langen Depolarisation findet möglicherweise durch eine Aktivierung der Ca2+-Kanäle und/oder eine Inhibierung verschiedener Ca2+-Transportproteine durch eine niedrige cytosolische freie Ca2+-Konzentration statt. Der durch Hyperpolarisation bzw. durch lange Depolarisation induzierte transiente Anstieg in der cytosolischen freien Ca2+-Konzentration korrelierte mit einer transienten Aktivierung von S-Typ Anionenkanälen. Die Analyse der Ca2+-Konzentrations- und Zeitabhängigkeit ergab, dass die S-Typ Anionenkanäle durch Ca2+ in einem schnellen Signalweg mit einer halbmaximalen cytosolischen freien Ca2+-Konzentration von 515 nM (SE=235, n=33) aktiviert werden. Der durchschnittliche maximale S-Typ Anionenstrom lag bei -349 pA (SE=107, n=33) bei einer Spannung von -100 mV. Die Wirkung von Ca2+ auf Transportvorgänge über die Plasmamembran wurde auch in Drüsenzellen von Dionaea muscipula untersucht. In diesem Zelltyp induzierte eine mechanische Stimulierung der Triggerhaare ein Ca2+-Signal, wobei mehr als zwei Aktionspotentiale nötig waren, um einen transienten Ca2+-Anstieg auszulösen. Diese Daten zeigen, dass die Depolarisationsphase des Aktionspotentials in den Drüsen nicht direkt mit Ca2+-Flüssen assoziiert ist. Anstelle einer Ca2+-abhängigen Aktivierung scheinen Anionenkanäle in Drüsen von Dionaea muscipula also in einem Ca2+-unabhängigen Signalweg aktiviert zu werden. Diesen Aktivierungsmechanismus gibt es auch im ABA-Signalweg in Schließzellen. Dort findet eine Ca2+-unabhängige Aktivierung der S-Typ Anionenkanäle durch Proteinkinasen wie OST1 und CPK23 statt, wobei die Proteinphosphatase ABI1 als negativer Regulator diskutiert wird. In dieser Arbeit konnte die Redundanz von OST1 und CPK23 sowie Komponenten des Ca2+-abhängigen Weges in DEVC-Experimenten mit ost1-2- und cpk23-Mutanten von Arabidopsis thaliana beobachtet werden, die beide S-Typ Anionenkanalaktivität zeigten. Die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen in Arabidopsis thaliana Mutanten, denen der S-Typ Anionenkanal SLAC1 fehlt, deutet außerdem an, dass redundante S-Typ Anionenkanäle vorhanden sind, die auch durch andere Proteinkinasen aktiviert werden könnten. ABA-induzierte S-Typ Anionenströme waren auch in abi1-Transformanten von Nicotiana tabacum messbar, wobei eine geringere Sensitivität gegenüber ABA als im Wildtyp auftrat, was auf eine unvollständige Inhibierung des ABA-Signalweges hindeutet. Die Redundanz der Intermediate im ABA-Signalweg war auch in Studien mit dem Lipid-abgeleiteten Botenstoff Phosphatidsäure sichtbar, der nur einen langsamen und unvollständigen Stomaschluss induzierte, was allerdings auch auf eine untergeordnete Rolle von Phosphatidsäure im ABA-Signalweg hinweisen könnte.
In dieser Arbeit sollte zunächst die Frage geklärt werden, ob es sich bei SLAC1 um den S-typ Anionenkanal handelt, oder ob SLAC1 nur ein essentieller Bestandteil des Anionenkanals ist. Zur funktionellen Charakterisierung des per se inaktiven SLAC1 Proteins, wurde mit der Suche nach SLAC1-aktivierenden Interaktionspartnern begonnen. Zu diesem Zweck bediente man sich der Methode der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BiFC) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Da bereits die Abhängigkeit der Anionenströme in Schließzellen von De- und Phosphorylierungsereignissen bekannt war, galt Ca2+-abhängigen Kinasen der CPK Familie, ABA-aktivierten Kinasen der SnRK Familie und Phosphatasen des PP2C Typs eine besondere Aufmerksamkeit. Mitglieder dieser Familien wurden bereits mit der Regulation des Stomaschlusses in Verbindung gebracht. Bei diesen Experimenten zeigte sich, dass SnRK2.6 (OST1) und mehrere CPKs deutlich mit SLAC1 physikalisch interagierten. Als Folge dieser Interaktion in Oozyten konnten schließlich nach Koexpression von SLAC1 zusammen mit den interagierenden Kinasen typische S-Typ Anionenströme detektiert werden, wie man sie aus Patch-Clamp Experimenten an isolierten Schließzellprotoplasten kannte. Hierbei bewirkten die Kinasen OST1 und CPK23 die größte Anionenkanalaktivierung. Dieses Ergebnis wird durch die BIFC-Experimente gestützt, da OST1 und CPK23 die stärkste Interaktion zu SLAC1 zeigten. Die elektrophysiologische Charakterisierung der SLAC1-Ströme im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten in Kombination mit in vivo Patch-Clamp Untersuchungen wies SLAC1 eindeutig als den lange gesuchten S-Typ Anionenkanal in Arabidopsis Schließzellen aus. Somit ist die direkte S-Typ Anionenkanalaktivierung durch OST1 auf dem Kalzium- unabhängigen und durch CPKs auf dem Ca2+-abhängigen ABA-Signaltransduktionsweg gelungen. Bei der Spezifizierung der einzelnen Kalzium-Abhängigkeiten dieser Kinasen in Oozyten und in in vitro Kinase Assays konnten weiterhin unterschiedliche Affinitäten der CPKs zu Kalzium festgestellt werden. So vermittelten die schwach Kalzium-abhängigen CPK6 und CPK23 bereits ohne einen Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentratiom über das Ruheniveau hinaus schon die Anionenkanalaktivierung. Die stark Kalzium-abhängigen CPK3 und CPK21 hingegen, werden erst aktiv wenn die ABA vermittelte Signaltransduktion zu einem Anstieg der Kalziumkonzentration führt. Da somit die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 ohne dieses Kalziumsignal aktiv sind, benötigen diese einen übergeordneten Regulationsmechanismus. In den BIFC-Experimenten konnte eine deutliche Interaktion der Phosphatasen ABI1 und 2 zu den SLAC1 aktivierenden Kinasen beobachtet werden. Dass diese Interaktion zu einem Ausbleiben der Anionenkanalaktivierung führt, wurde in TEVC-Messungen gezeigt. Mit diesen Erkenntnissen um die ABA-Signaltransduktionskette in Schließzellen konnten in in vitro Kinase Experimenten ihre einzelnen Glieder zusammengesetzt und der ABA-vermittelte Stomaschluss nachvollzogen werden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass, das unter Wasserstress-Bedingungen synthetisierte Phytohormon, ABA von Rezeptoren der RCAR/PYR/PYL-Familie percepiert wird. Anschließend bindet die Phosphatase ABI1 an den ABA-RCAR1 Komplex. In ihrer freien Form inhibiert die Phosphatase ABI1 die Kinasen OST1, CPK3, 6, 21 und CPK23 durch Dephosphorylierung. Nach Bindung von ABI1 an RCAR1 sind diese Kinasen von dem inhibierenden ABI1 entlassen. Die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 stellen ihre Aktivität durch Autophosphorylierung wieder her. Die stark Ca2+-abhängigen Kinasen CPK3 und 21 benötigt hierzu noch einen ABA induzierten Ca2+-Anstieg im Zytoplasma. Diese Kinasen phosphorylieren anschließend SLAC1 am N-Terminus. Diese Phosphorylierung bewirkt die Aktivierung von SLAC1 woraufhin Anionen aus der Schließzelle entlassen werden. Das Fehlen dieser negativen Ladungen führt zur Depolarisation der Membran woraufhin der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK aktiviert und K+ aus der Schließzelle entlässt. Der Verlust an Osmolyten bewirkt einen osmotisch getriebenen Wasserausstrom und das Stoma schließt sich.
Abscisinsäure-Glucoseester (ABA-GE) kann nach der vorliegenden Untersuchung nicht mehr ausschließlich als Endmetabolit der Abscisinsäure (ABA) gelten. Der unter Stressbedingungen im Xylem verstärkt transportierte ABA-GE trägt in Kombination mit einer extrazellulären ß-D-Glucosidaseaktivität im Blattapoplast zu einer Stabilisierung und Intensivierung des ABA-Langstreckensignals bei.
Agrobacterium tumefaciens ist ein pathogenes Bodenbakterium, welches nach Integration seiner T-DNA in das pflanzliche Genom die Bildung von tumorartigen Wucherungen, den sogenannten Wurzelhalsgallen, an einer Reihe unterschiedlicher Wirtspflanzen verursacht. Die Expression der T-DNA-codierten Onkogene resultiert in der Proliferation und Differenzierung der sogenannten Wurzelhalsgallen, einem Prozess, welcher mit weitreichenden transkriptionellen und physiologischen Veränderungen verbunden ist. Für DNA-Methylierungen ist bekannt, dass diese zu Genexpressionsveränderungen beitragen, welche neoplastisches Wachstum in Säugetieren begünstigen. Über die Funktion epigenetischer Prozesse für die Physiologie und Entwicklung pflanzlicher Tumore ist bisher hingegen wenig bekannt. Daher wurde in dieser Arbeit das Methylierungsmuster von Wurzelhalsgallen, welche an Arabidopsis thaliana induziert wurden, sowohl genomweit als auch auf Basis einzelner Gene bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Onkogene ipt, iaaH und iaaM welche mit der T-DNA ins Genom integriert werden und die Proliferation auslösen, im Tumorgewebe unmethyliert vorliegen. Dennoch sind die Onkogene empfänglich gegenüber epigenetischen Modifikationen, da die siRNA-vermittelte Methylierung sowohl ihre Transkription als auch das Tumorwachstum unterbindet. Eine genomweite Studie der DNA-Methylierungsmuster mittels Tiling-Array-Analysen von immunopräzipitierter methylierter DNA zeigte ein global hypermethyliertes Tumor-Genom im Vergleich zum tumorfreien Sprossgewebe. Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zu den Methylierungsmustern der meisten Säuger-Tumore, welche typischerweise mit globaler Hypomethylierung und lokaler Hypermethylierung von Promotor-Sequenzen assoziiert sind. Im Unterschied dazu waren die Promoter-Sequenzen im Pflanzentumor eher hypomethyliert. Die Methylierungsunterschiede zwischen Wurzelhalsgallen und Sprossgewebe korrelierten mit transkriptionellen Veränderungen. Speziell Gene, welche in Entwicklungsprozessen und Zellteilung involviert sind, waren von Methylierungsänderungen betroffen. Dies impliziert, dass insbesondere diese Prozesse epigenetisch kontrolliert werden. Die Methylierung von Genen, welche einer transkriptionellen Kontrolle durch ABA unterliegen, war durch eine ABA-Behandlung induzierbar. DNA-Methylierungen kontrollieren somit wahrscheinlich essenzielle physiologische Prozesse während der Tumorentwicklung wie beispielsweise die ABA-vermittelte Trockenstressanpassung. Arabidopsis-Mutanten, welche in Nicht-CG-Methylierungsprozessen beeinträchtigt sind, entwickelten größere Tumore als die Kontrollpflanzen der entsprechenden Wildtypen. Dies weist auf eine Inhibierung des Tumor-Wachstums durch ein hypermethyliertes Genom, insbesondere der Nicht-CG-Motive hin. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass Genexpression, physiologische Prozesse und die Entwicklung pflanzlicher Tumore einer Regulation durch DNA-Methylierung unterliegen.
Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden.
Die Stomata in der Epidermis von Pflanzen sind Poren, die den Gasaustausch mit der Atmosphäre regulieren. Die Öffnungsweite der Stomata kann verändert werden, was eine Optimierung der CO2 Aufnahme für die Photosynthese ermöglicht und gleichzeitig den Wasserverlust durch Transpiration minimiert. Um diese Funktion zu erfüllen, können Stomata verschiedene Stimuli wie Wasserstress (durch Abscisinsäure), Licht und CO2 wahrnehmen. Die oben genannten Reize führen dann zu einer Aufnahme oder Abgabe von osmotisch aktiven Substanzen in zwei Schließzellen, welche die Stomaöffnung kontrollieren. Die Rezeptoren zur Wahrnehmung dieser Stimuli, die intrazellulären Signalwege und die beteiligten Ionentransportproteine in den Schließzellen sind nur lückenhaft bekannt. In dieser Arbeit lag ein Hauptaugenmerk auf der Rolle von Anionenkanälen der Plasmamembran bei Stomabewegungen, sowie auf den Signalwegen welche diese Kanäle steuern. Die Aktivität der Anionenkanäle wurde mit der DEVC (Double Electrode Voltage Clamp) Einstich-Methode in Schließzellen in der intakten Pflanze gemessen, kombiniert mit Calcium Imaging durch den Ca2+ Indikator Farbstoff FURA2. Stomaschlussreaktionen werden durch Abscisinsäure (ABA), CO2 und Dunkelheit induziert und bei allen drei Stimuli konnten wir in Nicotiana tabacum eine Aktivierung von Anionenkanälen beobachten. Das führt zu Anionenefflux aus den Schließzellen und einer Depolarisation der Plasmamembran, was wiederum Kalium-Efflux-Kanäle spannungsabhängig aktiviert. Der resultierende Verlust osmotisch aktiver Teilchen führt dann zu Turgorabnahme der Schließzellen und Stomaschluss. Das zeitliche Muster der Anionenkanalaktivität bei dem Stomaschluss, ausgelöst durch CO2, Dunkelheit und ABA war bei allen Reizen ähnlich. Es zeigte sich eine charakteristische transiente starke und darauf folgende schwächere Anionenkanalaktivität. Dieses konservierte Muster lässt Überschneidungen bei der Signaltransduktion der verschiedenen Stimuli vermuten. Die gesteigerte Aktivität der Anionenkanäle während der Reaktion auf ABA und Dunkelheit wurde in ungefähr der Hälfte der Antworten von einem Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration begleitet. Bei beiden Stimuli scheinen somit Ca2+ abhängig und unabhängig Signale intrazellulär weitergeleitet zu werden. Allerdings war der Effekt der Ca2+ Signale auf die Aktivität der Anionenkanäle bei den beiden Stimuli unterschiedlich. Eine zytosolisch erhöhte Ca2+ Konzentration konnte bei Antworten auf ABA nicht mit einer erhöhten Anionenkanalaktivität in Verbindung gebracht werden, bei Dunkelheit hingegen wurde die Aktivität der Anionenkanäle in Anwesenheit von Ca2+ gesteigert. Die wichtige Rolle von Anionenkanälen beim Stomaschluss lässt vermuten, dass ihre Deaktivierung eine Vorraussetzung für eine Stomaöffnung ist. Blaulicht führt bei niedrigen Photonen-Fluss Raten zu Stomaöffnung und sollte daher Anionenkanäle inhibieren. Übereinstimmend damit konnten wir tatsächlich zeigen, dass Blaulicht in Schließzellen von Vicia faba und Arabidopsis thaliana Anionenkanäle deaktiviert. Diese Deaktivierung ist von den Phototropin-Blaulichtrezeptoren abhängig, da die Deaktivierung der Anionenkanäle in Arabidopsis thaliana phot1/phot2 Doppelmutanten nicht beobachtet werden konnte. Neben einer Blaulicht spezifischen Antwort öffnen Stomata auch in Antwort auf photosynthetisch aktive Strahlung (PAR). Die PAR Wahrnehmung scheint zu einem wesentlichen Teil über Veränderungen der interzellulären CO2 Konzentration, ausgelöst durch die Photosyntheseaktivität des Mesophylls, stattzufinden (Roelfsema et al., 2002). In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnten wir in Schließzellen in Albino Blattarealen von Chlorophytum comosum und gebleichten Vicia faba keine Reaktion auf PAR beobachten, obwohl Schließzellen von Chlorophytum comosum in Albino Bereichen funktionierende Chloroplasten besitzen. Die Rolle von CO2 bei der PAR Antwort haben wir des Weiteren in NtMPK4 antisense Pflanzen untersucht. Stomata von NtMPK4 antisense Pflanzen haben nicht auf Änderungen in der atmosphärischen CO2 Konzentration reagiert und zeigten eine stark reduzierte Antwort auf PAR. Diese Ergebnisse bestätigen die wichtige Rolle der intrazellulären CO2 Konzentration bei der PAR Antwort, sie zeigen aber auch, dass es anscheinend zusätzlich zu CO2 noch ein weiteres PAR abhängiges Signal für Stomaöffnung gibt.
Untersuchung zu den frühen ABA-induzierten elektrischen Reaktionen in Schließzellen von Vicia faba
(2008)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Perzeption und frühe Signaltransduktion des Phytohormons ABA in Schließzellprotoplasten von Vicia faba mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Es wurde entdeckt, dass der ABA-Signaltransduktionskette zur Aktivierung von Plasmamembran-ständigen Anionenkanälen voraussichtlich eine Proteinkinase beinhaltet und durch eine cytosolische ABA-Perzeption ausgelöst wird. Die durch ABA-bewirkte Anionenkanal-Aktivierung verursacht in Schließzellen eine Plasmamembran-Depolarisation. Basierend auf der ABA-induzierten Schließzellen-Depolarisation wurde zudem eine Methode etabliert, um mit dem Spannungs-sensitiven Farbstoff DiBAC4(3) in Populationen von intakten Vicia faba-Schließzellprotoplasten Membranpotential-Änderungen zu quantifizieren.
Mit den Experimenten dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ein Phytohormon wie Abscisinsäure mit dem "Solvent-drag" des Wasserflusses apoplastisch durch den Wurzelzellwandbereich in die Xylemgefäße transportiert werden kann. Es konnte ein Bypass-Fluss für ABA durch den gesamten Zellwandapoplasten, auch durch lipophile Barrieren wie Exo- und Endodermis nachgewiesen werden. Dies ist durch die speziellen Moleküleigenschaften von Abscisinsäure möglich: (i) der geringe Durchmesser des Moleküls (8 - 11 nm) und (ii) die hohe Lipophilie von ABA bei schwach sauren pH-Werte. Mit einer Penetration apoplastischer Barrieren ist demnach zu rechnen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Ausbildung solcher lipophilen Zellwandnetze einen signifikanten Einfluss auf den apoplastischen ABA-Transport besitzt. Die Ausbildung einer Exodermis in Mais, wie sie unter natürlichen Bedingungen zu beobachten ist, konnte den ABA-Fluss in das Xylem um die Faktoren 2 bis 4 reduzieren. Da gleichzeitig eine Verminderung der hydraulischen Wurzelleitfähigkeit um denselben Betrag auftrat, blieb das Wurzel-Spross-ABA-Signal, die Phytohormonkonzentration, im Xylem gleich. Die zu den Stomata geleitete Information über den Wasserzustand der Wurzel änderte sich also nicht. Im natürlichen System ist sogar eine Verstärkung des Signals zu erwarten, da eine Exodermis nicht als Aufnahme-Barriere für gewebeproduzierte ABA wirkt. Gleichzeitig verringert sie den Verlust von apoplastischer ABA an die Rhizosphäre. Außerdem wird der Wasserverlust aus dem Gewebe durch eine Exodermis signifikant reduziert wird. Somit sind solche Wurzeln gut an die Bedingungen eines eintrocknenden Bodens angepasst. Apoplastische Barrieren sind demnach, neben membran-lokalisierten Tranportern, wichtige Parameter für die Beurteilung von Wurzeltransporteigenschaften für Wasser und darin gelöste Substanzen. Der Beitrag der apoplastischen Komponente zum Gesamt-ABA-Transport ist abhängig von der untersuchten Pflanzenart, der aktuellen Transpirations- oder Wasserflussrate und von Umwelteinflüssen wie erhöhter ABA-Konzentration im Wurzelgewebe (z.B. durch Trockenstress), pH-Wert der Rhizosphäre und den Ernährungsbedingungen der Pflanze. Erhöhter radialer Wasserfluss, erhöhte ABA-Wurzelgewebegehalte und niedriger pH-Wert der Rhizosphäre verstärken den apoplastischen Bypass-Fluss unter physiologischen Bedingungen. Geringe Wassertransportraten, niedrige ABA-Konzentrationen im Gewebe, alkalische pH-Werte der Rhizosphäre und Ammoniumernährung verstärken dagegen den symplastischen Beitrag zum ABA-Transport. In der vorliegenden Arbeit konnten die sich widersprechenden Theorien bezüglich des ABA-Effektes auf die hydraulische Leitfähigkeit von Wurzeln erklärt werden. ABA erhöht über einen Zeitraum von 2 Stunden die Zellleitfähigkeit (Lp) mit einem Maximum 1 Stunde nach ABA-Inkubation. Dies wirkt sich in einem verstärktem Lpr von intakten Wurzelsystemen aus, das einem ähnlichen Zeitmuster folgt. Pflanzen sind demnach in der Lage, mittels ABA den zellulären Wassertransportweg reversibel zu optimieren, um so unter mildem Trockenstress, wie er in einem gerade eintrocknenden Boden auftritt, die Pflanze mit ausreichend Wasser zu versorgen. Tritt ein länger andauernder Wassermangel ein, versperrt die Pflanze diesen Weg wieder. Dieser transiente Effekt erklärt auch die aus der Literatur bekannten stimulierenden und inhibierenden ABA-Wirkungen. Durch den verstärkten Wasserfluss zu Beginn der Stresssituation erzeugt ABA auf diese Weise ein sich selbst verstärkendes, wurzelbürtiges Hormonsignal in den Spross. Das Blatt erreicht in effektiver Weise eine ABA-Menge, die ausreichend ist, um die Stomata zu schließen. Es folgt eine Reduktion der Transpiration. Eine weiter andauernde Erhöhung des symplastischen Wassertransportweges wäre ohne physiologische Bedeutung. Regulierende Membranstrukturen für diesen Vorgang könnten ABA-sensitive Wasserkanäle (Aquaporine) der Plasmamembran sein. Es wurde gezeigt, dass der Rezeptor für diesen Vorgang innerhalb von corticalen Maiswurzelzellen lokalisiert und hochspezifisch für (+)-cis-trans-ABA ist. Die Signaltransduktion für diesen Kurzzeiteffekt erfolgt nicht mittels verstärkter Aquaporintranskription, könnte aber über ABA-induzierte Aktivierung (Phosphorylierung), oder Einbau von Aquaporinen in die Zellmembran ablaufen. Der Abscisinsäure-Transport ist ein komplexer Vorgang. Er wird beeinflusst durch Umwelteinflüsse, Wurzelanatomie, ist gekoppelt mit dem Wasserfluss und durch sich selbst variierbar. Herkömmliche Vorstellungen einer simplen Hormondiffusion können diesen regulierbaren Vorgang nicht mehr beschreiben. Pflanzen besitzen ein ABA-Transportsystem, das schnell, effektiv und an sich verändernde Umweltbedingungen adaptierbar ist.