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Degenerative Bandscheibenerkrankungen wie Protrusionen oder vorgefallenes Nukle-usgewebe führen häufig zu chronischen Schmerzen und schränken die Bewegungsmo-bilität sehr ein. Operative Behandlungsmöglichkeiten wie die Nukleotomie oder die Fusion von Wirbelkörpern stellen traumatische Eingriffe in das komplexe System der Wirbelsäule dar. Biologische Verfahren, durch die eine Regeneration des geschädigten Gewebes erzielt werden kann, sind klinisch bisher nicht etabliert.
Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung, Herstellung und Testung regenerativer azellulä-rer Implantatmatrices auf der Basis von Kollagen Typ I, die den degenerierten Nukleus pulposus ersetzen sollen. Insbesondere eine Höhenminderung der Bandscheibe kann zu Anschlussdegenerationen benachbarter Segmente führen. Dies soll durch die Implan-tatmatrix ausgeglichen werden. Nach der Konstruktion und dem Bau eines Reaktors aus dem Hochleistungskunststoff Polytetrafluorethylen (PTFE), der allen Anforderungen eines CE-Konformitätsbewertungsverfahrens entspricht, wird eine hoch verdichtete Kollagen Typ I Matrix mit einer Stärke von 1 mm hergestellt. Diese kann über den Pro-zess der Lyophilisation auf 0,6 mm weiter reduziert werden. Es gelingt, die Matrix in einer Edelstahlhülse zu platzieren, über die mit Hilfe eines passgenauen Führungssta-bes die endoskopische Implantation in die Nukleuskavität erfolgen soll. Im Rahmen der Interkorporellen Fusionstage des Diakonie Klinikums Stuttgart wird das operative Handling an einem humanem Präparat simuliert. Die Implantation erfolgt offen über einen transforaminalen Zugang in zwei nukleotomierte Segmente der lumbalen Wir-belsäule. Die anwesenden Wirbelsäulenchirurgen beurteilen die Möglichkeit der endo-skopischen Applikation als positiv und machbar.
Durch den Zusatz des Polysaccharids Hyaluronsäure gelingt es, die Quelleigenschaften der hoch verdichteten Matrix zu steigern, so dass diese wie natives Nukleusgewebe in der Lage ist, Flüssigkeit in Ruhe wieder aufzunehmen. Das Quellpotential und die da-mit einhergehende Volumenzunahme nach Kompression sind für ein Nukleusersatzma-terial essentiell. Die hier verwendete Hyaluronsäure geht jedoch im offenen System der in vitro Inkubation innerhalb von 11 Tagen verloren. Dennoch zeigen sich weitere Vorteile gegenüber der Matrix ohne Hyaluronsäure-Zusatz innerhalb der Testungen heraus. Diese sind neben dem erhöhten Quellpotential z. B. eine gesteigerte Rate der Zellproliferation der verwendeten bovinen und humanen Bandscheibenzellen (bBSZ und hBSZ) sowie humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC), die über die Be-stimmung der Zellzahl und Viabilität ermittelt wird. Zudem zeigt sich eine gesteigerte mechanische Stabilität, die über die Spannungs-Kompressions-Messungen evaluiert wird. Über Lebend-/ Totfärbungen und Zytotoxizitätstests an Monolayerkulturen kann zudem nachgewiesen werden, dass die notwendige Endsterilisation durch γ-Bestrahlung zu keinen zytotoxischen Veränderungen der Matrix führt. Da die verdich-tete Implantatmatrix azellulär als Medizinprodukt der Klasse III eingesetzt werden soll, wird als ergänzende Matrix zur Füllung kleinster Hohlräume die zunächst flüssige ChondroFillerliquid Matrix (ein Knorpelersatzmaterial der Firma Amedrix GmbH, Esslin-gen) durch den Zusatz von Hyaluronsäure modifiziert und in der Zellkultur getestet. Da es sich hierbei um ein Zweikammerspritzensystem handelt, ist die Verwendung von Additiva wie z. B. Stammzellen technisch möglich. Die Ermittlung der maximalen Inku-bationszeit von Zellen in verschieden konzentrierten hyperosmotischen Neutralisations-lösungen ergibt eine Dauer von 5 min, bis irreversible Zellschäden auftreten. In Migra-tionsversuchen kann gezeigt werden, dass die ChondroFillerliquid Matrix als Konektiv zwischen nativem Nukleusgewebe und verdichteter Implantatmatrix fungiert. Des Wei-teren synthetisieren bBSZ, hBSZ und hMSC sulfatierte Glykosaminoglykane und behal-ten dabei ihr charakteristisches Genexpressionsprofil. Die chondrogene Differenzie-rung durch die Verwendung eines chondrogenen Differenzierungsmediums gelingt bei den hMSC bereits nach einer Kultivierungsdauer von 14 d. Die Zellverteilung in den Implantatmatrices und deren Morphologie entspricht dem nativen Nukleusgewebe. Die biomechanische Testung an einem international anerkannten Modellsystem für humane Wirbelsäulen – der Kalbswirbelsäule – ergibt, dass die Nukleotomie zu einer Erhöhung des Range of Motion (RoM) in alle Richtungen nach Flexion/Extension, Seit-neigung rechts/links und axiale Rotation rechts/links sowie zu einer Höhenreduktion des Segments im Vergleich zum Intaktzustand führt. Nach der Implantation der ver-dichteten Implantatmatrix wird der RoM deutlich reduziert. Das Segment weist dadurch eine hohe Steifigkeit ähnlich dem Intaktzustand auf. Die Höhenreduktion kann durch die Implantation beinahe vollständig wieder ausgeglichen werden. Im Rahmen der zyklischen Dauerbelastungen treten jedoch Implantatextrusionen auf. Zudem nimmt die Steifigkeit deutlich ab, der RoM hingegen wieder zu. Da das bovine Modell jedoch nicht der in vivo Situation entspricht und beispielsweise eine zunehmende In-tegration des Implantats durch Einwachsen nicht ermöglicht, ist die hohe Extrusionsra-te als nicht realistisch zu werten. Klinische Studien am Tier und Mensch müssen zeigen, inwieweit derartige Extrusionen ohne die Verwendung eines Anulusverschlußsystems auftreten.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen geeigneten Reaktor zu ent-wickeln und mit diesem eine biokompatible, stabile und quellfähige Matrix herzustel-len, die den Höhenverlust nach einer Nukleotomie auszugleichen vermag. Die modifi-zierte ChondroFillerliquid Matrix stellt eine ideale Ergänzung dar, da über diese Zellen oder andere Additiva verabreicht werden können und deren konektive Wirkung die Zellbesiedlung der azellulären Matrix begünstigt.
Atherosklerose ist ein wichtiger Faktor bezüglich der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen, indem sie Einfluss auf die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Gefäße nimmt. Wegen dieser Bedeutung ist es wichtig, diese Erkrankung und deren Zusammenhänge genau zu erforschen.
Einige Studien konnten zeigen, dass die Pulswellengeschwindigkeit mit Gefäßwand-eigenschaften, insbesondere deren Steifigkeit, zusammenhängt. So konnte in Untersuchungen von Gotschy et al.27 eine Zunahme der lokalen Pulswellen-geschwindigkeit, als Marker für Gefäßwandsteifigkeit, in Aortenanteilen von ApoE(-/-)-Mäusen im Zeitverlauf mittels MRT gezeigt werden, ohne dass makroskopische Veränderungen in frühen Stufen atherosklerotischer Entwicklung sichtbar waren. Dies wird nun als Ausgangspunkt herangezogen, um zu erforschen, durch welche histologischen Veränderungen des Gefäßes innerhalb der Atherogenese eine frühe Zunahme der lokalen PWV erklärt werden kann.
Hierzu wird zum einen die mit der Gefäßwandsteifigkeit in Zusammenhang gebrachte Elastinfragmentierung innerhalb der elastischen Laminae der Aorta ascendens und abdominalis mittels histologischer Untersuchung quantitativ bestimmt. Die elastischen Schichten werden durch modifizierte Elastika-van-Gieson-Färbung dargestellt. Zur vergleichenden Bestimmung wird ein Quotient aus der Anzahl bei mikroskopischer Betrachtung erkennbarer Brüche der elastischen Laminae und bestimmter Gefäßwandquerschnittsfläche erstellt. Die Ausprägung der Elastinfragmentierung unterscheidet sich signifikant in den zwei höchsten Altersklassen der Test- und Kontrollmäuse in beiden untersuchten Aortenabschnitten, wobei die ApoE(-/-)-Tiere stets den höheren Wert aufweisen. Anhand der Ähnlichkeit hinsichtlich der Entwicklung der Messwerte von beschriebener lokalen PWV und der hier gezeigten Elastinfragmentierung kann vermutet werden, dass diese zu einer Erhöhung der Gefäßwandsteifigkeit beiträgt. Die gezeigten histologischen Parameter können so als Indikator für Veränderungen der Gefäßeigenschaften während der Atherogenese und als möglicher Grund einer Veränderung der Gefäßwandsteifigkeit mit konsekutiver Erhöhung der lokalen PWV angesehen werden.
Als weiterer Einflussfaktor auf die mechanischen Eigenschaften des Blutgefäßsystems wird die Entwicklung des Kollagengehaltes anteilig an der Aortenwand bestimmt. Es wurde in vielen Publikationen beschrieben, welchen großen Stellenwert Kollagenfasern für die Gefäßwandsteifigkeit haben. Auch wird das untersuchte Kollagen hinsichtlich seiner Faserdicken nochmals genauer untersucht. Die Kollagenfasern werden mittels Pikro-Sirius-Rot gefärbt und anschließend unter zirkulär polarisiertem Licht analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen keinen eindeutigen Trend hinsichtlich ihrer Entwicklung. Sie lassen sich auch nicht mit der aufgestellten Hypothese in Übereinkunft bringen, da keine zeitliche Dynamik verglichen mit der Entwicklung der anderen Parameter nachgewiesen werden kann.
Um den beschriebenen entzündlichen Charakter der Atherogenese ebenso zu berücksichtigen, wird das Einwanderungsverhalten von Makrophagen in die Gefäßwand betrachtet. Es wird die relative Fläche der durch Makrophagen besiedelten Gefäßwandanteile bestimmt und als Indikator einer Entzündungsreaktion angesehen, welche direkt oder indirekt Einfluss auf Gefäßwandeigenschaften haben könnte. Mittels eines Antikörpers gegen das makrophagenspezifische Protein CD68 und Kombination mit anti-antikörpervermittelt bindenden fluoreszierenden Substanzen, werden Makrophagen in einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und die besiedelte Fläche softwaregestützt bestimmt. Dabei kommt die vorliegende Untersuchung zu dem Ergebnis, dass sich die Makrophagenbesiedelung in beiden betrachteten Aortenabschnitten deutlich im Zeitverlauf bei den ApoE(-/-)-Tieren erhöht. Der relative Gefäßwandanteil der von Makrophagen besiedelten Flächen erreicht seinen höchsten Wert innerhalb der Aorta ascendens bei 18 Wochen alten ApoE(-/-)-Tieren; in der Aorta abdominalis bei 30 Wochen alten. Die absolute CD68-Fläche in beiden Aortenabschnitten steigt bis zum Versuchsende hin an, wobei der stärkste Anstieg in der Zeit von sechs zu 18 Wochen geschieht. Dagegen zeigt die Kontrollgruppe eine sehr geringe Zunahme dieser beiden Messgrößen, wobei diese stets auf einem sehr niedrigen Niveau bleiben und keineswegs mit der Entwicklung der Testtiere zu vergleichen sind. Besonders zu beachten ist, das bereits in der jüngsten Altersstufe von sechs Wochen ein höheres Maß an Makrophagenbesiedelung bei Aortenanteilen der ApoE(-/-)-Tiere zu verzeichnen ist, als bei den entsprechenden Kontrollen. Auf Grund dieser Beobachtung, lässt sich ein möglicher Zusammenhang mit der schon früh ansteigenden Gefäßsteifigkeit vor sichtbarer Plaqueentwicklung herstellen.
Bei der Klärung der zentralen Fragestellung dieser Arbeit nach einem histomorphologischen Korrelat für die frühzeitige Erhöhung der lokalen PWV zeigt sich folgendes Ergebnis: Insgesamt können die gemessenen histologischen Charakteristika, vor allem die Entwicklung der Elastinfragmentierung innerhalb der Gefäßwand und der Grad der Makrophagenbesiedelung, frühe Indikatoren für Veränderungen morphologischer und funktioneller Gefäßwandspezifikationen sein. Sie kommen daher als denkbare Ursache für den Anstieg der lokalen Pulswellengeschwindigkeit in Betracht, besonders da die zuvor erwähnten histologischen Parameter zeitlich wie diese einen ähnlichen Verlauf hinsichtlich ihrer Entwicklung zeigen.
Die Atherogenese und deren zahlreiche Einflussfaktoren bleiben weiterhin Forschungs-gegenstand und es gilt mehr denn je mögliche Mechanismen aufzudecken, um eine Gefäßwandschädigung frühzeitig und effektiv verhindern zu können. Hiervon würde ein Großteil der Bevölkerung profitieren, da die Atherosklerose durch ihre Folgeerkrankungen nach wie vor, nicht nur in Deutschland, die Todesursachenstatistik anführt.