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Humane neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr invasiver Infektionen durch die humanpathogenen Pilze Candida albicans und Aspergillus fumigatus. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit bestand in einer Charakterisierung der Interaktion beider Pilzspezies mit neutrophilen Granulozyten, mit Fokussierung auf die unterschiedlichen Effektormechanismen dieser Zellen. C. albicans exprimiert eine Reihe von Aspartatproteasen, welche mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind und zu Adhäsion, Gewebeinvasion und Immunevasion beitragen können. In dieser Arbeit wurde die Rolle der Aspartatproteasen Sap1-6, Sap9 und Sap10 in der Interaktion mit neutrophilen Granulozyten analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu anderen Aspartatproteasen, das zelloberflächenassoziierte GPI-verankerte Enzym Sap9 einen maßgeblichen Einfluss auf die Erkennung von C. albicans durch neutrophile Granulozyten hat. SAP9-Expression ist erforderlich, um die gerichtete Motilität (Chemotaxis) neutrophiler Granulozyten zu C. albicans-Keimschläuchen hin zu induzieren. Dieser Prozess stellt eine Grundvoraussetzung zur effektiven Aktivierung neutrophiler Granulozyten darstellt. Die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten kann durch autologe Sekretion des Zytokins IL-8 verstärkt werden. Es konnte jedoch kein Einfluss von SAP9 auf die IL-8 Sekretion beobachtet werden. Allerdings führte die Deletion von SAP9 zu reduzierter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species, ROS) in neutrophilen Granulozyten. Die mit der ROS-Generierung in Verbindung stehende und durch C. albicans induzierte Apoptose neutrophiler Granulozyten war ebenfalls vermindert. In Konfrontationsassays war die Abtötung einer SAP9-Deletionsmutante verglichen mit dem Wildtyp reduziert. Die Degranulation stellt neben der Produktion von ROS einen weiteren wichtigen Effektormechanismus zur Abtötung von Mikroben dar, jedoch verlief die Freisetzung von Elastase ebenso unabhängig von SAP9 wie die durch neutrophile Granulozyten ausgelöste Wachstumsinhibition von Keimschläuchen. Die hier präsentierten Daten verbinden die Aktivität der Protease Sap9, der zuvor bereits eine Rolle in der Immunevasion von C. albicans zugeschrieben wurde, mit der Initiation der protektiven angeborenen Immunität. Wie C. albicans stimuliert auch A. fumigatus die Aktivität der neutrophilen Granulozyten. Microarray- Analysen mit Fokus auf dem Zytokinprofil neutrophiler Granulozyten während der Interaktion mit A. fumigatus-Hyphen offenbarten, dass nur wenige Zytokine im Lauf der Infektion hochreguliert wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Sap-Granulozyten-Interaktion neue molekulare Mechanismen zur Aktivierung dieser Zellen birgt. Zudem brachten die Microarray Analysen die Erkenntnis, dass die de novo-Zytokinsynthese durch A. fumigatus nur geringfügig beeinflusst wird und eine schnelle Abtötung des Pilzes offenbar im Vordergrund steht.
Der ubiquitär vorkommende Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist Haupterreger der invasiven Aspergillose (IA). Diese invasive Pilzinfektion tritt gehäuft bei Patienten mit immunsuppressiver Langzeit-Therapie z. B. nach allogener Stammzelltransplantation zur Prophylaxe und Therapie der Graft-versus-Host-Disease (GvHD) auf. Trotz der in-vitro-Suszeptibilität der Pilze gegenüber verschiedenen Antimykotika ist die Erkrankung in diesem Patientenkollektiv weiterhin mit einer hohen Letalität assoziiert. Neben ihren direkten, antifungalen Eigenschaften wurden durch Antimykotika auch indirekte, modulierende Wirkungen auf die Funktionalität von Immunzellen beschrieben, die damit möglicherweise das therapeutische Ansprechen dieser Erkrankung beeinflussen. Insbesondere neutrophile Granulozyten (PMN) spielen als Teil der angeborenen Immunität durch ihre Vielzahl an Abwehrmechanismen eine essentielle Rolle für die Bekämpfung von invasiven Pilzinfektionen und damit der IA. Von zusätzlicher Bedeutung und bislang kaum untersucht ist das kombinierte Einwirken von Antimykotika und Immunsuppressiva auf die Funktionalität dieser Zellen.
In dieser Arbeit wurde daher in-vitro der Einfluss klinisch eingesetzter Antimykotika zur Therapie der IA (liposomales Amphotericin B bzw. Amphotericin B – Desoxycholat, Voriconazol) auf wichtige Effektorfunktionen humaner neutrophiler Granulozyten nach Exposition gegenüber A. fumigatus untersucht. Im Fokus stand hierbei die Analyse des oxidativen Burst, der Interleukin (IL)-8-Freisetzung, der Bildung von neutrophil extracellular traps (NETs) sowie der Phagozytose-Aktivität dieser Immunzellen. Außerdem wurde der Effekt einer zusätzlichen Gabe klinisch relevanter Immunsuppressiva (Ciclosporin A / Mycophenolat-Mofetil, Prednisolon), die zur Prophylaxe und Therapie der akuten GvHD eingesetzt werden, auf diese vier Funktionen evaluiert.
Zusammenfassend ergaben unsere Analysen keinen Anhalt für eine relevante Beeinflussung des oxidativen Burst, der IL-8-Freisetzung und der Phagozytose-Aktivität neutrophiler Granulozyten durch die untersuchten Antimykotika, insbesondere gegenüber A. fumigatus. Weiterhin wurden in dieser Arbeit keine signifikanten Differenzen zwischen dem Einfluss von liposomalem Amphotericin B und Amphotericin B - Desoxycholat beobachtet. Durch Prednisolon konnten überwiegend bereits bekannte, immunsuppressive Wirkungen auf PMN bestätigt sowie zusätzlich Hinweise auf eine Modulation Antimykotika-vermittelter Immuneffekte durch Immunsuppressiva gewonnen werden. Die kurze Exposition der PMN gegenüber Ciclosporin A / Mycophenolat-Mofetil ergab keine signifikanten Veränderungen der Sekretion von reaktiven Sauerstoffspezies.
Des Weiteren unterstützen unsere Daten Hinweise auf differente Aktivierungsmechanismen von verschiedenen Effektorfunktionen der PMN. Im Gegensatz zu den anderen untersuchten Funktionen konnte in dieser Arbeit eine signifikant verminderte Bildung von NETs durch liposomales Amphotericin B, Amphotericin B - Desoxycholat und auch Voriconazol beobachtet werden. Damit geben unsere Ergebnisse Anlass zu tiefergehenden Analysen des Zusammenspiels von Antimykotika insbesondere mit dem noch immer wenig verstandenen Mechanismus der Auslösung und Bildung von NETs. Zudem wären weitere Studien wünschenswert, um einen umfassenderen Überblick und ein besseres Verständnis auch hinsichtlich anderer invasiver Pilzinfektionen sowie weiterer Abwehrmechanismen zu erhalten.
Der humanpathogene Schimmelpilz A. fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ein hohes Risiko eines letalen Krankheitsverlaufs durch das Auslösen einer invasiven Aspergillose (IA) birgt. Bei der IA handelt es sich um eine Infektion des Lungengewebes, welche hauptsächlich immunsupprimierte Menschen befällt. A. fumigatus stellt die Ursache für diese infektiöse Komplikation dar, welche von einem intakten Immunsystem in der Regel problemlos abgewehrt wird. Eine wichtige Abwehrbarriere gegen den Pilz setzt sich aus Zellen des angeborenen Immunsystems zusammen. In der vorliegenden Arbeit waren in diesem Zusammenhang natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und dendritische Zellen (DCs) von besonderer Relevanz. NK- Zellen schütten lösliche Faktoren aus, welche als antifungale Mediatoren agieren. DCs besitzen hingegen die Fähigkeit, Pilzmorphologien zu phagozytieren. Im Anschluss an die Interaktion mit dem Pilz sekretieren beide Zelltypen Zytokine, welche wiederum weitere Immunzellen stimulieren. Besonders den DCs wird eine wichtige Funktion in der Immunabwehr gegen A. fumigatus zugeschrieben, da ihre Fähigkeit, das angeborene mit dem adaptiven Immunsystem zu verknüpfen, von großer Bedeutung ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktionen von primären Monozyten abgeleiteten DCs (moDCs) und NK-Zellen mit dem Pilz A. fumigatus in vitro zu charakterisieren. Hierfür wurden mit der Methode des Live-imaging verschiedene Experimente durchgeführt, um den reziproken Einfluss der zwei Immunzellarten in Anwesenheit von A. fumigatus zu analysieren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl moDCs, als auch NK-Zellen mit dem Pilz interagieren. Neben NK-Zell-moDC-Interaktionen wurden auch Interaktionen mit den einzelnen Immunzelltypen und A. fumigatus beobachtet. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die NK-Effektormoleküle IFN-ɣ, Granzym B und Perforin stimulierend auf moDCs wirken, was in einer erhöhten Zellaktivierung und einer in der Folge gesteigerten Kontaktanzahl zum Pilz resultierte.
Die invasive Aspergillose stellt eine ersthafte Erkrankung sowie auch eine signifikante Ursache von Morbidität und Mortalität bei verschiedenen Patientengruppen dar. Dabei tritt sie hauptsächlich durch den opportunistischen Pathogen Aspergillus fumigatus hervorgerufen mit einer Inzidenz von 4% bis 15% vorwiegend bei immunsupprimierten Patienten nach allogenen hämatopoetischer Stammzelltransplantationen (HSCT) oder Organtransplantationen auf und führt bei 40% bis 90% der Fälle zum Tod des Patienten. Die Behandlung dieser Hochrisikogruppe erfolgt bestenfalls mit Antimykotika prophylaktisch, denn eine schnelle sowie auch verlässliche Diagnose von invasiver Aspergillose läßt sich aufgrund der hohen zeitlichen Latenz des Pilzes und dem Defizit an Sensitivität bzw. Spezifität in vielen Fällen nicht ermitteln. Zusätzlich steigt die Zahl der Resistenzen von Aspergillus-Stämmen gegen die verschiedenen Antimykotika stetig an, so dass klinische und ökonomische Nebenwirkungen unvermeidbar sind. Als Alternative zur konventionellen Behandlung mit Azolen stellt eine Immuntherapie mittels Antigen-behandelten dendritischen Zellen (DCs) dar, welche durch Präsentation von Aspergillus fumigatus-Antigenepitopen eine spezifische ex vivo T-Zellenexpansion von allogenen CD8+CD3+ T-Zellen bewirken kann und damit ein schonenderes Mittel für den Patienten ist. Dazu wurden sieben verschiedene rekombinante Proteine aus A. fumigatus in dieser Arbeit charakterisiert und deren Potential ermittelt, bei DCs eine pro-inflammatische Immunantwort auszulösen. Es stellte sich heraus, dass sowohl die Ribonuklease Mitogillin (Aspf1) als auch die myceliale Katalase Cat1 in der Lage waren, den nukleären Faktor kappa B (NFκB) zu aktivieren und eine Translokation der Untereinheit p65 in den Nukleus zu induzieren, woraufhin Gene von pro-inflammatorischen Zytokine und Chemokine sowie auch von Aktivierungs- und Reifungsmarker der DCs exprimiert wurden. Im Gegensatz zum Aspf1, war es beim Cat1 zusätzlich auch möglich gewesen eine Verifizierung auf Proteinebene für segregierte Zytokine und Chemokine bzw. Oberflächenmarker zu erhalten. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass die Zytotoxizität von Cat1 entsprechend der unbehandelten Zellen gewesen ist und dass es den Cat1-behandelten moDCs gelang nach der Aufnahme des Antigens und dessen Prozessierung durch die darauffolgende Präsentation der Proteinepitope über den MHC II Komplex eine ex vivo-Aktivierung von autologen zytotoxischen T-Zellen zu erreichen. Damit ist nun ein potentieller Kandidat für eine auf Immuneffektorzellen basierte Immuntherapie gegen invasive Aspergillose für immungeschwächte Patienten gefunden. Ergänzt wurde diese Arbeit mit der experimentellen Untersuchung von Hämostase während einer invasiven Aspergillose, da gehäuft pathologische Beobachtungen von lokalen Einblutungen bei Patienten mit pulmonaler Aspergillose verzeichnet wurden. Es stellte sich heraus, dass die durch Collagen induzierte Aggregation sich durch aktive Pilzmorphologien beeinträchtigen läßt, wohingegen die untersuchten Gerinnungsparameter nicht betroffen gewesen sind. Dies verdeutlicht neben der bereits bekannten Bedeutung der Thrombozyten als antimikrobielle Komponente im Blut nun auch ihrer Empfindlichkeit gegenüber sezernierten oder Zellwand-gebundenen Aspergillus fumigatus-Faktoren während der invasiven Aspergillose.
Als Hämostase bezeichnet man die Gesamtheit der Reaktionen, die zu einer effektiven Blutgerinnung beitragen. Sie lässt sich in die primäre (thrombozytäre) Hämostase, in die sekundäre (plasmatische) Hämostase und in das Fibrinolysesystem einteilen. Thrombozyten, oder auch Plättchen genannt, spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Sie binden an die durch eine Verletzung einer Blutgefäßwand freigelegten Faktoren, werden so aktiviert und aggregieren mit weiteren Thrombozyten, wodurch ein Thrombus entsteht, der die Verletzung verschließt. Zudem besitzen Thrombozyten Immunokompetenz und können mit anderen Immunzellen interagieren, über Rezeptoren Pathogene erkennen und sie direkt angreifen. Einer dieser Pathogene ist der opportunistische Pilz Aspergillus fumigatus. Dieser bildet im Verlauf seines Lebenszyklus 2,5 -3 µm kleine Konidien aus, die mit dem Wind verbreitet werden und bis tief in die Alveolen der menschlichen Lunge eingeatmet werden können. Während diese Konidien im gesunden Menschen durch das Immunsystem und andere Abwehrmechanismen eliminiert werden, können sie im immunsupprimierten Patienten, z. B. bei Patienten nach einer hämatopoietischen Stammzelltransplantation, auskeimen und verschiedene Krankheiten, sogenannte Aspergillosen, auslösen mit der Invasiven Aspergillose (IA) als schwerwiegendste Form. Diese ist assoziiert mit Gewebezerstörungen, Blutungen und Thrombenbildung am Ort der Infektion. Diese Komplikationen könnten auf einer überhöhten Immunantwort des Wirtes, auf dem mechanischen Eindringen des Pilzes in das Gewebe und die Blutgefäße oder auf einer Änderung der lokalen Hämostase durch sezernierte hydrolytische Enzyme (Proteasen) oder Sekundärmetabolite von A. fumigatus beruhen.
Um diese Änderung der Hämostase im Verlauf einer IA zu analysieren, wurde der Einfluss von Morphologien (Konidien, geschwollene Konidien, Keimschläuche und Hyphen), deren Überstände, sowie von proteolytisch aktivem Überstand und von verschiedenen Sekundärmetaboliten von A. fumigatus auf die sekundäre Hämostase und die Aggregation und Aktivität von humanen Thrombozyten untersucht. Bei der Analyse der sekundären Hämostase konnte für keinen dieser eingesetzten Effektoren ein Einfluss festgestellt werden. Bei der Analyse der primären Hämostase und dem Einsatz von Morphologien und ihrer Überstände konnte für Hyphen und ihren ankonzentrierten Überstand eine aggregationssteigernde Wirkung auf Thrombozyten beobachtet werden, die möglicherweise auf Bestandteile der Zellwand von A. fumigatus, wie z. B. β-Galactosaminogalactan (GAG) zurückzuführen ist. Proteolytisch aktiver Überstand führte zu einer Aktivierung der Thrombozyten, die zum Teil auf die PrtT-abhängige proteolytische Spaltung und damit die Aktivierung der Thrombinrezeptoren PAR1 und/oder PAR4 auf der Thrombozytenoberfläche, zum Teil aber auch auf GAG zurückzuführen sein kann. Von den hier verwendeten Mykotoxinen Gliotoxin, Fumagillin, Citrinin, Verruculogen und Deoxynivalenol konnte für Gliotoxin ein negativer Einfluss auf die Thrombozytenaktivität nachgewiesen werden. Dieses Toxin inhibierte die Aggregation und die Aktivität der Thrombozyten, möglicherweise durch die Bildung von Disulfid-Brückenbindungen oder auch durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Zudem wurde im Verlauf dieser Arbeit eine direkte Interaktion von Gliotoxin mit den ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 sowie mit dem Integrin αIIbβ3 postuliert, die so zwar nicht bestätigt, aber auch nicht vollständig wiederlegt werden konnte.
Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich zwei Wirkungen von A. fumigatus auf humane Thrombozyten: zum einen eine Aktivierung oder auch verstärkte Aggregation durch sezernierte Proteasen oder Zellwandbestandteile, zum anderen eine Hemmung durch Gliotoxin, was die bei einer IA beobachtete Thrombenbildung sowie die Blutungen erklären kann. Die Interaktion der aktivierten Thrombozyten mit den Zellen des Immunsystems sowie die zytotoxischen Eigenschaften von Gliotoxin könnten zudem für die beobachtete Gewebezerstörung verantwortlich sein. Dennoch ist weitere Forschung in diesem Gebiet unabdingbar, um die pathophysiologische Änderung der lokalen Hämostase durch A. fumigatus und seine Wirkung auf humane Thrombozyten besser zu verstehen und so eine schnellere Erkennung und Behandlung von Aspergillosen zu ermöglichen.
Der Schimmelpilz Aspergillus (A.) fumigatus stellt den häufigsten Erreger der invasiven Aspergillose (IA) dar, die vor allem bei immunsupprimierten Patienten auftritt. Unter den unspezifischen klinischen Symptomen dieser Erkrankung ist Fieber das häufigste. Dennoch wurden physiologische Aspekte wie eine erhöhte Körpertemperatur in Arbei-ten zur Interaktion menschlicher Immunzellen mit A. fumigatus bisher nicht berück-sichtigt. Zahlreiche Studien konnten den Einfluss einer erhöhten Temperatur auf den Verlauf von Infektionserkrankungen in vivo sowie auf die Funktionen verschiedener Immunzellen – einschließlich dendritischer Zellen (DCs) – in vitro zeigen. DCs spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr gegenüber A. fumigatus, ihre besondere Be-deutung liegt in der Verknüpfung der angeborenen mit der erworben Immunantwort.
Ziel dieser Arbeit war die in vitro Analyse des Einflusses einer erhöhten Temperatur auf die Immunantwort humaner DCs gegenüber A. fumigatus. Dazu wurden DCs mit A. fumigatus oder Zymosan, einem ß-1,3-Glucan, bei Normo- (37 °C) und Hyperthermie (40 °C) für bis zu 24 h inkubiert und spezifische DC-Funktionen charakterisiert. Hierbei tolerierten DCs die Inkubation und Stimulation unter Hyperthermie ohne signifikanten Viabilitätsverlust. Die Zytokinexpression und -sekretion durch A. fumigatus-Stimulation wurde durch Hyperthermie nicht signifikant verändert. Die Fähigkeit zur Aufnahme von A. fumigatus-Konidien wurde durch eine kurzzeitige (1 h) Hyperthermie nicht beein-flusst, längerfristige (24 h) Hyperthermie reduzierte diese Fähigkeit jedoch signifikant. Ebenso bestand unter Hyperthermie eine verstärkte Expression von CD86 und HLA-DR auf unstimulierten DCs sowie von CD80, CD86 und HLA-DR auf stimulierten DCs.
Die reduzierte Aufnahmekapazität für A. fumigatus-Konidien und die verstärkte
Expression der kostimulatorischen Moleküle unter Hyperthermie zeigten, dass Hyper-thermie in vitro einen reiferen Phänotyp unstimulierter DCs bewirkt sowie die DC-Reifung durch A. fumigatus-Stimulation verstärken kann. Diese reiferen DCs könnten zu einer verbesserten T-Zell-Aktivierung und Abwehr von A. fumigatus und zu einem verbesserten Outcome der IA beitragen. Außerdem könnte Hyperthermie als Adjuvans zur in vitro Generierung A. fumigatus-spezifischer DCs eingesetzt werden.
Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitär vorkommender Schimmelpilz, dessen Sporen vom Menschen täglich zu hunderten mit der Atemluft aufgenommen werden. Aufgrund ihrer geringen Größe gelangen die Konidien leicht bis in die Alveolen der Lunge, wo sie normalerweise sofort vom angeborenen Immunsystem beseitigt werden. Immunsupprimierte Menschen leiden an einer qualitativen oder quantitativen Einschränkung dieses Teiles der Immunabwehr, weshalb die Inokulation der Sporen bei ihnen zur Auslösung der lebensgefährlichen Invasiven Aspergillose führen kann, deren Mortalität in der Hochrisikogruppe der Patienten nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation über 90% beträgt. Bei diesen Patienten gewinnt die adaptive Immunabwehr an Bedeutung. Dendritische Zellen gehören dem angeborenen Immunsystem an und besitzen einzigartige Fähigkeiten zur Aktivierung und Steuerung der erworbenen Immunabwehr. Durch die Aktivierung naiver T-Zelen und die Sekretion bestimmter immunmodulatorischer Zytokine bestimmen sie die Art der konsekutiv asugelösten T-Helferzellantwort. Lediglich eine T-Helfer 1-Zellantwort wird hierbei mit einer erhöhten Resistenz gegenüber der invasiven Aspergillose in Verbindung gebracht. Die Zytokinsekretion der Dendritischen Zellen wird durch intrazelluläre Signalkaskaden reguliert, welche sich an ihre PRRs anschließen. Für die Erkennung des bakteriellen LPS durch den TLR wurde die Regulation der immunmodulatorischen Zytokine durch die Serin-Threonin-Kinase GSK3 festgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob es bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen ebenfalls einen Zusammenhang mit GSK3 und der Sekretion immunmodulatorischer Zytokine gibt. Dafür wurden aus humanen Monozyten generierte dendritische Zellen mit rekombinanten Antigenen von Aspergillus fumigatus sowie verschiedenen Morphologien stiumuliert und teilweise mit dem GSK3-Inhibitor LiCl gehemmt. Anschließend wurde die Expression bestimmter immunmodulatorischer Zytokine und der GSK3 mittels quantitativer real-time RT-PCR bestimmt. Hierbei konnte für eines der getesteten Antigene, Aspf 1, ein deutlicher Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen festgestellt werden. Ein paralleler Anstieg der Expression proinflammatorischer Zytokine erhärtete die Annahme einer immunregulierenden Rolle der GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus. Einen deutlicheren Hinweis auf den Zusammenhang zwischen der Aktivität der GSK3 und der Expression proinflammatorischer Zytokine erbrachte die Inhibierung mittels LiCl. Die mit Aspergillus fumigatus stimulierten Zellen reagierten hierauf im Vergleich zu den nicht-inhibierten Zellen mit einer Reduktion der IL12p35-Expression um 86,1% sowie mit einer Reduktion der IL23-Expression um 49,5%. Der letzte Teil der Experimente sollte ausgehend von der Vorstellung, dass verschiedene Aspergillus-Morphologien von unterschiedlichen Rezeptoren erkannt werden quantitative Unterschiede der GSK3-Beteiligung bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch dendritische Zellen zeigen. Obwohl alle Morphologien des Schimmelpilzes einen Einfluss auf die GSK3-Expression der Zellen zeigten, konnten hierbei keine einheitlichen quantitativen Unterschiede festgestellt werden. Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit die Beteiligung von GSK3 bei der Erkennung von Aspergillus fumigatus durch humane dendritische Zellen gezeigt werden. Außerdem konnten Hinweise auf eine immunregulierende Rolle der GSK3 bei der Abwehr des fakultativ pathogenen Schimmelpilzes erbracht werden, wobei die genaue Einbindung der Serin-Threonin-Kinase in dieser Situation noch unklar ist und weitere Experimente erforderlich macht.
Bereits in Vorstudien konnte dargelegt werden, dass eine signifikante Korrelation zwischen der T-Zell-Zytokin-Antwort und der berufs- bzw. umweltbedingten Schimmelpilzbelastung besteht. Ziel der vorliegenden Studie war, eine mögliche Kombination von Biomarkern ausfindig zu machen, die veränderte T-Zell-Antworten auf A. fumigatus- Antigene bei beruflich Exponierten im Vergleich zu Kontrollprobanden/-innen vorhersagen kann. Um geeignete Marker für das Bio-Monitoring zu finden, wurden zur T-Zell-Aktivierung ein myzeliales A. fumigatus - Lysat und 12 proteinogene Antigene in ELISpot-Versuchen für die Signaturzytokine IFN-γ (TH1), IL-5 (TH2) und IL-17A (TH17) der Haupt-TH-Subpopulationen getestet.
Es zeigten sich bei den Biolandwirten/-innen erwartungsgemäß erhöhte TH1- und TH2-Antworten auf die Mehrzahl der verwendeten spezifischen A. fumigatus-Antigene, die möglicherweise eine Schimmelpilzbelastung serologisch nachweisbar machen. Insbesondere die spezifischen A. fumigatus-Antigene Aspf22, CatB und CipC konnten eine Trennschärfe zwischen den beiden Kohorten hinsichtlich ihrer IFN-γ- und IL-5-Zytokinantwort erzielen. Unterschiede in der TH17-Antwort aufgrund chronischer beruflicher Sporenbelastung ohne Krankheitskorrelat konnten nicht explizit festgestellt werden. Weiterhin ergab sich, dass erhöhte TH2-Immunreaktionen, sofern sie mit einer adäquaten TH1-gerichteten Immunantwort einhergehen und damit eine ausgeglichene TH2/TH1-Balance besteht, nicht zwangsläufig zu Hypersensitivitätserkrankungen führen. Im Vergleich zu Langzeitexponierten wurden teilweise überlappende TH-Zellfrequenzen bei beruflich exponierten Biolandwirten/-innen ermittelt. Welche entscheidende Rolle Treg-Zellen bei der Eindämmung überschießender Immunantworten einnehmen, kann hieraus erahnt werden.
Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion von moDCs und T-Zellen mit \(Aspergillus\) \(fumigatus\)
(2021)
Die invasive Aspergillose ist eine gefürchtete Erkrankung besonderes bei immunsupprimierten Patienten, die eine Stammzelltransplanation erhalten sollen. Diese Patienten leiden in der Regel an einer hämatologischen Grunderkrankung wie einer Leukämie oder einem Lymphom. Das Prinzip der Stammzelltransplanatation ist es, das kranke Knochenmark mittels Chemotherapie und Bestrahlung zu zerstören und es dann mit gesunden Stammzellen zu ersetzen. Während dieser Konditionierung ist der Patient also ohne eigene Abwehrzellen. In dieser Phase gestaltet sich die rechtzeitige Diagnose häufig als schwierig, weil die konventionellen Diagnosemethoden von der Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten abhängen. Häufig ist die Infektion bei der Entwicklung von unspezifischen Symptomen wie Fieber oder Dyspnoe schon weit fortgeschritten. Hat sich der Pilz in der Lunge ausgebreitet, so kommt es zur Ausbildung einer Hypoxie und im Verlauf auch zu einer Hypoxämie aufgrund einer Diffusionsstörung in den entzündeten Lungenabschnitten.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von Hypoxie auf die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen besser zu verstehen. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunabwehr von Pilzinfektion und bilden das Verbindungsstück zwischen angeborenen und erworbenen Immunsystem. T-Zellen übernehmen ebenfalls wichtige Aufgaben bei der Abwehr von Pilzinfektionen, indem sie Interferon gamma produzieren. Zudem sollte die Funktion verschiedener Botenstoffe in Signalkaskaden näher untersucht werden.
Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion von dendritischen Zellen mit Aspergillus fumigatus unter Hypoxie, die dendritischen Zellen anschließend unter Normoxie dazu befähigt, eine verstärkte adaptive Immunantwort hervorzurufen. Hypoxie könnte somit als zusätzlicher Faktor verwendet werden, um dendritische Zellen als effektive Adjuvantien in einer Impfung gegen Aspergillus fumigatus zu verwenden. Ursächlich für die verstärkte Fähigkeit naive T-Zellen zu aktivieren, scheint zum einen die Apoptose und zum anderen eine verstärkte Produktion von Interleukin 12p70 zu sein.
In den letzten Jahren ist die Zahl immunsupprimierter Patienten aufgrund des stetigen Fortschritts in der Medizin stark angestiegen. Die bei diesen Patienten wegen ihrer hohen Mortalität gefürchtete, durch A. fumigatus ausgelöste invasive Aspergillose (IA) hat trotz der Anwendung verbesserter Antimykotika zugenommen. Die beiden Medikamente Mycophenolat (MPA) und Everolimus (RAD) werden zur Immunsuppression verwendet. Sie wirken durch die Inhibition von B- und T-Zellen. Allerdings wurde auch der direkte Einfluss auf DCs beschrieben. Diese Entdeckung ist insofern von Relevanz, als DCs eine wichtige regulatorische Rolle bei der Abwehr von Erregern, so auch von Pilzen, spielen und als Bindeglied zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem fungieren. DCs sind außerdem in den vergangenen Jahren in den Fokus der Wissenschaft geraten, da sie möglicherweise als Impfstoffe gegen verschiedenste Krankheiten, darunter auch die IA, eingesetzt werden können. Da die IA vor allem Patienten mit geschwächtem Immunsystem trifft, ist es von Bedeutung, die Wirkung von Immunsuppressiva auf DCs besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von MPA und RAD auf die Entwicklung, die Reifung und die Immunantwort von aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) nach Kontakt mit A. fumigatus untersucht. Hierzu wurden die Medikamente zu verschiedenen Zeitpunkten der DC-Entwicklung hinzugefügt. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem der Entwicklungsprozess der DCs beeinträchtigt wird. Neben einer verminderten Zytokinexpression von DCs nach Kontakt mit A. fumigatus wurde auch eine Veränderung der Oberflächenmarkerstruktur sowohl bei unreifen DCs (iDC) als auch bei reifen DCs (mDC) festgestellt. Des Weiteren wurde die Fähigkeit von DCs zur Phagozytose durch die Medikamente vermindert. Beide Substanzen, vor allem aber RAD, zeigten zudem eine starke Zytotoxizität gegenüber den Zellen. Es konnte in dieser Arbeit deutlich gemacht werden, dass sowohl MPA als auch RAD die Entwicklung und Reifung von moDCs beeinflussen, was zu einer Beeinträchtigung ihrer Immunantwort gegen A. fumigatus führt.