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Von Juli 1995 bis August 1999 konnten 34 Patienten/innen der chirurgischen Universitätsklinik Würzburg, die entweder an einem Rektumkarzinom oder einem Karzinom des rekto-sigmoidalen Übergangs erkrankt waren, in diese prospektive, offene und kontrollierte Studie eingeschlossen werden. Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit war die Dokumentation perioperativer Verläufe von pro- und kontrainflammatorischen Serumparametern und die Darstellung der antibiotikainduzierten Endotoxinämie in vivo. Kolorektale Eingriffe bieten sich an, da sich hier in den letzten Jahren aufgrund des dort herrschenden Keimreservoirs die prophylaktische Gabe von Antibiotika als Standardmaßnahme durchgesetzt hat. Bei diesen Patientengruppen ist ein standardisiertes präoperatives Regime bei der Operationsvorbereitung gewährleistet. Auch das intraoperative Vorgehen ist bei ausschließlich offenem Operationsverfah-ren standardisiert. Zusätzlich ergibt sich durch das meist in der zweiten Lebenshälfte auftretende Karzinom eine vergleichbare Altersstruktur der Patienten. Es war daher möglich, eine von den Eingangs- und Umgebungsvoraussetzungen reproduzierbare und vergleichbare Personengruppe zu untersuchen. Ziel war es nun, mit in Vorversuchen erprobten Untersuchungsintervallen die perioperativen Verläufe der ausgewählten Parameter zu dokumentieren. Die klinische Relevanz der Untersuchungen stellt die Erfassung und Früherkennung infektiöser postoperativer Komplikationen dar. Dazu wurden entsprechende pro- und kontrainflammatorische Untersuchungsparameter ausgewählt. Dabei wurden klassische und klinisch erprobte Kontrollwerte, wie Leukozytenzahl, Körpertemperatur, C-reaktivem Protein und Procalcitonin, und bis jetzt vornehmlich experimentell verwendete Indikatoren, wie Plasma-Endotoxin, Tumornekrosefaktor α und Interleukin 10, betrachtet. Ein zweites Untersuchungsziel war der in-vivo-Vergleich unterschiedlicher zur medikamentösen Antibiotikaprophylaxe zugelassener Präparate. Bei chirurgischen Intensivpatienten konnte bereits bei verschiedenen Antibiotika eine differenzierte Endotoxinfreisetzung und eine Sekretion proinflammatorischer Zytokine nachgewiesen werden. Bei Patienten in kritischem Allgemeinzustand bei geschwächter Immunabwehr könnte die unterschiedliche Freisetzung von Zytokinen bei verschiedenen Antibiotika von entscheidender Bedeutung sein. In dieser Arbeit wurden die in unserer Klinik routinemäßig verwendete Kombination aus Cefotiam und Metronidazol gegen zwei Vertreter aus der Gruppe der Chinolone getestet. Die Eignung der untersuchten Parameter zur Früherkennung von postoperativen Komplikationen lässt sich aufgrund der hier vorgestellten Ergebnisse nicht beantworten. Dazu müssen weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um zu zeigen, wie sich die einzelnen Parameter im Fall komplizierter klinischer Verläufe verhalten. Nötig sind breiter angelegte Studien mit größeren Fallzahlen unter Einbeziehung komplikationsbehafteter Fälle. Ganz deutlich wird aufgrund dieser Arbeit aber, dass für Endotoxin als Früherkennungsparameter die differenzierte Auswahl des applizierten Antibiotikums für die spätere Aussagekraft eine entscheidende Rolle spielt. Aus heutiger Sicht ist zur Einschätzung der Aussagekraft der LPS-Plasmakonzentration aufgrund großer interindividueller Schwankungsbreiten des Endotoxinspiegels eine Verlaufskontrolle mit einem personenspezifischen Ausgangswert zu empfehlen.
Bislang inhibieren antibakterielle Substanzen in erster Linie die Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel sowie die Proteinsynthese. In dieser Arbeit wurde ein erster Versuch unternommen, neue Zielstrukturen für die Antibiotika-Therapie in S. aureus zu finden. Insgesamt wurden 10 Gene untersucht, die Funktion von 7 dieser Gene war in S. aureus unbekannt. Zunächst sollte herausgefunden werden, ob diese 10 Zielgene: topB, polA, nusG, SA1857, SA1444, SA1063, SA0453, SA0241, SA0245, SA0367, für S. aureus essentiell sind. Es wurde versucht, jedes dieser Gene in S. aureus zu deletieren. Außer den Genen SA1444, SA0245 und nusG konnten alle Zielgene deletiert werden und waren daher für S. aureus nicht essentiell. Die Deletionsmutanten ΔtopB, ΔpolA, ΔSA1857, ΔSA1063, ΔSA0453, ΔSA0241, ΔSA0367 wurden außerdem in einem Sepsismodell in Mäusen untersucht und waren nicht attenuiert. Gene, die weder in vitro noch in vivo essentiell sind, sind nur von geringem Interesse für die Entwicklung neuer Antibiotika. Zur Untersuchung essentieller Gene in S. aureus wurden vier verschiedene konditionale Expressionssystem untersucht. Bei drei dieser Systeme wurde der wildtypische Promotor gegen einen regulierbaren Promotor ausgetauscht. Bei einem weiteren System handelte es sich um einen Antisense-RNA-Ansatz. Zur Überprüfung der konditionalen Expressionssysteme („proof-of-principle“) wurden die bekannten essentiellen Gene ligA und dnaE in S. aureus mutiert. Eines dieser konditionalen Expressionssysteme, das pLL30/Pspac/pMJ8426-System, konnte erfolgreich in S. aureus angewandt werden. Die konditionale Expression von ligA und von SA0245 wurde mit diesem System erzielt. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 dieses konditionalen Expressionssystems enthält eine Insertionskassette, die das Antibiotikaresistenzgen cat (Chloramphenicol-Acetyltransferase) sowie den regulierbaren Promotor Pspac enthält. Ein wesentliches Merkmal des pLL30/Pspac/pMJ8426-Systems ist die stabile Integration des Resistenzmarkers cat und des Pspac-Promotors durch ein doppeltes Crossover Ereignis vor dem Zielgen. Der Temperatur-sensitive Shuttle-Vektor pLL30 kann anschließend durch mehrfaches Subkultivieren der Bakterien bei nicht permissiver Temperatur eliminiert werden. Der Repressor LacI wird auf einem Extra-Plasmid pMJ8426 kodiert und wird nach erfolgter Integration des Pspac-Promotors vor dem Zielgen in die Bakterien transformiert. Mehrere Kopien des Repressorplasmids ermöglichen eine gute Repression an Pspac. Durch die Zugabe des Induktors IPTG kann der Repressor LacI inaktiviert und die Gen-Expression induziert werden. Insbesondere konnte dieses konditionale Expressionssystem erfolgreich im Tiermodell angewandt werden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die genetische und funktionelle Charakterisierung von SA0367. Durch biochemische Untersuchungen wurde gezeigt, dass dieses Gen für eine FMN-enthaltende Oxidoreduktase codiert. Auf Grundlage der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Funktion des Proteins wurde das Gen SA0367, in Analogie zum orthologen Gen nfrA aus B. subtilis, in nfrA umbenannt. Die Oxidoreduktase NfrA oxidiert NADPH in Gegenwart von FMN. In Gegenwart von NADPH und FMN zeigt das Enzym NfrA außerdem Nitroreduktase- und eine leichte Disulfidreduktase-Aktivität. Induktionsexperimente im Wildtyp zeigten, dass nfrA durch oxidativen Stress, verursacht von Diamide oder Nitrofurantoin, und durch Ethanol induziert wird. Ethanol und oxidativer Stress führt zu Denaturierung von Proteinen. NfrA könnte an der Reparatur geschädigter Proteine beteiligt sein. Die Induktion von nfrA in S. aureus erfolgt unabhängig vom alternativen Sigmafaktor SigB. Durch Primer Extension-Experimente wurde eine putative PerR-Box vor dem nfrA-Gen identifiziert. Diese könnte für die Regulation von nfrA wichtig sein. Außerdem wird nfrA während des gesamten Wachstumszyklus von einem SigAabhängigen Promotor exprimiert. Die Deletionsmutante ΔnfrA zeigt nur in Gegenwart hoher Ethanolkonzentrationen von 6,5 % einen leichten Wachstumsnachteil im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem weist die ΔnfrA-Mutante eine höhere Resistenz gegenüber Nitrofurantoin auf. In weiteren Untersuchungen wurde begonnen die Funktion der Ser/Thr-Kinase SA1063 durch Microarray-Experimente aufzuklären. Hierbei wurde deutlich, dass dieses Gen eine regulatorische Rolle bei der Zellwandsynthese in S. aureus spielen könnte.