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Herzkreislauferkrankungen stellen die häufigsten Todesursachen in den Industrienationen dar. Die Entwicklung nichtinvasiver Bildgebungstechniken mit Hilfe der Magnetresonanz-Tomografie (MRT) ist daher von großer Bedeutung, um diese Erkrankungen frühzeitig zu erkennen und um die Entstehungsmechanismen zu erforschen. In den letzten Jahren erwiesen sich dabei genetisch modifzierte Mausmodelle als sehr wertvoll, da sich durch diese neue Bildgebungsmethoden entwickeln lassen und sich der Krankheitsverlauf im Zeitraffer beobachten lässt.
Ein große Herausforderung der murinen MRT-Bildgebung sind die die hohen Herzraten und die schnelle Atmung. Diese erfordern eine Synchronisation der Messung mit dem Herzschlag und der Atmung des Tieres mit Hilfe von Herz- und Atemsignalen. Konventionelle Bildgebungstechniken verwenden zur Synchronisation mit dem Herzschlag EKG Sonden, diese sind jedoch insbesondere bei hohen Feldstärken (>3 T) sehr störanfällig. In dieser Arbeit wurden daher neue Bildgebungsmethoden entwickelt, die keine externen Herz- und Atemsonden benötigen, sondern das MRT-Signal selbst zur Bewegungssynychronisation verwenden. Mit Hilfe dieser Technik gelang die Entwicklung neuer Methoden zur Flussbildgebung und der 3D-Bildgebung, mit denen sich das arterielle System der Maus qualitativ und quantitativ erfassen lässt, sowie einer neuen Methode zur Quantisierung der longitudinalen Relaxationszeit T1 im murinen Herzen. Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden ermöglichen robustere Messungen des Herzkreislaufsystems. Im letzten Kapitel konnte darüber hinaus gezeigt werden dass sich die entwickelten Bildgebungstechniken in der Maus auch auf die humane Bildgebung übertragen lassen.
Der Notch Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskulären Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) Mäuse und Hey1/HeyL Doppelknockout-Mäuse (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung während der Blutgefäßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Ausprägung der Hey KO Maus-Phänotypen besser verstehen zu können. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gewählt, um gleichzeitig einen Überblick über die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein überexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach Überexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur für Hey2 15 Gene, die stärker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antikörper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Domäne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminosäureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach Überexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgewählten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Domäne essentiell für die DNA-Bindung und für die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgeführt. Für Hey1 wurden 1453 Zielgene, für Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 %, bzw. 49 % aller Bindungsstellen für Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. Während 60 % der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 % der hochregulierten Gene Bindestellen für Hey2 auf. Dies spricht für eine überwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu überprüfen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 überexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey Überexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die Überlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen stärker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe Überlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in frühen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren können. Weiterhin eröffnen diese Daten neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der frühen Organentwicklung genauer ergründen.
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS, engl. reactive oxygen species) sind hochreaktive Biomoleküle, die in geringen Konzentrationen ubiquitär als Produkte des normalen zellulären Metabolismus entstehen. Zum Schutz vor irreversiblen oxidativen Schädigungen durch diese Moleküle, besitzt der Organismus antioxidative Enzyme und nicht-enzymatische Antioxidantien, die ROS neutralisieren. Eine pathophysiologische Zunahme der Generierung und Freisetzung von ROS und/oder verminderte zelluläre Abwehrmechanismen gegen diese können, in Folge einer gestörten Redox-Homöostase, zur Ausbildung des sog. „oxidativen Stresses“ führen, der unter anderem mit einer Reihe kardiovaskulärer Erkrankungen assoziiert ist. Das Steroidhormon Aldosteron (ALDO), das der Gruppe der Mineralocorticoide angehört, besitzt für den Wasser- und Elektrolythaushalt eine essentielle Bedeutung. Als Agonist bindet ALDO an Mineralocorticoidrezeptoren (MR) in der Niere und im Kolon und stimuliert unter physiologischen Bedingungen über die Aktivierung des MR die renale Rückresorption von Natriumionen und Wasser. Epidemiologische Studien sowie in vitro und in vivo Untersuchungen konnten einen kausalen Zusammenhang zwischen erhöhten ALDO-Serumwerten und/oder einer disproportional erhöhten MR-Aktivierung und einer gesteigerten ROS-Generierung im Herz-Kreislaufsystem belegen. Im Gegensatz zu ALDO besitzt das Sexualsteroid 17β-Estradiol (E2) protektive kardiovaskuläre Effekte. E2 fungiert über zwei intrazelluläre Estrogenrezeptor (ER)-Subtypen, ERα und ERβ, die nach ligandabhängiger Aktivierung als nukleäre Transkriptionsfaktoren die Expression spezifischer Zielgene regulieren. Neben ER-vermittelten vasodilatatorischen und antiinflammatorischen Wirkungen innerhalb der Blutgefäße und des Myokards besitzt E2 unter anderem auch antioxidative Eigenschaften und das Potential die zelluläre Redox-Homöostase günstig zu beeinflussen. Auf Grund dieser Befunde wurde die Hypothese aufgestellt, dass E2 über einen ER-vermittelten Mechanismus dem ALDO-induzierten oxidativen Stress in glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte (PRSMC, für engl. primary rat smooth muscle cells) entgegenwirkt. Zusätzlich sollte durch die Supplementation des ERα-spezifischen Agonisten 16α-LE2 und des ERβ-spezifischen Agonisten 8β-VE2 zu ALDO-behandelten Zellen untersucht werden, ob die beiden ER-Subtypen redundante, spezifische oder gegensätzliche Effekte bezüglich der aufgestellten Hypothese, besitzen. Durch Färbungen hormonbehandelter PRSMC mit dem ROS-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Dihydroethidium (DHE) und anschließender Quantifizierung der DHE-Fluoreszenzintensität konnte bestätigt werden, dass der ALDO-induzierte oxidative Stress durch die Kosupplementation von E2, 16α-LE2 und 8β-VE2 über einen ERα- und ERβ-vermittelten Mechanismus signifikant reduziert werden kann. Des Weiteren konnte im Verlauf dieser Arbeit belegt werden, dass die intrazelluläre Konzentration des Reduktionsäquivalents Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat in seiner reduzierten Form (NADPH) in ALDO+E2-, ALDO+16α-LE2- und ALDO+8β-VE2-behandelten PRSMC im Vergleich zu nur mit ALDO-behandelten Zellen signifikant erhöht ist. Ferner konnte in Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen gezeigt werden, dass die Kosupplementation von NADPH zu ALDO-behandelten Zellen, die DHE Oxidation in diesen Zellen signifikant unterbindet. Mittels Western Blot Analysen und Enzymaktivitätsassays hormonbehandelter PRSMC ließ sich schließlich nachweisen, dass ALDO die Enzymaktivität und Proteinexpression des NADPH generierenden Enzyms Glukose-6-phosphat Dehydrogenase (G6PDH) supprimiert. Weiter konnte innerhalb dieser Arbeit erstmalig bestätigt werden, dass E2 die Suppression der G6PDH-Aktivität durch ALDO unterbindet und die Enzymaktivität dieses Proteins wieder auf den basalen Wert anhebt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass E2 der ALDO-induzierten lokalen ROS-Generierung in PRSMC ER-vermittelt entgegenwirkt. Der zugrunde liegende Mechanismus dieses Effekts basiert auf einer Aufrechterhaltung der G6PDH-Enzymaktivität, wodurch die Bioverfügbarkeit des Reduktionsäquivalents NADPH, das eine Schlüsselrolle im zellulären antioxidativen System spielt, gewährleistet wird.
Als Tiermodell ist die Maus aus der pharmazeutischen Grundlagenforschung nicht mehr wegzudenken. Aus diesem Grund nimmt besonders die Verfügbarkeit nicht invasiver Diagnoseverfahren für dieses Tiermodell einen sehr hohen Stellenwert ein. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von in vivo MR-Untersuchungsmethoden zur Charakterisierung des kardiovaskulären Systems der Maus. Neben der morphologischen Bildgebung wurde ein besonderer Schwerpunkt auf die Quantifizierung funktioneller Parameter der arteriellen Gefäße wie auch des Herzens gelegt. Durch Implementieren einer PC-Cine-Sequenz mit dreidimensionaler Bewegungskodierung war es möglich, die Charakteristik der Bewegung des gesamten Myokards zu untersuchen. Die Aufnahme von Bewegungsvektoren für jeden Bildpunkt und die Bestimmung des Torsionswinkels innerhalb der Messschichten konnte die systolische Kontraktion als dreidimensionale Wringbewegung des Herzens bestätigen. Um die Qualität der morphologischen Gefäßbildgebung zu verbessern, sollte untersucht werden, inwieweit bestehende Verfahren zur Gefäßwanddarstellung optimiert werden können. Implementieren einer Multi-Schicht-Multi-Spin-Echo-Sequenz an einem 17,6 Tesla Spektrometer erlaubte durch das hohe B0-Feld einen deutlichen Signalgewinn. Erstmals wurde es möglich, die gesunde Gefäßwand darzustellen und so morphologische Veränderungen in einem möglichst frühen Zustand zu untersuchen. Neben der Untersuchung morphologischer Veränderungen sollte vor allem ein Schwerpunkt auf das Studium funktioneller Parameter der Gefäßwand gelegt werden. Dazu wurde in einem ersten Schritt mit einem PC-Cine-Verfahren die Umfangsdehnung in ihrem zeitlichen Verlauf ermittelt. Dabei zeigte sich, dass im Laufe einer arteriosklerotischen Plaqueprogression eine Änderung der Umfangsdehnung vor einer Änderung morphologischer Parameter beobachtet werden kann. Deshalb war es Ziel, im Verlauf dieser Arbeit weitere Verfahren zur Charakterisierung funktioneller Parameter des Gefäßsystems zu entwickeln. Um direkt Elastizitätsparameter ermitteln zu können, fehlt als Bezugsgröße der arterielle Pulsdruck (AP). Die Lösung der inkompressiblen Navier-Stokes-Gleichungen unter Anwendung der Lang-Wellen-Näherung und der Näherung für große Pulswellengeschwindigkeiten (PWV) erlaubte die Bestimmung der komplexen Impedanz und somit des arteriellen Pulsdrucks in der Frequenzdomäne. Dadurch war es möglich, den dynamischen Anteil des arteriellen Druckpulses direkt aus einer Messung der Pulswellengeschwindigkeit sowie aus dem Verlauf des Flusspulses zu bestimmen. Zur Ermittlung des AP muss die Pulswellengeschwindigkeit bestimmt werden. Für die MR-Bildgebung in murinen Gefäßen waren hierzu bisher keine Verfahren verfügbar. Da sich die Gefäßdehnung möglicherweise als Indikator für eine frühe Wandveränderung bei der Plaqueprogression zeigt, bestand ein großes Interesse in der Untersuchung von spezifischen gefäßmechanischen Eigenschaften wie beispielsweise der PWV. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei MR-Methoden für die nicht invasive Bildgebung in der Maus entwickelt werden, die es ermöglichten, die lokale und die regionale Pulswellengeschwindigkeit zu bestimmen. Die Messung der lokalen Pulswellengeschwindigkeit beruht dabei auf der zeitaufgelösten Bestimmung der Gefäßwanddehnung sowie des Blutvolumenflusses. Zur Bestimmung der regionalen Pulswellengeschwindigkeit wurde eine Erweiterung der Zwei-Punkt-Transit-Zeit-Methode verwendet. Durch zeitaufgelöste bewegungskodierte Bildgebung entlang der Aorta konnte anhand von 30 Stützpunkten die Propagation des arteriellen Flusspulses vermessen werden. Die Messzeit gegenüber einer Zwei-Punkt-Methode ließ sich dadurch halbieren. Gleichzeitig bietet die Auswertung von 30 Messpunkten eine größere Sicherheit in der Bestimmung der PWV. Beide Methoden wurden an einem elastischen Gefäßphantom validiert. In vivo Tierstudien an apoE(−/−)-Mäusen und einer Kontrollgruppe zeigten für beide Methoden eine gute Übereinstimmung. Darüber hinaus konnte ein Ansteigen der Pulswellengeschwindigkeit in apoE(−/−)-Mäusen durch arteriosklerotische Veränderungen nachgewiesen werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit grundlegende Verfahren zur Untersuchung des kardiovaskulären Systems der Maus optimiert und entwickelt. Die Vielseitigkeit der MR-Bildgebung ermöglichte dabei die Erfassung von morphologischen und funktionellen Parametern. In Kombination können die beschriebenen Methoden als hilfreiche Werkzeuge für die pharmakologische Grundlagenforschung zur Charakterisierung von Herz-Kreislauf-Erkankungen in Mausmodellen eingesetzt werden.