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Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung des Modells „Ratte-anti-Schwein“ zur xenogenen Transplantation mikroverkapselter Langerhans-Inseln. Funktionelle und histologische Analysen geben Auskunft über das Schicksal der Inselzell-Transplantate in den diabetischen Ratten. Isolierung, Kultivierung und die Mikroverkapselung der porzinen Langerhans-Inseln mit hochreinen Alginaten erfolgen in der eigenen Arbeitsgruppe. 8-12 Wochen alte, männliche Wistar Ratten wurden mittels Streptozotozin (STZ) diabetisiert und erhielten mikroverkapselte porzine Langerhans-Inseln unter die linke Nierenkapsel und intraperitoneal. Weder vor noch nach Transplantation erfolgte eine medikamentöse Immunsuppression. Zur Beurteilung des metabolischen Verlaufes wurden nach Transplantation regelmässig Blutzuckerwerte und Gewicht bei den Empfängertieren bestimmt. Zusätzlich erfolgte der orale Glukose-Toleranztest. Zur histologischen und immunhistochemischen Beurteilung wurden Leber, Pankreas, beide Nieren, Magen, Dünndarm, Dickdarm, Omentum, Mesenterium, sowie intra-peritoneal verbliebene Mikrokapseln explantiert. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1.In-Vitro-Funktionsanalysen porziner Langerhans Inseln zeigten, dass diese nach Glukose-Stimulation Insulin reguliert freisetzen. Eine Langzeitkultur der Inseln wirkt sich nachteilig auf die Inselfunktion aus. Durch Zugabe von Nicotinamid zum Kulturmedium kann die Inselfunktion restauriert und somit eine Verbesserung der Inselvitalität erzielt werden. Nach der Isolierung der porzinen Langerhans-Inseln erfolgte deren 1-2 tägige Kultivierung unter sterilen Bedingungen und unter Zusatz von Nicotinamid zum Kulturmedium. Sodann wurden die porzinen Langerhans-Inseln mit hochreinem Barium-Alginat mikro-verkapselt und erneut für 24 Stunden steril in selbigem Medium kultiviert. Kurz vor der Transplantation wurde eine weitere Vitalitätsprüfung der mikroverkapselten Langerhans-Inseln durchgeführt. So wurde gewährleistet, dass nur ausreichend vitale Transplantate übertragen wurden. 2.Um die Sicherheit der STZ-Behandlung zur Diabetesinduktion einschätzen zu können, wurde eine Kontrollgruppe von Wistar Ratten mit STZ behandelt und sodann deren Blutzucker- und Gewichtsverläufe über mehrere Tage, in einem Fall sogar bis zu 75 Tagen dokumentiert. Bei keinem Tier kam es zu einer spontanen Normalisierung der Blutzucker- und Gewichtswerte. Mittels immunhistochemischer Insulinfärbung am Pankreas dieser Tiere wurden keine restliche Insulin-positive Zellen identifiziert. Damit war sichergestellt, dass STZ einen stabilen Diabetes induziert. 3.Die Transplantation mikroverkapselter Langerhans-Inseln führte bei Empfängertieren zu Normoglykämien unterschiedlicher Dauer. Bereits 24 Stunden nach erfolgreicher Trans-plantation zeigten die Empfängertiere in der Regel physiologische Blutzuckerwerte. Die typischen Symptome des Diabetes mellitus, wie Polyurie und Polydipsie wurden nicht mehr beobachtet und es konnte in der folgenden Zeit eine deutliche Gewichtszunahme verzeichnet werden. Bei einigen Empfängertieren kam es nach Transplantation der mikroverkapselten Langerhans-Inseln nicht zur Normoglykämie. Drei Gruppen kristallisierten sich heraus: (a) Empfängertiere mit primärer Non-Funktion des Transplantates, (b) Em-fängertiere mit Transplantat-Kurzzeitfunktion (Transplantat-Funktion bis zu 20 Tagen) und (c) Empfängertiere mit Transplantat-Langzeitfunktion (Transplantat-Funktion mehr als 20 Tage und bis zu mehr als 500 Tagen). Im Vergleich dazu wurden auch Wistar Ratten mit unverkapselten porzinen Langerhans-Inseln transplantiert. Hier zeigte sich stets eine fehlende bzw. nur wenige Tage andauernde Transplantatfunktion. Bei erfolgreich transplantierten Empfängertieren mündete die orale Glukosebelastung in einer physiologischen Blutzuckerregulation. Diese unterschied sich nicht von jener gesunder Kontrolltiere. 4.Nach dem Versagen der Transplantatfunktion erfolgten Organentnahmen und makroskopische Inspektionen: Sie zeigten die Unversehrtheit der abdominellen Organe und die Unversehrtheit der transplantierten Mikrokapseln. Die Mikrokapseln waren in nahezu allen Fällen stark kapillarisiert. Die histologischen Untersuchungen der explantierten Mikro-kapseln zeigten unterschiedlich stark ausgeprägte Fibrosierungen der Mikrokapseln, sowie Infiltrationen von CD4+ und CD8+ T-Zellen, Makrophagen, Granulozyten, NK-Zellen und Fibroblasten im interkapsulären Spalt. Insulinfärbungen der Pankreata der Empfängertiere zeigten nur wenige bzw. keine Insulin-positiven Zellen, was einerseits die zuverlässige Wirkung des STZ bestätigt, andererseits für die Wirkung des transplantierten Gewebes spricht. 5.Die Implantation leerer Alginat-Mikrokapseln für bis zu 250 Tage und deren anschliessende histologische Untersuchung zeigte, dass hier keine Fibrosierungen und nur ein ge-ringer Besatz mit Empfängerzellen stattfindet – im Gegensatz zu Mirokapseln, die porzine Langerhans-Inseln enthalten. Damit konnte gezeigt werden, dass das Kapselmaterial per se biokompatibel ist. Die Transplantation von Langerhans-Inseln stellt eine attraktive Möglichkeit der Therapie des Typ I Diabetes mellitus dar. Durch Mikoverkapselung des Gewebes kann dieses vom Emp-fänger-Immunsystem abgeschirmt werden und so kann auf die herkömmliche Immunsuppressiva nach Transplantation verzichtet werden. Die xenogene Transplantation von Langerhans-Inseln des Schweins bietet zudem die Möglichkeit, den gravierenden Mangel an menschlichen Spenderorganen zu überwinden. Die verbesserte Isolierung der porzinen Inseln ist ein wesent-licher Beitrag zu diesem Transplantations-Konzept. Im experimentellen Rattenmodell konnte gezeigt werden, dass nach Transplantation mikroverkapselter porziner Langerhans-Inseln eine dauerhafte Normalisierung der Blutzuckerwerte möglich ist. Weitere Untersuchungen müssen nun dazu beitragen, die Transplantation der xenogenen Langerhans-Inseln noch effizienter zu machen, damit sich dieses Verfahren in Zukunft zu einer leicht zu handhabenden und sicheren Therapieoption für Typ I Diabetiker entwickeln kann.
Diabetes mellitus ist die häufigste endokrine Störung des Glukosestoffwechsels und betrifft einen großen Teil der Bevölkerung. Der progressive Verlauf der Erkrankung führt zu schweren Sekundärschäden und schränkt die Lebensqualität der Betroffenen deutlich ein. Als einzige kausale Therapiemöglichkeiten stehen bislang nur die Pankreas- und Inseltransplantation zur Verfügung. Der Mangel an Spenderorganen und die erforderliche lebenslange Immunsuppression schränken die weite Verfügbarkeit dieser Behandlung für die überwiegende Anzahl der Diabetiker stark ein. Daher ist es sehr wichtig, neue Therapiestrategien des Diabetes mellitus zu entwickeln. Hierbei ist die Weiterentwicklung der Zelltherapie von zentraler Bedeutung, um durch Differenzierung und Expansion insulinproduzierender Zellen den Mangel an Zellen zur Transplantation zu überwinden. In dieser Arbeit wurde eine Analyse der Expression des proliferationsassoziierten Proteins P8 in Betazellen des endokrinen Pankreas durchgeführt. Es konnte eine spezifische Genexpression von P8 in Betazellen und duktalen Vorläuferzellen des endokrinen Pankreas nachgewiesen werden. Durch die Etablierung eines spezifischen Antiserums wurde P8 im Zellkern der Betazellen lokalisiert. Expressionsanalysen zeigten im Folgenden eine positive Regulation der P8-mRNA-Expression durch Glukose als bekannten Stimulus für die Insulinsekretion und Betazellreplikation. Gleiches wurde für das Inkretinhormon GLP-1, das die Genexpression von bedeutsamen Transkriptionsfaktoren für die Betazellproliferation und -differenzierung induziert, in Betazellen als auch deren Vorläuferzellen nachgewiesen. Anhand von Transfektionsexperimenten und Funktionsuntersuchungen mittels ELISA konnte eine Dedifferenzierung der Betazellen durch eine Überexpression des potentiell proliferationsinduzierenden Proteins P8 ausgeschlossen werden. Hierbei wurden betazellspezifische Differenzierungsmarker, PDX-1 und Proinsulin, sowie die Fähigkeit der Betazellen, Insulin zu produzieren, während einer Überexpression von P8 analysiert. Zusammenfassend wurde ein proliferationsassoziiertes Protein, das als möglicher Transkriptionsfaktor in Betazellen des endokrinen Pankreas fungieren könnte, näher charakterisiert, um damit neue Aspekte zur Expansion von Betazellen unter Erhalt ihrer Funktion im Rahmen der Zelltherapie beizutragen.
Die Betazellmasse wird durch Apoptose, Proliferation und Neogenese aus Vorläuferzellen an den Bedarf des Organismus angepasst. Fehlregulationen und Verlust der Anpassungsfähigkeit sind Ursachen für Diabetes mellitus Typ-2. IDX-1 ist sowohl ein Hauptentwicklungsfaktor des embryonalen Pankreas als auch an der Regulation von Neogenese und Proliferation der adulten Betazellen beteiligt. Betazellproliferation und Differenzierung werden durch Faktoren wie GLP-1 oder milde Hyperglykämie stimuliert und gehen mit einer Aktivierung von IDX-1 einher. In der Arbeit sollte der Einfluss von GLP-1 und milder Hyperglykämie auf die Expression, besonders die Transkription, des Transkriptionsfaktors IDX-1 in insulinproduzierenden Betazellen des endokrinen Pankreas untersucht werden. Ferner wurde eine mögliche Autoregulation des IDX-1 Promotors durch IDX-1 untersucht. Als Modell für adulte Betazellen wurden klonale Betazellen INS-1 und MIN6 verwendet. Die IDX-1 Expression wurde auf mRNA Ebene im Northern Blot und auf Proteinebene mittels Western Blot untersucht. Der Promotor des IDX-1 Gens wurde Mithilfe von Luziferasereportergenassays und EMSA untersucht. Die Expression von IDX-1 Protein und mRNA wird durch milde Hyperglykämie stimuliert. Dieser Effekt ist auf eine Aktivierung des IDX-1 Promotors zurückzuführen. Die Aktivierung innerhalb des Promotors konnte auf zwei Regionen eingeschränkt werden. Diese befinden sich im IDX Promotor in den -900 bp bis -300 bp und den 230 bp vor Beginn der kodierenden Sequenz des IDX-1 Gens. Im EMSA konnte ein glukoseabhängiger Komplex (-49 bp bis -44 bp) nachgewiesen werden, an den USF-1 und USF-2 binden. USFs sind für glukoseabhängige Genregulation in Leber und Pankreas bekannt. Eine Mutation der Bindungsstelle führte zum Verlust des Bindungskomplexes. In Luziferasereportergenassays beobachtete man eine Verringerung der glukoseinduzierten Aktivierung. Für GLP-1 konnte kein eindeutiger Einfluss auf die Expression von IDX-1 gezeigt werden. Als Anzeichen für eine mögliche Autoregulation des IDX-1 Promotors durch IDX-1 wurde bei Überexpression von IDX-1 in Betazellen eine verringerte Promotoraktivität festgestellt. Der in dieser Arbeit untersuchte Transkriptionsfaktor IDX-1 spielt eine Schlüsselrolle in der Regulation der Betazellmasse des endokrinen Pankreas. Es ist wichtig die molekularen Mechanismen der Regulation der Betazellmasse zu verstehen; Erkenntnisse darüber eröffnen einerseits ein besseres Verständnis der Pathogenese des Diabetes mellitus, andererseits stellen sie hoffnungsvolle neue Therapieansätze da.
Leptin reguliert die Sättigungszentren in den Kerngebieten des Hypothalamus. Zusätzlich hemmt es die Insulinsekretion der Beta-Zelle des endokrinen Pankreas. Umgekehrt fördert Insulin die Leptinsekretion des Fettgewebes. Dieser Regelkreis wird als adipoinsuläre Achse beschrieben. Fehlregulationen dieses Regelkreises werden bei übergewichtigen Patienten mit Leptinresistenz als Mechanismus bei der Ausbildung eines Diabetes mellitus Typ 2 diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Leptin auf die Beta-Zelle des endokrinen Pankreas untersucht. Ziel dieser Arbeit war die Identifikation neuer Leptin regulierter Gene. Dafür wurde unter anderem die Insulinom-Zelllinie INS-1 verwandt. In den vorliegenden Untersuchungen hemmte Leptin die mRNA-Expression von Insulin und dem Transkriptionsfaktor NeuoD1 in INS-1 Zellen. Darüber hinaus hemmte Leptin die mRNA- und Proteinexpression von Secretogranin II (Scg II) in INS-1 Zellen. Scg II wurde mit immunzytochemischen Färbungen in den Vesikeln von INS-1 Zellen nachgewiesen. Leptin hemmte des Weiteren die mRNA- und Proteinexpression sowie die Enzymaktivität der katalytischen Untereinheit der Protein Phosphatase 1 alpha (PP-1alpha) in INS-1 Zellen. In humanen Pankreasinseln wurde eine Kolokalisation von PP-1alpha und Insulin nachgewiesen. Eine Hemmung von PP-1alpha durch Calyculin A (Cal A) führte zu einer Reduktion der Insulinsekretion von INS-1 Zellen und humanen Pankreasinseln, sowie zu einer Reduktion des Kalzium-Influxes in INS-1 Beta-Zellen. Anhand dieser Ergebnisse könnte die hemmende Wirkung von Leptin auf die Insulinsekretion durch eine Regulation von PP-1alpha erklärt werden. Dabei führt die Inhibition von PP-1alpha zu einer Hemmung der Kalzium Kanäle, die wiederum eine Reduktion der Insulinsekretion bewirkt. In dieser Arbeit wurden neue Leptin regulierte Gene in INS-1 Beta-Zellen identifiziert und charakterisiert. Diese Ergebnisse zeigen neue Einblicke in die Regulation der Insulinsekretion. Darüber hinaus ergeben sich für die Zukunft mögliche Ansatzpunkte bei der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2.
PROMOGRAN fördert die Wundheilung durch aktive Modulation des Wundmilieus aller chronischen Wunden auf biochemischer Ebene. Es bindet und deaktiviert überschüssige Proteasen und schützt die Wachstumsfaktoren. PROMOGRAN ist eine gefriergetrocknete Matrix aus oxidierter, regenerierter Cellulose und Kollagen und wird vom Körper vollständig resorbiert. PROMOGRAN besitzt hämostatische Eigenschaften. In dieser Studie sollte die postulierte Wirksamkeit von PROMOGRAN auf drei verschiedenen Wundentitäten überprüft werden. Insgesamt kann PROMOGRAN als eine gute Ergänzung zur Wundbettkonditionierung angesehen werden. Es hat in nahezu allen Fällen dieser Studie wesentlich zu einer schnelleren Wundheilung beigetragen.
Hintergrund: Der Einfluss von Dialysemembranen auf Morbidität und Mortalität von Hämodialysepatienten ist hoch kontrovers. Methoden: Es erfolgte eine post-hoc Analyse der 4D Studie, einer randomisierten, placebo-kontrollierten, multizentrischen Studie, die die Wirkung von Atorvastatin bei hämodialysepflichtigen Typ 2 Diabetikern untersucht hat. Vor Analyse der Daten wurden die Patienten je nach verordneten Dialysefiltern in Gruppen eingeteilt; entsprechend Permeabilität und Flux wurden high- und low-flux und entsprechend der Biokompatibilität wurden Cellulose-, semisynthetische und synthetische Dialysemembranen unterschieden. Von 1255 Patienten wurden 648 (52%) identifiziert, die kontinuierlich mit einer synthetischen (syn) high-flux (HFS) (n=214), einer low-flux (LFS) syn (n=247), einer semisynthetischen LF (LFSS) (n=119) oder einer LF Cellulose (LFC)-Membran (n=41) behandelt wurden. Die Endpunkte waren Gesamtmortalität und kombinierte kardiale Mortalität, bestehend aus nicht tödlichem Herzinfarkt, Apoplex und kardiovaskulärem Tod. Ergebnisse: Nach einer Beobachtungszeit von 4 Jahren wurden die multivariaten relativen Risiken (RR) berechnet und adjustiert. Das RR den kardiovaskulären Endpunkt zu erreichen war signifikant höher für Patienten, die mit LFC. (RR 2.33; 95% Konfidenzintervall [CI] 1.38-3.94; p=0.002), LFSS (RR 1.92; 95% CI 1.35-2.73; p=0.0003) oder LFS (RR 1.35; 95% CI, 0.99-1.85; p=0.06) Membranen dialysiert wurden, als für Patienten, die mit HFS behandelt wurden. Entsprechend war das RR zu sterben höher bei Dialyse mit LFC (RR 4.14; 95 %CI 2.79-6.15; p<0.0001 ) LFSS (RR 2.24; 95% CI 1.66-3.02; p<0.0001), LFS (RR 0.45; 95% CI 1.22-2.07; p=0.0006) als bei Dialyse mit HFS . Auch im Vergleich zu Patienten, die mit LFS behandelt wurden, zeigte sich für LFC ein um 161% höheres RR (95% CI 1.80-3.79; p<0.0001) und für LFSS ein um 41% höheres RR (95% CI 1.07-1.86; p=0.016) zu sterben. Schließlich war bei Vergleich von LFC und LFSS das RR zu sterben bei Patienten, die mit LFC dialysiert wurden um 85% höher (95% CI 1.24-2.76; p=0.0025). Die geringste Rate an Todesfällen zeigte sich in der HFS-Gruppe; die kumulative Inzidenz betrug 12% nach 1 und 33% nach 3 Jahren. Am höchsten war die Gesamtmortalität in der LFC-Gruppe mit 44% und 84% nach 1 bzw. 3 Jahren. Gleichfalls signifikante Unterschiede zeigten sich für die Vergleiche mit LFS und LFSS. Ein ähnliches Bild ergibt sich bei der Betrachtung der Kaplan Meier Überlebenskurven für den kardiovaskulären Endpunkt: Die kumulative Inzidenz betrug für HFS 12,3% nach 1 und 30,5% nach 3 Jahren und für LFC 24,3% nach 1 und 60,8% nach 3 Jahren. Schlussfolgerung: Biokompatibilität und Flux von Dialysemembranen haben Einfluss auf die Prognose hämodialysepflichtiger Typ 2 diabetischer Patienten.
Die Zelltherapie stellt einen neuen Ansatz zur Therapie des Diabetes mellitus Typ 1 dar und ist eine Alternative zur exogenen Insulinsubstitution. Um diese Therapieoption zu etablieren und zu optimieren benötigt man jedoch ausreichend Material, was angesichts des Mangels an Spenderorganen problematisch ist. Als potentieller unlimitierter Zellpool sind embryonale und adulte Stammzellen in den Fokus der Forschung gerückt. Da gegenüber der Verwendung embryonaler Stammzellen in Deutschland ethische Bedenken bestehen und die Forschung an ihnen rechtlich untersagt ist, konzentriert sich diese Arbeit auf die Etablierung einer Strategie zur Expansion und Differenzierung gewebsspezifischer adulter Stammzellen. Nestin als Stammzellmarker spielt hierbei eine zentrale Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Vektoren konstruiert, welche die zellspezifische Expression eines Reportergens in Nestin-positiven Zellen selektiv ermöglichen. Diese Ergebnisse tragen dazu bei, daß im weiteren Schritte folgen könnten, um die Proliferation adulter Stammzellen voranzutreiben und somit einen unlimitierten Zellpool zu generieren. Nach dessen Differenzierung in Insulin produzierende ß-Zellen und deren Präparation könnte der substantielle Mangel an Spenderorganen ausgeglichen und die Optimierung und Etablierung der ß-Zell-Ersatztherapie entscheidend vorangebracht werden. Zum jetzigen Zeitpunkt ist noch wenig über die molekularen Mechanismen, welche die Expansion und Differenzierung von ß-Zellen bzw. Stammzellen kontrollieren, bekannt. Ebenso unklar ist, ob die in Tiermodellen oder Zelllinien erarbeiteten Ergebnisse auf humane Zellen übertragbar sind. Dennoch geht man davon aus einen Punkt erreicht zu haben, an dem man mit Bestimmtheit davon ausgehen kann, in der Zukunft voll funktionelle Insulin produzierende ß-Zellen generieren zu können. Vor der Einführung in die Klinik werden jedoch noch mehrere Jahre vergehen. Inzwischen ist es notwendig, die derzeit bereits vorhandenen Therapiemöglichkeiten des Diabetes mellitus auszubauen und zu verfeinern. Denn bereits jetzt ist absehbar, dass auf den Großteil der derzeit zur Verfügung stehenden Behandlungsmöglichkeiten - selbst bei der optimalen Entwicklung einer Stammzell-basierten Therapie - nicht verzichtet werden kann.
In klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass Pycnogenol® aufgrund seiner antiinflammatorischen, antioxidativen, antihypertensiven und blutglucosesenkenden Eigenschaften Vorteile für Patienten mit Prädiabetes oder Typ 2 Diabetes als Ergänzung zur konventionellen antidiabetischen Medikation haben kann. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die bisher wenig erforschten molekularen Prozesse zu untersuchen und die für die beobachteten Effekte verantwortlichen Bestandteile bzw. Metabolite von Pycnogenol zu identifizieren. Oxidativer Stress spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Diabetes und diabetischen Komplikationen. Die bekannten Bestandteile und Metabolite des Kiefernrindenextraktes Protocatechusäure, Gallussäure, Kaffeesäure und M1 zeigten in in vitro Assays ein stärkeres antioxidatives Potential als Ascorbinsäure. Die perorale Einnahme des Extraktes über 5 Tage bewirkte bei 2 von 5 Probanden eine Verbesserung der antioxidativen Aktivität des Serums. Somit kann Pycnogenol dazu beitragen, das bei Diabetes-Patienten verminderte antioxidative Abwehrsystem zu stärken. Entzündungsprozesse treten als Folge von Insulinresistenz, Hyperglykämie und Hyperlipidämie auf. Daher wurde der Einfluss des Rindenextraktes auf die Sekretion von TNF- und die Aktivität der COX-Enzyme getestet, die bei Diabetes erhöht sind. Nach peroraler Einnahme von Pycnogenol war eine statistisch nicht signifikante Zunahme der TNF- Sekretion in Zellkulturüberständen humaner Monocyten nach Inkubation mit Serumproben festzustellen. Die antiinflamma-torischen Effekte sind somit nicht durch die Reduktion der TNF- Sekretion zu erklären. Des Weiteren wurde ein moderater inhibitorischer Effekt auf die Aktivität von COX-1 und COX-2 ex vivo verzeichnet. Die unselektive Hemmung der Enzyme ist mit klassischen NSAIDs vergleichbar. Da bereits 30 min nach Einnahme des Extraktes ein Hemmeffekt auf die enzymatische Aktivität ex vivo zu erkennen war, konnte auf eine schnelle Bioverfügbarkeit von biologisch aktiven Verbindungen aus Pycnogenol geschlossen werden. Die COX-Hemmung liefert somit eine partielle Erklärung für die in vivo beobachtete antiinflammatorische Aktivität und Hemmung der Thrombocytenaggregation durch den Extrakt. Chronische Hyperglykämie gilt als Leitbefund bei Diabetes mellitus. Es sind diverse Ansatzpunkte denkbar, um der Ursache Insulinresistenz entgegenzuwirken. Der Kiefernrindenextrakt erwies sich in vitro als 200-fach effektiver bei der Hemmung der -Glucosidase als Acarbose. Dabei wurden die tetrameren und höher oligomeren Procyanidine als aktive Substanzen identifiziert und die Reduktion der Enzymaktivität diesen zugeschrieben. Hierdurch kann eine Verlangsamung der Glucoseresorption und somit eine Vermeidung von postprandialen Glucosespitzen erzielt werden, wodurch die klinisch beobachtete antidiabetische Wirkung von Pycnogenol erklärt werden könnte. Des Weiteren wurde ein auf PPAR- spezifischer ELISA entwickelt, da bisher PPAR- nur indirekt durch Aktivitätsmessung von Reportergenen bestimmt wurde. Die Inkubation von humanen Monocyten mit M1 bzw. Rosiglitazon in deren jeweiligen Plasmakonzentrationen bewirkte eine geringfügige Zunahme der Konzentration des ligandenaktivierten und DNA-bindungsfähig gemachten PPAR- im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Eine durch den Metaboliten M1 bewirkte Aktivierung von PPAR-, die unter anderem zur Verbesserung der Sensitivität der Insulinrezeptoren führt, konnte hier nicht eindeutig nachgewiesen werden. Eine reduzierte Expression von GLUT-4 auf der Zelloberfläche ist an der Entstehung von Insulinresistenz beteiligt. Durchflusszytometrische Messungen zeigten, dass bei 24-stündiger Vorinkubation von Adipocyten Rosiglitazon wie auch M1 eine Zunahme der GLUT-4 Dichte im Vergleich zur Kontrolle bewirkten. M1 könnte somit durch Steigerung der Exocytose von GLUT-4 die Glucoseverwertung erhöhen und so die Blutglucosespiegel senken. Adipositas gilt als Risikofaktor für Diabetes mellitus und wird durch viele Antidiabetika begünstigt. Pycnogenol, (+)-Catechin, Ferulasäure, Protocatechusäure, (±)-Taxifolin, Fraktion I und M1 bewirkten in vitro eine Reduktion der intrazellulären Lipidakkumulation aufgrund der Hemmung der Adipogenese. Ob die im humanen Organismus erreichten Konzentrationen nach oraler Einnahme des Extraktes ausreichen, um die Adipocyten-Differenzierung signifikant zu hemmen, bleibt zu klären. Die Ergebnisse der vorliegenden ex vivo und in vitro Untersuchungen liefern einen Ansatz zur Erklärung der beobachteten klinischen Effekte auf molekularer Ebene.
Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkung einer chronischen Wunde auf die Lebensqualität von Diabetikern zu untersuchen. Dazu sollte die Lebensqualität von Diabetikern ohne chronische Wunde mit der Lebensqualität von Diabetikern mit chronischer Wunde verglichen werden. Analog dazu erfolgte ein Vergleich von Patienten mit und ohne chronischer Wunde, aber zusätzlicher dialysepflichtiger Niereninsuffizienz. Befragt wurden insgesammt 215 Patienten. Bei Patienten mit chronischer Wunde erfolgten jeweils drei Befragungen um eventuelle Veränderungen der Lebensqualität im Therapieverlauf zu ermittlen. Die Interviews erfolgten zum Zeitpunkt der Erstbefragung sowie nach einem und drei Monaten. Gemessen wurde die Lebensqualität durch die krankheitsübergreifenden Messinstrumente "Short-Form-36" (SF-36), dem "Nottingham Health Profile" (NHP)sowie dem neu entwickelten, krankheitsspezifischen "Würzburger Wundscore". Es zeigte sich, dass schon das Bestehen eines Diabetes mellitus zu einer erheblichen Verschlechterung der Lebensqualität führt. Durch eine chronische Wunde kommt es ebenfalls zu einer deutlichen Verschlechterung der Lebensqualität, vor allem sind hier physische Bereiche stark eingeschränkt. Durch eine Dialysepflichtigkeit wird die Lebensqualität zwar auch eingeschränkt, jedoch nicht im selben Umfang wie durch eine chronische Wunde bzw. durch das alleinige Bestehen eines Diabetes mellitus. Bei Patienten mit chronischer Wunde wurde bei Untersuchungen im Therapieverlauf zwischen einem günstigen und einem ungünstigen Verlauf unterschieden. Es konnte hier keine signifikanten Veränderungen der Lebensqualität im Verlauf gezeigt werden. Es zeigte sich, dass eine gute Lebensqualität vor allem bei physischen Komponenten negativ mit dem Alter der Befragten korreliert. Männliche Diabetiker mit chronischer Wunde haben in fast allen Bereichen eine bessere Lebensqualität als Frauen. Der "Würzburger Wundscore" erwies sich als ein valides Instrument zur Messung der Lebensqualität bei Diabetikern mit chronischer Wunde mit einer höheren Änderungssensitivität bei Veränderungen der Lebensqualität bei günstigem Heilungsverlauf im Vergleich zu den SF-36 und NHP.
Die Insulinbiosynthese in ß-Zellen des endokrinen Pankreas wird auf transkriptioneller Ebene durch die Aktivität des Insulingenpromotors reguliert. Die detaillierte Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors erfolgte bisher nur in speziesdifferenten ß-Zelllinien, da glukosesensitive ß-Zelllinien aus dem Pankreas des Menschen nicht verfügbar sind. Es ist jedoch bekannt, dass signifikante Unterschiede in der transkriptionellen Regulation der Genexpression in unterschiedlichen Spezies existieren. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die spezifische Untersuchung der Regulation des humanen Insulingenpromotors hochsensitiv in primären humanen ß-Zellen des endokrinen Pankreas des Menschen möglich ist. Dazu wurde ein Vektor kloniert, der das SEAP (secreted alkaline phosphatase)-Reportergen unter der Kontrolle des -336 bp langen humanen Insulingenpromotors enthält. Im Laufe verschiedener Transfektionsexperimente mit dem Vektor p-336hInsP-SEAP, pSEAP2-Control (Positivkontrolle) und pSEAP2-Basic (Negativkontrolle) sowohl in INS-1-ß-Zellen, in beta-TC3-Zellen als auch in primären humanen ß-Zellen, zeigten sich in den luminometrisch bestimmten SEAP-Aktivitäten, die als Maß für die Aktivität des humanen Insulingenpromotors dienen, deutliche Unterschiede zwischen den transkriptionellen Aktivitäten der einzelnen Vektoren. Dieses System eignet sich also ausgezeichnet für die hochsensitive Analyse der Insulingenpromotoraktiviät. Zur detaillierteren Analyse wurden 5’-Deletionskonstrukte des Vektors p-336hInsP-SEAP konstruiert und damit INS-1- und beta-TC3-Zellen transient transfiziert. In beiden Zelllinien wurden Experimente bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen durchgeführt, um daraus Rückschlüsse auf die Glukoseresponsivität des humanen Insulingenpromotors ziehen zu können. Dabei zeigte der humane Insulingenpromotor die aus Versuchen mit dem RattenInsulingenpromotor 1 erwartete Glukoseresponsivität. Allerdings ließ sich keine Abnahme der transkriptionellen Aktivität des Promotors bei Abnahme der Länge der Konstrukte beobachten. Unter Verwendung von Effectene® als Transfektionsreagenz eignet sich das SEAP-System zur Analyse der Aktivität des humanen Insulingenpromotors in primären insulinproduzierenden Zellen aus dem menschlichen Pankreas.