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Kovalente Inhibition stellt einen effektiven Weg dar, die Verweildauer des Liganden innerhalb einer Bindetasche zu erhöhen. In dieser Arbeit wurden theoretische Methoden angewendet, um die Reaktivität und den nichtkovalenten Zustand vor der Reaktion zu modellieren. Im Rahmen einer Fallstudie zu Cathepsin K wurden nichtkovalente Modelle von kovalenten Inhibitoren generiert. Für verschiedene Komplexe aus Cathepsin K und einem kovalent gebundenem Liganden wurde der Zustand vor der Reaktion modelliert und dessen Stabilität im Rahmen einer klassischen MD-Simulation überprüft. Die Stabilität des Warheads in der Bindetasche hing hauptsächlich vom gewählten Protonierungszustand der katalytischen Aminosäuren ab. Für eine Reihe von Inhibitoren der ChlaDUB1 wurde ein Protokoll aus quantenmechanischen Rechnungen genutzt, um die Reaktivität verschiedener Warheads abzuschätzen. Die erhaltenen Aktivierungsenergien korrelierten mit experimentell bestimmten Raten zur Inaktivierung des Enzyms. Im Rahmen eines Wirkstoffdesign-Projektes zur Deubiquitinase USP28 wurden von unpublizierten Kristallstrukturen ausgehend erste Docking-Experimente durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass ein literaturbekannter Inhibitor von USP28 mit einem Warhead so modifiziert werden kann, dass die reaktive Einheit in direkter Nachbarschaft zu einem Cystein positioniert wird. Für diese Warheads wurden ebenfalls quantenmechanische Rechnungen zur Bestimmung der Aktivierungsenergie durchgeführt. Um besser nachvollziehen zu können, warum bei einem Photoswitch-Inhibitor der Butyrylcholin-Esterase der cis-Zustand des Moleküls besser inhibiert als der trans-Zustand, wurde eine Docking-Studie des Zustandes vor der Reaktion durchgeführt. Es konnte ein qualitatives Modell aufgestellt werden, das zeigt, dass der trans-Zustand aufgrund seiner längeren Form mit wichtigen Aminosäuren am Eingang der Bindungstasche kollidiert.
Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert
dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes
verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält
somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder
die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie
Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur
Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in
der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN
inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A
wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle
einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein.
Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des
Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau
des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und
molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu
identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn
beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde
für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN
alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und
wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde
fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur
Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden
synthetisiert.
Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN
Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI
Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays.
Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt
werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer
zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein.
Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt.
Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für
die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das
aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete
Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch
energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden.
Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden
basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht.
Die AAA+ ATPase p97 ist ein essenzielles Protein, das an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt ist und eine Schlüsselrolle in der Protein-Homöostase spielt. Die funktionale Diversität von p97 beruht auf der Interaktion zahlreicher unterschiedlicher Kofaktoren, die vorwiegend an die N-Domäne von p97 binden. Aufgrund seiner Bedeutung in der Regulierung diverser physiologischer und pathologischer Prozesse stellt p97 eine interessante Zielstruktur für die Entwicklung neuer Wirkstoffe dar, die insbesondere in der Krebstherapie von Bedeutung sein könnte. Bekannte p97-Inhibitoren greifen vor allem die ATPase-Funktion des Proteins an. Ein neuer pharmakologischer Ansatz stellt die Inhibierung der Kofaktorbindung an die N-Domäne dar. Ein solcher Protein-Protein-Interaktionsinhibitor wäre nicht nur von therapeutischem Interesse, sondern hätte auch einen besonderen Nutzen für die Entschlüsselung molekularer und zellulärer Funktionen von p97-Kofaktoren. In dieser Arbeit wurde ein fragmentbasierter Ansatz für die Identifizierung von chemischen Startstrukturen für die Entwicklung eines Protein-Protein- Interaktionsinhibitors verfolgt. Als Zielstruktur wurde die SHP-Bindestelle in der N-Domäne gewählt. Die Identifizierung von Liganden erfolgte sowohl durch computergestützte Methoden (insbesondere virtuelles Screening und Molekulardynamik-Simulationen) als auch experimentell durch biophysikalische Techniken (wie Biolayer-Interferometrie, Röntgenstrukturanalyse und ligandbasierte NMR-Techniken). Die Grundlage des computerbasierten Designs stellte eine Analyse der bekannten Kristallstrukturen der p97-Komplexe mit den SHP-Motiven der Kofaktoren UFD1 und Derlin-1 dar. Darüber hinaus dienten Molekulardynamik-Simulationen der Analyse der Wassereigenschaften innerhalb der SHP-Bindestelle. Darauf aufbauend wurden verschiedene Pharmakophormodelle entwickelt, die die Grundlage des im Anschluss durchgeführten virtuellen Screenings und Dockings bildeten. Anhand der Ergebnisse von Molekulardynamik-Simulationen wurden zehn Verbindungen für die experimentelle Validierung ausgewählt. Hiervon konnten zwei Fragmente in STD-NMR- und Biolayer-Interferometrie-Experimenten als Liganden bestätigt werden. In einem parallel durchgeführten biophysikalischen Fragmentscreening mittels Biolayer-Interferometrie wurden unter mehr als 650 Verbindungen 22 identifiziert, die an die N-Domäne binden. 15 dieser Fragmente wurden durch einen orthogonalen STD-NMR-Assay bestätigt. Fünf dieser Verbindungen zeigten Affinitäten mit KD-Werten kleiner 500μMund günstigen Ligandeffizienzen. Des Weiteren konnte die Bindungskinetik und Affinität des in der Literatur als p97-Inhibitor berichteten Naturstoffes Xanthohumol bestimmt und eine Bindung an die N-Domäne bestätigt werden. Zur Identifizierung möglicher Bindestellen dieser fünf Fragmente wurden mixed-solvent Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt. Diese ergaben, dass alle Verbindungen die SHP-Bindestelle in der N-Domäne adressieren. Die Regionen fielen mit hot spots der Kofaktorwechselwirkungen zusammen und stellen somit mögliche Ankerpunkte für die Weiterentwicklung dar. Für zwei Fragmente konnten die postulierten Bindestellen mittels Röntgenstrukturanalyse bzw. STD-NMR-Messungen an p97-Alanin-Mutanten bestätigt werden. Die erhaltene Röntgenstruktur ist die erste p97-Struktur, die ein gebundenes Fragment an der N-Domäne zeigt.
Bakterielle und parasitäre MIP-Proteine stellen wichtige Virulenzfaktoren dar, deren Inhibition das Überleben der Erreger sowie deren Penetration in menschliche Zellen stark einschränken kann. In dieser Arbeit standen die MIP-Proteine von Burkholderia pseudomallei (Auslöser der Melioidose) und Legionella pneumophila (Legionärskrankheit) im Fokus. Außerdem wurde das MIP-Protein von Trypanosoma cruzi (Chagas-Krankheit) untersucht. Die strukturverwandten humanen FKB-Proteine FKBP12 und FKBP52 sind relevante „off-targets“, wie Experimente mit Knockout-Mäusen gezeigt haben.
Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung von bekannten MIP-Inhibitoren im Hinblick auf ihre Affinität und Selektivität für MIP-Proteine gegenüber den beiden genannten FKB-Proteinen bei gleichzeitig verbesserter Löslichkeit, mit Hilfe von in silico Methoden. Ausgangspunkt waren hierbei zwei von Dr. Christina Juli und Dr. Florian Seufert entwickelte Leitstrukturen, welche ein Pipecolinsäuregrundgerüst aufweisen. Diese Referenzliganden beinhalten einen 3,4,5-Trimethoxyphenylring (TMPR, vgl. Ref_t) bzw. einen Pyridinylring (Ref_p).
Beim Vergleich von insgesamt 32 MIP- und FKB-Proteinen konnten in zwei Loop-Bereichen, welche 50er bzw. 80er Loop genannt werden, relevante Unterschiede in der Aminosäuresequenz identifiziert werden. Die Nummerierung bezieht sich stets auf FKBP12. Diese Unterschiede ließen sich zum Design von vergleichsweise selektiv an MIP-Proteine bindenden Molekülen nutzen.
Der 50er Loop ist in nahezu allen MIP-Proteinen (jedoch nicht in BpsMIP) im Vergleich zu den FKB-Proteinen um zwei Aminosäuren verkürzt. Dadurch befindet sich das Proteinrückgrat von LpnMIP (Gln49) und TcrMIP (Arg49) näher am Zentrum der Bindetasche (definiert als Ile56, welches durch die Pipecolinsäureesterfunktion der Liganden adressiert wird). MD-Simulationen der beiden Apoproteine belegten, dass die geringere Distanz nicht durch Artefakte beim Modellieren der Strukturen bedingt ist. Aufbauend auf dieser Erkenntnis wurde gezeigt, dass der Pyridinylring von Ref_p eine Wasserstoffbrücke zu Gln49 ausbildet. Experimentell wurde dieser Befund durch eine entsprechende chemische Verschiebung der Aminosäure im NMR-Experiment von Dr. Kristian Schweimer bestätigt. Durch Überbrückung des Pipecolinsäurerings (Ligand 6bp) konnte die Wasserstoffbrücke in MD-Simulationen weiter stabilisiert werden. Durch Rechnungen zur Abschätzung der freien Bindungsenthalpien (mittels LIE und MM/GBSA) wurde eine erhöhte Affinität von 6bp im Vergleich zu Ref_p in LpnMIP ermittelt.
Im Laufe der Arbeit wurde anhand von pIC50-Werten, welche von Dr. Mathias Weiwad bestimmt wurden, erkannt, dass Liganden mit Pyridinylring oftmals eine bessere Affinität in LpnMIP aufweisen als die entsprechenden Liganden mit TMPR. Durch MD Simulationen wurde nachgewiesen, dass der TMPR in LpnMIP nur schwer an der in den anderen Proteinen bevorzugten Position binden kann. Grund hierfür ist die Mutation einer Aminosäure (zu Pro57) in diesem Bereich von LpnMIP: Diese verfügt über eine wenig flexible Seiten-kette, an welche sich der TMPR auf Grund seiner Rigidität nicht anpassen kann, was die Interaktion zwischen Protein und Ligand stört. Der Pyridinylring von Ref_p ist hiervon nicht betroffen, da er bevorzugt an einer anderen Stelle (Gln49, s. o.) bindet.
Der 80er Loop weist in vielen MIP-Proteinen deutlich hydrophobere Aminosäuren auf als in FKB-Proteinen. Von besonderem Interesse ist die Position 90, da hier in BpsMIP und LpnMIP sterisch weniger anspruchsvolle Aminosäuren (Val, Pro) vorliegen als in den bei-den FKB-Proteinen (Ile, Lys). Dieser Unterschied wurde mit kleinen hydrophoben Substituenten am Phenylring der Liganden adressiert. Bereits im Docking zeigten sich die positiven Effekte der para-Substitution durch Halogenatome oder eine Methylgruppe. Die von Dr. Mathias Weiwad und Dr. Mirella Vivoli ermittelten pIC50- bzw. pKi-Werte bestätigten diesen Trend. Zugleich nahm die Affinität zu FKBP12 deutlich ab. Bei der Untersuchung der Referenzliganden sowie deren Chlor- und Bromderivate in MD-Simulationen zeigte sich, dass der Phenylring der Liganden in den MIP-Proteinen bevorzugt in Richtung des 80er Loops orientiert ist; in den FKB-Proteinen liegt er hingegen um etwa 110° gedreht vor und kann somit schlechter mit der Bindetasche interagieren. Besonders ausgeprägt ist dieser Effekt in FKBP12. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der Phenylring durch einen 4-Bromo-1H-imidazol-2-ylsubstituenten ersetzt (Ligand 8ap). Dieser ist in der Lage, in der erwarteten Orientierung im Bereich des 80er Loops von BpsMIP zu binden und gleichzeitig eine stabile Wasserstoffbrücke zu Asp37 auszubilden. Hieraus resultiert für den Liganden eine deutlich höhere Affinität in LIE- und MM/GBSA-Rechnungen; in FKBP12 blieb sie auf Grund der dort instabilen Interaktion unverändert.
Die berechneten Energien können unmittelbar für einen relativen Vergleich verschiedener Liganden in einer Bindetasche verwendet werden. Für die Vorhersage von pKi- bzw. pIC50-Werten in den verschiedenen Proteinen ist eine Kalibrierung gegen die gemessenen Affinitäten erforderlich. Dies wurde für BpsMIP durchgeführt, indem eine lineare Korrelation zwischen den pKi- bzw. pIC50-Werten und den mit MM/GBSA ermittelten Energien aufgestellt wurde. Für LIE wurde auf publizierte Werte von Lamb et al. zurückgegriffen. Die berechneten Affinitäten stimmen für die bereits getesteten Inhibitoren gut mit den experimentellen pKi- und pIC50-Werten überein. Anhand der Modelle werden für 8ap Werte vorhergesagt, die besser als die experimentellen Affinitäten bekannter Liganden sind.
Idealerweise können auch aus den Scores, die durch Docking erhalten werden, bereits Rückschlüsse auf die Affinitäten der Liganden gezogen werden. Für die untersuchten Proteine war dies, auf Grund des engen Bereichs der experimentell ermittelten pKi- und pIC50-Werte, nicht mit hinreichender Richtigkeit möglich. Um die Scores dennoch für die Beurteilung neuer Liganden verwenden zu können, wurden logistische Regressionsmodelle erstellt. Anhand dieser kann abgeschätzt werden, ob ein Molekül in BpsMIP submikromolare Affinität aufweist. Die Richtigkeit dieser Vorhersagemodelle konnte durch die Berücksichtigung dreier weiterer Deskriptoren (Konfiguration am Stereozentrum der Pipecolinsäure, Molekulargewicht und logD-Wert) deutlich verbessert werden, wobei die AUC der entsprechenden ROC-Kurven Werte bis zu 0.9 erreichte. Diese Modelle können für die Postprozessierung eines Dockings angewendet werden, um die vielversprechendsten Kandidaten zu identifizieren und anschließend in rechnerisch anspruchsvolleren MD-Simulationen genauer zu untersuchen.
Mit dieser Arbeit wurde zur Weiterentwicklung der Leitstrukturen Ref_t und Ref_p beigetragen. Viele der getesteten Derivate wiesen deutlich verbesserte Löslichkeit bei gleichbleibender Affinität auf. Ferner wurden erstmalig detailliert die Unterschiede in den Bindetaschen zwischen 32 MIP- und FKB-Proteinen evaluiert. Hiervon wurden fünf in MD-Simulationen als Apoprotein und im Komplex mit verschiedenen Inhibitoren verglichen. Anhand dieser Simulationen wurde nachgewiesen, dass jeweils eine Aminosäure in BpsMIP und LpnMIP im Vergleich zum wichtigsten „off-target“ FKBP12 selektiv durch eine Wasserstoffbrücke adressiert werden kann. Durch LIE- und MM/GBSA-Rechnungen konnte gezeigt werden, dass in diesen hochkonservierten Bindetaschen eine bedeutende Modulation der Affinität zugunsten von BpsMIP möglich ist.
Dockingbasierte Ansätze zählen zu den wichtigsten Komponenten im virtuellen Screening. Sie dienen der Vorhersage der Ligandposition und -konformation in der Bindetasche sowie der Abschätzung der Bindungsaffinität zum Protein. Bis heute stellt die korrekte Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen ein noch nicht vollständig gelöstes Problem für Scoringfunktionen dar. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist daher der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gewidmet.
Der Fokus eines ersten Teilprojektes lag auf der Berücksichtigung der Absättigung vergrabener Wasserstoffbrückenakzeptoren (HBA) und -donoren (HBD) bei der Bewertung von Docking-Lösungen. Nicht-abgesättigte vergrabene HBA und HBD stellen einen der Bindungsaffinität abträglichen Beitrag dar, der bis dato aufgrund fehlender Struktur- bzw. Affinitätsdaten in Scoringfunktionen vernachlässigt wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer detaillierten Untersuchung zur Häufigkeit vergrabener nicht-abgesättigter HBA und HBD in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes eine empirische Filterfunktion („vnaHB“-Filterfunktion) entwickelt, die unerwünschte Ligandbindeposen erkennt und von der Bewertung mittels Scoringfunktionen ausschließt. Der praktische Nutzen der empirischen Filterfunktion wurde für die Scoringfunktionen SFCscore und DSX anhand vorgenerierter Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes untersucht. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass eine Absättigung vergrabener polarer Gruppen in Protein-Ligand-Komplexen für eine hochaffine Protein-Ligand-Bindung notwendig ist, da vergrabene nicht-abgesättigte HBA und HBD nur selten auftreten. Eine vollständige Absättigung durch entsprechende Proteinpartner wird für ca. 48 % der untersuchten Komplexe beobachtet, ca. 92 % weisen weniger als drei hauptsächlich schwache, nicht-abgesättigte HBA bzw. HBD (z. B. Etherfunktionen) auf. Unter Einbeziehung von Wassermolekülen in die Häufigkeitsanalyse sind sogar für ca. 61 % aller Komplexe alle wasserstoffbrückenbindenden Gruppen abgesättigt. Im Gegensatz zu DSX werden für SFCscore nach Anwendung der empirischen Filterfunktion erhöhte Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose (≤ 2.0 Å Abweichung) unter den am besten bewerteten Docking-Posen erzielt. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::229m) werden Steigerungen dieses als „Docking Power“ bezeichneten Kriteriums für die Top-3-Posen (Erfolgsrate für die Identifizierung einer kristallnahen 2.0 Å Pose unter den besten drei Docking-Lösungen) von 63.1 % auf 64.2 % beobachtet.
In einem weiteren Teilprojekt wurden repulsive Protein-Ligand-Kontakte infolge sterischer Überlappungen der Bindungspartner bei der Bewertung von Docking-Lösungen berücksichtigt. Die adäquate Einbeziehung solcher repulsiver Kontakte im Scoring ist für die Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen entscheidend, jedoch aufgrund fehlender Affinitäts- bzw. Strukturdaten problematisch. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis des Lennard-Jones-Potentiales des AMBER-Kraftfeldes zunächst ein neuer Deskriptor zur Beschreibung repulsiver Kontakte („Clash“-Deskriptor) entwickelt und zur Untersuchung der Häufigkeit ungünstiger Protein-Ligand-Kontakte in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes herangezogen. Eine aus der Häufigkeitsverteilung abgeleitete empirische Filterfunktion („Clash“-Filterfunktion) wurde anschließend der Bewertung von Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes mittels der Scoringfunktionen SFCscore und DSX vorgeschaltet, um unerwünschte Ligandbindeposen auszuschließen. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass vorwiegend schwache repulsive Kontakte in Protein-Ligand-Komplexen auftreten. So werden in 75 % der Komplexe des Hartshorn-Datensatzes abstoßende Potentiale unter 0.462 kcal/mol beobachtet. Zwar betragen die ungünstigen Beiträge pro Komplex für 50 % aller Strukturen ca. 0.8 kcal/mol bis 2.5 kcal/mol, jedoch können diese auf Ungenauigkeiten der Kristallstrukturen zurückzuführen sein bzw. durch günstige Protein-Ligand-Wechselwirkungen kompensiert werden. Die Anwendung der „Clash“-Filterfunktion zeigt signifikante Verbesserungen der Docking Power für SFCscore. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::frag) werden Steigerungen der Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose unter den drei am besten bewerteten Docking-Lösungen von 61.4 % auf 86.9 % erzielt, was an die Docking Power der bis dato besten Scoringfunktionen aus der Literatur (z. B. DSX, GlideScore::SP) heranreicht (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). Die „Clash“-Filterfunktion allein ist auch der Kombination der „Clash“- und der „vnaHB“-Filterfunktion überlegen.
Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde auf die Einbeziehung von Decoy-Daten (Struktur- und Affinitätsdaten schwach affiner und inaktiver Liganden) im Zuge der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gelegt. Dadurch soll eine adäquate Berücksichtigung ungünstiger Beiträge zur Bindungsaffinität ermöglicht werden, die für die Richtigkeit und Zuverlässigkeit ermittelter Vorhersagen essentiell ist. In der vorliegenden Arbeit wurden binäre Klassifizierungsmodelle zur Bewertung von Docking-Lösungen entwickelt, die die Einbeziehung von Decoy-Daten ohne die Verfügbarkeit von Affinitätsdaten erlauben. Der Random-Forest-Algorithmus (RF), SFCscore-Deskriptoren, der neu entwickelte „Clash“-Deskriptor, und die Decoy-Datensätze von Cheng und Huang (Trainingsdaten) bilden die Grundlage des leistungsfähigsten Klassifizierungsmodells. Der praktische Nutzen des „besten“ RF-Modells wurde nach Kombination mit der Scoringfunktion DSX anhand der Docking Power für das Auffinden einer kristallnahen Pose auf Rang 1 am unabhängigen Cheng-/Huang- (Komplexe, die nicht in den Trainingsdaten enthalten sind) und CSAR-2012-Testdatensatz untersucht. Gegenüber einer alleinigen Anwendung von DSX werden an beiden Testdatensätzen weitere Verbesserungen der Docking Power erzielt (Cheng-/Huang-Testdatensatz: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012-Testdatensatz: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). Das „beste“ Modell zeichnet sich durch die zuverlässige Vorhersage richtig-positiver Docking-Lösungen für einige wenige Komplexe aus, für die DSX keine kristallnahe Ligandkonformation identifizieren kann. Ein visueller Vergleich der jeweils am besten bewerteten RF- und DSX-Pose für diese Komplexe zeigt Vorteile des RF-Modells hinsichtlich der Erkennung für die Protein-Ligand-Bindung essentieller Wechselwirkungen. Die Untersuchung der Bedeutung einzelner SFCscore-Deskriptoren für die Klassifizierung von Docking-Lösungen sowie die Analyse der Misserfolge nach Anwendung des Modells geben wertvolle Hinweise zur weiteren Optimierung der bestehenden Methode. Hinsichtlich der zu bewertenden Eigenschaften ausgeglichenere Trainingsdaten, Weiterentwicklungen bestehender SFCscore-Deskriptoren sowie die Implementierung neuer Deskriptoren zur Beschreibung bis dato nicht-berücksichtigter Beiträge zur Bindungsaffinität stellen Ansatzpunkte zur Verbesserung dar.
Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit umfasst die Anwendung dockingbasierter Methoden im Rahmen der Entwicklung neuer Inhibitoren des „Macrophage Infectivity Potentiator“-(MIP)-Proteins von Legionella pneumophila und Burkholderia pseudomallei.
Das MIP-Protein von Legionella pneumophila stellt einen wichtigen Virulenzfaktor und daher ein attraktives Zielprotein für die Therapie der Legionellose dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgten systematische Optimierungen des Pipecolinsäure-Sulfonamides 1, des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM). Nach Hot-Spot-Analysen der Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Die Ergebnisse der Hot-Spot-Analysen zeigen günstige Wechselwirkungsbereiche für Donorgruppen und hydrophobe Substituenten in meta-Position sowie Akzeptorgruppen in para-Position des Benzylringes von 1 auf. Die Einführung einer Nitrofunktion in para-Position des Benzylringes von 1 (2h) resultiert in einer erhöhten MIP-Inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), was wahrscheinlich auf die Ausbildung einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke zu Gly116 zurückzuführen ist. Selektivitätsverbesserungen gegenüber dem strukturverwandten humanen FKBP12-Protein werden insbesondere für das para-Aminoderivat von 1 (2n) erzielt (Selektivitätsindex (1): 45, Selektivitätsindex (2n): 4.2; mit Selektivitätsindex = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring (2s) führt zu einer verbesserten Löslichkeit bei vergleichbarer MIP-Inhibition.
Das MIP-Protein von Burkholderia pseudomallei spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Melioidose und stellt daher ein attraktives Zielprotein für die Entwicklung neuer Arzneistoffe dar. In der vorliegenden Arbeit erfolgten Optimierungen des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors 1. Ausgehend von einem Strukturvergleich von Burkholderia pseudomallei MIP mit Legionella pneumophila MIP und einer Hot-Spot-Analyse der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Der Strukturvergleich zeigt eine hohe Homologie beider Bindetaschen. Größere konformelle Änderungen werden lediglich für den von Ala94, Gly95, Val97 und Ile98 geformten Bindetaschenbereich beobachtet, was unterschiedliche Optimierungsstrategien für 1 erforderlich macht. Günstige Wechselwirkungsbereiche der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche finden sich einerseits für Donorgruppen oder hydrophobe Substituenten in para-Position des Benzylringes (Region A) von 1, andererseits für Akzeptor- bzw. Donorgruppen in para- bzw. meta-/para-Position des Trimethoxyphenylringes (Region B). Anhand von Docking-Studien konnten sowohl für Variationen in Region A als auch in Region B aussichtsreiche Kandidaten identifiziert werden. Initiale MIP-Inhibitionsmessungen der bis dato synthetisierten Derivate deuten auf erhöhte Hemmungen im Vergleich zu 1 hin. Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring führt auch hier zu vergleichbarer MIP-Inhibition bei verbesserter Löslichkeit. Derzeit sind weitere Synthesen und Testungen aussichtsreicher Liganden durch die Kooperationspartner geplant. Die Ergebnisse der Inhibitionsmessungen sollen deren Nutzen als MIP-Inhibitoren aufzeigen und wertvolle Informationen für weitere Zyklen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns liefern.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Tuberkulose, einer schwerwiegenden bakteriellen Infektionskrankheit, die am häufigsten die Lunge befällt. Die Entwicklung neuer Arzneistoffe gegen diese Erkrankung ist immens wichtig, da nach Angaben der WHO weltweit jährlich über 1 Million Menschen an den Folgen der Tuberkulose sterben, derzeit kein effizienter Impfstoff zur Verfügung steht und sich die Therapiemöglichkeiten auf wenige Arzneistoffe beschränken. Zudem steigt weltweit das Auftreten von arzneistoff- und totalresistenten Tuberkuloseformen. Tuberkulose wird vorwiegend durch das Mycobacterium tuberculosis erregt. Eine Besonderheit des M. tuberculosis stellt die mykobakterielle Zellwand dar, da diese durch einen hohen Anteil an Fettsäuren besonders wachsartig und dick ist. Die mykobakterielle Fettsäuresynthese unterscheidet sich signifikant von der Synthese eukaryotischer Fettsäuren. Daher besteht die Möglichkeit, Inhibitoren der mykobakteriellen Fettsäuresynthese als effektive und selektive neue Antituberkulotika zu entwickeln. Zielstruktur dieser Arbeit ist KasA (β-Ketoacylsynthase), ein Enzym der mykobakteriellen Fettsäuresynthese II, das die Kondensation zwischen der wachsenden Fettsäurekette und Malonyl-ACP katalysiert. Ein literaturbekannter KasA-Inhibitor ist Thiolactomycin, ein Thiolacton-Derivat mit einer schwachen inhibitorischen Aktivität (IC50: 242 µM; Kd 226 µM), für den eine KasA-Komplexstruktur verfügbar ist. Ziel der Arbeit war es, mittels computergestützten Wirkstoffdesigns neue Leitstrukturen für KasA-Inhibitoren zu entwickeln und davon abgeleitet Substanzbibliotheken kleiner Moleküle zu synthetisieren. Zur Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten sollte KasA exprimiert und ein Assay etabliert werden. Theoretische und experimentelle Affinitäten sollten anschließend analysiert und bewertet werden. Zur Identifizierung neuer potenzieller KasA-Inhibitoren wurde mit Hilfe des Thiolactomycin-Bindemodus ein Pharmakophor-Modell erstellt. In diesem wurden die essentielle Wasserstoffbrücke zwischen den Histidinen und dem Carbonyl-Sauerstoff des Thiolactonrings, zwei hydrophobe Bereiche und ein verbindendes Strukturelement definiert und das Volumen des Pharmakophors begrenzt. Das Screening der Datenbank erfolgte mit GOLD4.0 und GOLDscore. Zur Identifizierung der 16 aussichtsreichsten Verbindungen wurden Rescorings mit ChemScore und sfc_score290m durchgeführt, sowie verschiedene physikochemische Deskriptoren und der errechnete Bindungsmodus einbezogen. Ausgewählte Verbindungen des Screenings wurden synthetisiert. Weitere Variationen wurden durch Einführung von Substituenten und Bromierung und Nitrierung der Grundgerüste erhalten. Zur biologischen Testung dieser Verbindungen konnte KasA in M. smegmatis exprimiert werden. Die Reinigung des Proteins erfolgte mittels Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie. Affinitätswerte an KasA konnten mit einem Fluoreszenzassays bestimmt werden, da in jedem KasA-Monomer vier Tryptophane zur intrinsischen Fluoreszenz beitragen. Die Bindung eines Inhibitors in die TLM-Bindetasche führte zum Quenching der Fluoreszenz von KasA und konnte unter Berücksichtigung von Verdünnungs- und inneren Filtereffekten zur Berechnung der Dissoziationskonstante Kd herangezogen werden. Die In-vitro-Untersuchungen der Inhibitoren von KasA zeigten im Vergleich zu TLM eine Verbesserung der Affinität bis zu einem Faktor von 11, die beste Verbindung war das Nitroisatin-Derivat 2l (22.1 µM). Einen Hinweis auf Hemmung des Wachstums von Mykobakterien war für die Verbindungen 2e (5-Nitro-1-phenethyl-2,3-indolindion) und 3a (5,7-Dibrom-1-(4-chlorbenzyl)indolin-2,3-dion) ersichtlich. Die übrigen Verbindungen zeigten keine Aktivität, was dadurch bedingt sein kann, dass sie Substanzen nicht lipophil genug sind (clogP-Werte zwischen 1 und 3), um die mykobakterielle Zellwand zu durchdringen. Analog dem Docking im Rahmen des virtuellen Screenings wurde ein Docking mit GOLD4.0 und GOLDscore für die Substanzbibliothek durchgeführt. Verglichen mit den In-vitro-Affinitäten konnte eine gute Übereinstimmung in der Differenzierung der Substanzklassen gefunden werden. Da kleine Moleküle mit großer biologischer Aktivität zu bevorzugen sind, wurde die „ligand efficiency“, die inhibitorische Potenz unabhängig vom Molekulargewicht, für die Verbindungen berechnet. Für die Substanzbibliothek wurde eine gute Korrelation von „ligand efficiency“ und GOLDscore pro Schweratom erzielt (R2=0.65), beste Substanzgruppen waren monoalkylierte Uracil- und Isatin-Derivate. Der beste Wert wurde für das Isatin-Derivat 1a erzielt. Mit den erarbeiteten theoretischen und experimentellen Ergebnissen und den etablierten Methoden bietet diese Arbeit eine wichtige Grundlage, um erste „hits“ von KasA-Inhibitoren zu neuen Leitstrukturen für Wirkstoffe gegen Mycobakterium tuberculosis zu entwickeln.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Durchführung computergestützter Untersuchungen an den Wildtyp-Kristallstrukturen dieses Enzyms – einerseits zur Suche nach neuen Inhibitoren im Rahmen von virtuellen Screening- (VS-) Studien, andererseits zur Charakterisierung der strukturellen Flexibilität mit Hilfe von Molekulardynamik- (MD-) Simulationen. Für ein erstes VS wurde zunächst eine Datenbank von mehreren Millionen kommerziell erhältlichen Verbindungen mit Arzneistoff-ähnlichen physikochemischen Eigenschaften erstellt. Als Ausgangspunkt der Screening-Studie diente ein Teildatensatz, welcher mit Hilfe eines auf dem nativen Bindemodus des KasA-Inhibitors Thiolactomycin (TLM) beruhenden Pharmakophormodells erhalten wurde. Diese Verbindungen wurden in die Bindetasche von KasA gedockt und die Qualität der erhaltenen Posen in einem Re- und Konsensus-Scoring-Verfahren bewertet. Schließlich wurden 14 Substanzen käuflich erworben und im Rahmen einer Fluoreszenz-Bindungsstudie experimentell getestet. Für sechs Moleküle war gegenüber KasA eine schwache, zu TLM vergleichbare Aktivität zu verzeichnen. Eine zweite VS-Studie befasste sich mit der Bewertung der Bindungsaffinität synthetisch leicht zugänglicher Derivate von GS95, einem gegenüber dem KasA-Wildtyp aktiven Molekül mit einer 1-Benzyluracil-Grundstruktur. Anhand geeigneter Synthesebausteine wurde eine virtuelle Datenbank von insgesamt 16 Derivaten erstellt, welche in die Bindetasche des Enzyms gedockt wurden. Für die vorhergesagten Bindemodi erfolgte dann eine Abschätzung der freien Bindungsenthalpie. Nach einer Bewertung der Orientierungen auf Basis der errechneten ΔG-Werte sowie einer visuellen Analyse wurden schließlich elf Verbindungen synthetisiert und im Fluoreszenz-Experiment getestet, wobei für alle Uracilderivate eine Aktivität zu beobachten war. Die Kd-Werte fallen jedoch ähnlich hoch aus wie bei GS95. Zur Untersuchung der Strukturdynamik des KasA-Wildtyps wurden drei MD-Simulationen des homodimeren Proteins von je 15 ns Länge durchgeführt. Mit Hilfe von 2D-RMSD-Berechnungen und einer hierarchischen Clusteranalyse wurden aus den drei Simulationen insgesamt zehn repräsentative Snapshots entnommen, welche die im Rahmen der Simulationszeit von insgesamt 90 ns produzierte strukturelle Vielfalt der Bindetasche von KasA wiedergeben. Wie die Analysen zeigen, wird ein dualer Charakter hinsichtlich der Flexibilität der unmittelbaren Taschenreste beobachtet. Hierbei zeigt Phe404 eine besonders ausgeprägte strukturelle Vielfalt; diese Beobachtung deckt sich mit der gatekeeper-Rolle der Aminosäure zwischen der Malonyl-Bindetasche und dem Acyl-Bindekanal, welcher für die Unterbringung der wachsenden Fettsäurekette im Enzym während der Katalyse verantwortlich zeichnet. Darüber hinaus erklärt die hohe Flexibilität von Phe404 möglicherweise die recht schwache Bindungsaffinität von TLM gegenüber dem Wildtyp von KasA, da die gatekeeper–Aminosäure nur in der geschlossenen Form einen stabilisierenden Effekt auf den Liganden ausübt. Besondere Bedeutung kommt hierbei einem Wassermolekül zu, welches als eine Art molekularer Schalter für die Flexibilität von Phe404 betrachtet werden kann und somit die Fixierung von TLM in der Bindetasche maßgeblich beeinflusst. Des Weiteren wurden innerhalb der Tasche hohe Besetzungsraten für je ein Wassermolekül identifiziert. Die aus den MD-Simulationen gewonnenen Erkenntnisse wurden anschließend zur Aufstellung von Empfehlungen für das Design neuartiger KasA-Inhibitoren verwendet. Des Weiteren wurde die Dynamik des oben erwähnten Acyl-Bindekanals, welcher sich aus den Aminosäuren 115-147 zusammensetzt, näher charakterisiert. Hierbei wurden die Reste 115-119 und insbesondere Leu116 als zweiter gatekeeper identifiziert, welcher die Öffnung des Acyl-Bindekanals zur Oberfläche des Proteins reguliert und somit eine entscheidende Funktion bei der Unterbringung der langkettigen Fettsäuresubstrate übernimmt. Schließlich wurden zwei repräsentative Bindetaschenkonformationen aus den MD-Simulationen hinsichtlich einer Verwendung in strukturbasierten VS-Studien näher untersucht. Mit Hilfe von hot spot Analysen und unter Berücksichtigung oben genannter Empfehlungen für das Design neuartiger KasA-Inhibitoren wurden verschiedene Pharmakophormodelle erstellt, welche nach Durchsuchung der zu Anfang dieses Kapitels erwähnten virtuellen Moleküldatenbank zwischen 149 und 420 verschiedene hit-Strukturen lieferten. Folglich scheint eine Adressierung der beiden Konformationen durch arzneistoffartige Verbindungen prinzipiell möglich. Unter den erhaltenen Verbindungen herrscht eine hohe strukturelle Vielfalt; außerdem unterscheiden sich diese im Allgemeinen deutlich von den Molekülen aus den vorangegangenen VS Studien, was das Potential der beiden Bindetaschenkonformationen zur Identifizierung von potentiellen KasA-Inhibitoren mit neuartigen Grundstrukturen zum Ausdruck bringt.
Entwicklung, Validierung und Anwendung einer interpretierbaren und alignment-freien 4D-QSAR Methodik
(2006)
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung, Validierung und erfolgreiche Anwendung der interpretierbaren 4D-QSAR Methodik xMaP. Die neue Methode benötigt weder die Auswahl des vermuteten bioaktiven Konformers noch eine Überlagerung der Moleküle im Raum, sie ist also alignment-frei. xMaP ist invariant gegenüber Rotation, Translation und kodiert die Flexibilität der Moleküle. Dadurch wird der Einfluss durch den Benutzer praktisch ausgeschaltet.
Diese Dissertation beschreibt Methoden zur Lösung wichtiger anwendungsorientierter Aspekte des struktur- und ligandbasierten in-silico-Wirkstoffdesigns. Dabei liegt der Fokus auf der Entwicklung chemometrischer Verfahren und der Überprüfung ihrer Leistungsfähigkeit. Die vorgeschlagenen Algorithmen werden mit entsprechenden etablierten Techniken verglichen. Die folgenden Abschnitte fassen die Vorgehensweisen und Resultate in den einzelnen Projektbereichen zusammen. Identifizierung von Outliern. Die Untersuchung eines QSAR-Datensatzes mit dem Ziel der Outlier-Identifizierung wird in der Praxis häufig vernachlässigt. Dabei ist es offensichtlich, daß kein QSAR-Modell auf jede nur denkbare chemische Verbindung anwendbar sein kann. Vielmehr handelt es sich um empirische mathematische Modelle, die nur innerhalb jenes Datenraums Gültigkeit besitzen, der von den Trainingsobjekten aufgespannt wird. Daher ist jedes Modell auf gewisse Grenzen beschränkt, außerhalb derer eine verläßliche Vorhersage unmöglich ist. Die in dieser Arbeit entwickelte Methode ODD dient der Ermittlung dieser Grenzen und damit der Identifizierung von Outliern, also Objekten außerhalb des Anwendungsbereichs des Modells. Ziel der Entwicklung war ein nur auf den unabhängigen Variablen (X-Daten) basierendes Verfahren, das auch auf hochdimensionaleDatensätze anwendbar ist undweitestgehend auf den Eingriff des Benutzers (etwa die Definition von Grenzwerten) verzichtet. Ebenfalls wünschenswert war die Fähigkeit zur Identifikation von Inliern. Eine ausreichend hohe Geschwindigkeit sollte die Einsetzbarkeit im virtuellen Screening gewährleisten. Die Methode mußte der Überprüfung standhalten, den Vorhersagefehler eines Modells bei Vorhandensein extremer Outlier zu reduzieren, gleichzeitig aber unkritische Datensätze unbeeinflußt zu lassen. ODD basiert auf der Beurteilung der euklidischen Distanz eines Testobjekts zu seinem am nächsten benachbarten Trainingsobjekt. Der Schwellenwert für die Betrachtung eines Objekts als Outlier wird dabei aus der Verteilung der Nächster-Nachbar-Distanzen der Trainingsobjekte berechnet. Durch dieses intrinsische Maß ergibt sich die gewünschte Dimensionsunabhängigkeit und vor allem die automatische Anpassung des Grenzwerts an die Charakteristik des Kalibrierdatensatzes ohne Eingriff des Benutzers. Die Validierung zeigt, daß ODD extreme Outlier zuverlässig erkennt und sich gleichzeitig durch eine im Vergleich zu anderen gebräuchlichen Verfahren geringere Anzahl falsch positiver Identifizierungen auszeichnet. Ensemble-Techniken. In einer vergleichenden Studie wurde die Leistungsfähigkeit verschiedener Ensemble-Techniken hinsichtlich ihres Einflusses auf den Vorhersagefehler untersucht. Dazu wurden umfangreiche Simulationen anhand mehrerer realer QSAR-Datensätze durchgeführt. Die Verwendung von Ensembles (d. h. einer Sammlung vielerModelle, diemit geringfügigmanipulierten Varianten des Trainingsdatensatzes kalibriert wurden) wirkt sich im allgemeinen positiv auf den Vorhersagefehler (RMSEP) aus. Diese Reduzierung des RMSEP wurde hier ermittelt und für verschiedenen Ansätze zur Ensemble-Generierung verglichen. Insgesamt betrachtet erwiesen sich die Methoden der konvexen Pseudodaten und des Baggings als die effektivsten Verfahren zur Ensemble-Generierung, da sie den Vorhersagefehler am deutlichsten verbesserten. Die konvexen Pseudodaten wurden erstmalig zur Erzeugung von Ensembles in der QSAR-Analyse eingesetzt; sie werden als neuer Standard zur Reduzierung des RMSEP bei QSAR-Problemen vorgeschlagen, die Regressionsmodelle auf Basis von latenten Variablen verwenden. Darüber hinaus bieten die Studien eine Abschätzung dermit Hilfe von Ensembles zu erzielenden Reduktion des Vorhersagefehlers bei typischen QSAR-Datensätzen. Virtuelles Screening. Beim virtuellen Screening handelt es sich um eine Technik zum Durchsuchen großer (virtueller)Molekülbibliotheken—oftmehrere Millionen Verbindungen — nach den aussichtsreichsten Wirkstoffkandidaten. Dies kann sowohl durch strukturbasierte als auch mit Hilfe ligandbasierter Verfahren geschehen. Es wurden umfangreiche Simulationen anhand sechs verschiedener Targets und einer Bibliothek von mehr als 90 000 Molekülen durchgeführt, um das Potential strukturbasierter (Docking mit FLEXX) und ligandbasierter (Ähnlichkeitssuchemitmehreren Referenzen) Verfahren zu vergleichen. Darüber hinauswurde durch Berechnung von Interaktionsfingerprints eineMöglichkeit geschaffen, die Information der beiden sonst getrennten Herangehensweisen zu kombinieren. Um den Einfluß des Klassifizierungsalgorithmus zu untersuchen, wurden verschiedene statistische Methoden zur Datenauswertung herangezogen. Als Bewertungskriterium für die Leistungsfähigkeit eines Verfahrens diente jeweils die Anzahl der wiedergefundenen aktiven Moleküle in der simulierten Screeningdatenbank. Die Resultate führen zu dem Schluß, daß ligandbasierte Verfahren, die einfacher einzusetzen sind aber mehr a-priori -Information benötigen, dem strukturbasierten virtuellen Screening hinsichtlich der Datenbankanreicherung überlegen sind. Weiterhin konnte gezeigt werden, wie nutzbringend die Zusammenführung von strukturbasierter Information und solcher über das Interaktionsmuster bekanntermaßen aktiver Verbindungen für die Erhöhung der Wiederfindungsrate ist. Bei der Datenanalyse stellte sich heraus, daß im Mittel bestimmte statistische Methoden (minimale euklidische Distanz ED/Min bzw. Tanimoto-Ähnlichkeit der Integer-Fingerprints Int/Min) zu bevorzugen sind. Kovalentes Docking von Cathepsin-Inhibitoren. Die Cysteinproteasen Cathepsin B und L sind interessante pharmakologische Targets. Geeignete Inhibitoren stammen u. a. aus der Strukturklasse der Aziridine. Ein nukleophiler Angriff des Cysteinrests des Enzyms auf den elektrophilen Aziridinring führt hier zur Ausbildung einer kovalenten Ligand-Rezeptor-Bindung. Praktisch alle erhältlichen Dockingprogramme konzentrieren sich jedoch auf nicht-kovalente Ligand-Rezeptor-Interaktionen und lassen kein uneingeschränktes kovalentes Docking zu. Daher wurde für FLEXX ein Dockingprotokoll entworfen, das den entscheidenden nicht-kovalenten Zustand vor Ausbildung der kovalenten Bindung simulieren kann. Auf dieseWeise konnte untersucht werden, ob sich die Reaktionszentren von Ligand und Enzym ausreichend nahe für die Ausbildung einer kovalenten Bindung kommen. Der vorgestellte Ansatz läßt sich leicht auf andere kovalente Ligand-Rezeptor- Systeme übertragen und bietet somit eine breite Anwendbarkeit. Weiterhin wurde die Parametrisierung der in FLEXX vorgesehenen Interaktionsgeometrien an die strukturellen Eigenheiten der zu dockenden Aziridide angepaßt. Diese weisen nämlich formal eine Amidbindung auf, deren geometrische und elektronische Eigenschaften jedoch deutlich von den Werten eines typischen Amids abweichen. Die Ergebnisse der Dockingstudien liefern wertvolle Einblicke für das Verständnis der Selektivität der untersuchten Liganden bezüglich Cathepsin B beziehungsweise L. Umgekehrt erbringt die gute Übereinstimmung der FLEXX-Resultate mit den experimentell bestimmten Inhibitionskonstanten den Nachweis für die Validität des verwendeten Dockingprotokolls.