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Obwohl es in den letzten 10-15 Jahren gelang, multiple MM-Genome mittels NGS auf eine kosteneffiziente Art und mit geringem Zeit- und Materialaufwand zu sequenzieren und hierdurch zum Teil bahnbrechende Erkenntnisse gewonnen werden konnten, sind molekulargenetische Untersuchungen im diagnostischen Workflow des MMs bisher nicht ausreichend implementiert, um eine personalisierte Therapieentscheidung zu ermöglichen.
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit eine Gruppe an Patienten mit NDMM und RRMM anhand klinischer Parameter charakterisiert und durch Verwendung des M³P-Panels auf das Vorliegen bestimmter molekulargenetischer Veränderungen untersucht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Analyse die bisher veröffentliche M³P-Prävalenz in MM-Tumorproben bestätigt. Zu den am häufigsten mutierten Genen gehörten KRAS, NRAS, DIS3, ATM und BRAF. In der Gruppe der Patienten mit NRAS-Mutation oder del17p war die Zahl der relevanten Mutationen deutlich höher als ohne Vorliegen der entsprechenden Veränderung. Der Nachweis eines Double-Hit-Myeloms war erwartungsgemäß der stärkste ungünstige Faktor in unserer Kohorte. Unter den Patienten mit CRBN-Mutation waren alle IMiD-vorbehandelt und zeigten im Verlauf eine Refraktärität gegenüber dieser Substanzgruppe auf. Bezüglich der Überlebensanalysen bestätigten unsere Ergebnisse bereits bekannte prognostische Risikofaktoren wie Hochrisikozytogenetik, insbesondere del17p und gain1q, eine TP53-Mutation sowie ISS- und R-ISS-Stadium III.
Die Ergebnisse der Mutationsanalysen dieser Arbeit verdeutlichen den großen wissenschaftlichen und therapeutischen Nutzen, der von molekulargenetischen Untersuchungen ausgeht. Zukünftig werden auch beim MM Therapieentscheidungen auf Grundlage genetischer Diagnostik getroffen werden, mit dem Ziel die Behandlung für MM-Patienten weiter zu verbessern.
Erweiterte Diagnostik bei neuromuskulären Erkrankungen: vom Genpanel zum Whole Genome Sequencing
(2019)
Muskeln und Nerven bilden eine essentielle funktionelle Einheit für den Bewegungsapparat. Neuromuskuläre Erkrankungen lassen sich unterteilen in Krankheiten, denen ein muskuläres Problem zu Grunde liegt, wie zum Beispiel Muskeldystrophien (Muskeldystrophie Duchenne, DMD) und Myopathien (Myofibrilläre Myopathie, MFM), und in Erkrankungen aufgrund von Nervenschädigungen, wie zum Beispiel Neuropathien und spastische Paraplegien (SPG).
In den vier Teilen der vorliegenden Arbeit konnte sowohl das genetische wie auch das phänotypische Spektrum von neuromuskulären Krankheiten erweitert werden. Die dafür verwendeten Methoden reichen von der Sanger-Sequenzierung einzelner Gene über Next-Generation Sequencing (NGS)-Panel-Diagnostik, zu Whole Exome Sequencing (WES) und schließlich zu Whole Genome Sequencing (WGS). Zusätzlich wurde cDNA zur Detektion von Veränderungen im Transkriptom sequenziert.
Im ersten Teil wurde der klinische Phänotyp der Seipinopathien erweitert, der jetzt auch amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und multifokale motorische Neuropathie (MMN) beinhaltet. Dafür wurde eine Panel-Analyse durchgeführt, die eine bekannte Mutation in BSCL2 aufdeckte. Aufgrund des hiermit erweiterten Phänotyps der Seipinopathien sollten Mutationen in BSCL2 auch bei anderen Verdachtsdiagnosen, wie ALS oder MMN, berücksichtigt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass in der Diagnostik SPGs und Charcot-Marie-Tooth Erkrankungen (CMTs) eine Überlappung zeigen und bei der Diagnose von Verdachtsfällen Gene aus beiden Krankheitsbereichen berücksichtigt werden sollten. Die Suche mit Hilfe eines Phänotyp-Filters hat sich dabei als erfolgreich erwiesen. Ungelöste Fälle sollten aber in regelmäßigen Abständen neu analysiert werden, da immer neue Gene mit den Phänotypen assoziiert werden.
Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung von DMD-Patienten mit bisher ungeklärtem Genotyp. Durch eine RNA-Analyse des gesamten DMD-Transkripts wurden tief-intronische Mutationen aufgedeckt, die Einfluss auf das Spleißen haben. Durch diese Mutationen wurden intronische Sequenzen als Pseudoexons in die mRNA eingefügt. Diese Mutationsart scheint häufig unter ungeklärten DMD-Fällen zu sein, in unserer Kohorte von 5 DMD-Patienten wurden in zwei Fällen Pseudoexons entdeckt. Eine Besonderheit besteht darin, dass in der RNA-Analyse immer noch ein Rest Wildtyp-Transkript vorhanden war, wodurch die Patienten vermutlich einen milderen Becker-Phänotyp aufweisen. Ein weiterer ungeklärter DMD-Fall konnte durch die Sequenzierung der gesamten genomischen Sequenz aufgeklärt werden. Es wurde eine perizentrische Inversion entdeckt (46,Y,inv(X)(p21.1q13.3). Dies zeigt, dass WGS auch zur Detektion von großen Strukturvariationen geeignet ist.
Im dritten Teil wurden Spleißmutationen untersucht. Spleißmutationen wurden bisher nicht in TMEM5-assoziierter alpha-Dystroglykanopathie beschrieben und somit als neue Mutationsart für diese Erkrankung nachgewiesen. Dabei wurde auch die funktionelle Exostosin-Domäne in TMEM5 bestätigt. Eine RNA-Untersuchung verschiedener Spleißmutationen zeigte, dass Spleißmutationen häufig zu einem veränderten Transkript führen, auch wenn diese Mutationen weiter von der Konsensussequenz entfernt sind. Spleißmutation sollten daher häufiger in der Diagnostik berücksichtig und überprüft werden.
Im letzten Teil wurde eine strukturierte Diagnostik von MFM-Patienten beschrieben und neue Kandidaten-Gene für MFM vorgestellt. Es ist zu vermuten, dass auch Mutationen in Genen, die bisher für Kardiomyopathien, Kollagen Typ VI-Myopathien und Neuropathien beschrieben sind, einen MFM-Phänotyp verursachen können. Diese Ergebnisse erweitern das genetische Spektrum der MFM, was sich auf die Diagnostik dieser Erkrankungen auswirken sollte.
Im Laufe dieser Arbeit konnten damit die neuromuskulären Erkrankungen vieler Patienten genetisch geklärt werden. Neue Phänotypen und genetische Ursachen wurden beschrieben und es wurde gezeigt, dass sich WGS technisch für die Diagnostik, auch zur Detektion von großen Strukturvarianten, eignet.
Zur Wahrung der Genomstabilität entwickelten sich verschiedene Reparaturmechanismen, deren Defekte zu diversen Erkrankungen führen. Der 1927 erstmals beschriebenen Fanconi Anämie (FA) (Fanconi 1927) liegt eine fehlerhafte Reparatur der DNA-Doppelstrang-Quervernetzung zugrunde. Als Ursache wurden Defekte innerhalb des FA/BRCA-Weges lokalisiert, welche zur Chromosomeninstabilität führen. Das Krankheitsbild der autosomal rezessiven oder X-chromosomalen Erkrankung wird meist von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarkversagen sowie bereits im jugendlichen Alter erhöhten Tumor-raten und Anämien geprägt. Bisher wurden Defekte in 19 verschiedenen Genen als ursächlich für diese Erkrankung diskutiert. Anhand des betroffenen Gens können nur begrenzt Rückschlüsse auf die Ausprä-gung des Phänotyps geschlossen werden, vielmehr scheinen die Art der Mutation und deren Position im Gen mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Im Laufe der Zeit wurden immer mehr Patienten mit mild ausgeprägtem Erkrankungsbild beobachtet. Eine mögliche Erklärung hierfür liefern milde Mutationen, eine weitere das Vorhandensein von Mosaiken blutbildender Zellen. Zu letzterem führt die Reversion einer der beiden Mutationen. Diese Art der „natürlichen Gentherapie“ wurde bei 10-30% der FA-Patienten beobachtet. Um die Entwicklung von Reversionen besser zu verstehen, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit die Untersuchung verschiedener Zelllinien von 5 Patienten im Alter von 11 (Pat. 5) bis 33 (Pat. 4) Jahren. Die FA-A-Patienten 1 und 2 wurden bereits von Gross et al. 2002 als Mosaikpatienten beschrieben. Für die weiteren Patienten führten unterschiedliche Aspekte, wie normale Blutwerte, MMC-tolerante lympho-blastoide Zelllinien und gDNA-Analysen des Blutes zum Mosaikverdacht. Nähere Analysen bestätigten für die FA-D2-Patienten (Pat. 4, 5) ebenfalls das Vorliegen einer Reversion in den Blutzellen. Allen Patienten gemein war die Reversion in Form einer Rückmutation (Pat. 1: c.971T>G, Pat. 2: c.856 C>T, Pat. 4: c.3467-2A>G, Pat. 5: c.3707G>A), welche meist in einem oder in der Nähe eines Mutationsmotives vorlag. Zur Einschätzung des Mosaikstatus in den Patientenblutzellen wurden, neben der meist mehrjährigen Be-obachtung der Blutwerte (Thrombo-, Mono-, Granulo-, Lymphozyten, Hämoglobin), gDNA-, Chromoso-menbruch- und Zellzyklusanalysen durchgeführt. Chromosomenbruchanalysen von Metaphasen der T-Lymphozyten der Patienten 4 und 5 zeigten nach MMC-Behandlung die mosaik-typische bimodale Vertei-lung der Chromosomenbruchraten. Die nur moderat erhöhten Bruchraten in Metaphasen des Patienten 1 sprachen für eine starke Reversion. Zur besseren Abschätzung des Mosaikstatus wurden Zellzyklusanaly-sen an Mischungsreihen aus FA- und nicht FA- Blut durchgeführt. Die Detektionsgrenze für FA-Mosaike lag bei einem Anteil von 30% Zellen mit spontanem/MMC-induziertem G2-Phasen-Arrest. In Anlehnung an Mischungskurven wurden für die vier Patienten Reversionen von 0% (Pat. 4) bis 90-95% (Pat. 2) ange-nommen. Die gDNA-Analyse MACS-sortierter T-/B-Lympho-, Mono- und Granulozyten sowie von Fib-roblasten und lymphoblastoiden Zelllinien ermöglichte einen detaillierten Einblick in die Mosaikstatus auf molekularer Ebene. Wir fanden bei allen Patienten einen unterschiedlich stark ausgeprägten Mosaikstatus ihrer Blutzellreihen. Tendenziell scheinen die Reversionsgrade mit der Zell-Lebensdauer korrelieren, hier-bei zeigen kurzlebige Zellen (Mono-, Granulo-, B-Lymphozyten) höhere Reversionsgrade als langlebige T-Lymphozyten. Das Auftreten von gleichen Reversionen in allen Zelllinien lässt eine Reversion in einer gemeinsamen Vorläuferzelle vermuten. Als Besonderheit fanden wir, unseren Erachtens erstmalig, eine komplette Reversion einer Knochenmark-Fibroblastenzelllinie (Pat. 1). Häufig in Kultur stattfindende Re-versionen in lymphoblastoiden Zelllinien beobachteten wir für alle vier Patienten. Die Mosaikentstehung im Patientenblut konnte mit allen Methoden bestätigt werden. Jede Methode wies Vor- und Nachteile auf. Zur Abschätzung der Mosaikstatus empfiehlt sich deshalb eine Kombination der Methoden.
Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit Interaktionen des FANCO (RAD51C) innerhalb der RAD51 Paraloge (RAD51B, -C, -D, XRCC2, XRCC3) und mit RAD51. Die Analysen erfolgten im Mammalian Two- und Three-Hybrid (M2H/M3H) System. Die Untersuchungen bestätigten die meisten der bisher detektierten Interaktionen, welche zur Ausbildung des RAD51C-XRCC3 Komplexes und des, aus den Subkomplexen RAD51B-RAD51C (BC) und RAD51D-XRCC2 (DX2) bestehenden, BCDX2-Komplex führen. Die M3H-Analysen weisen auf eine wichtige Rolle des RAD51B-Proteins bei der Ausprägung dieses Komplexes hin. Es scheint die Ausbildung der RAD51C-RAD51D-Interaktion erst zu ermöglichen und zusätzlich, anders als bisher beobachtet, auch mit XRCC2 zu interagieren. Diese Interaktion wiederum wird durch die Anwesenheit von RAD51D stark gefördert. Unsere M2H-/M3H-Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Ausbildung der Subkomplexe für die Entstehung des BDCX2-Komplexes wichtig ist und dieser vermutlich als Ringstruktur vorliegt. Zusätzlich fanden wir Hinweise auf mögliche Wechselwir-kungen zwischen den BCDX2- und den XRCC3-Komplexproteinen. Aufgrund der Beteiligung der Protei-ne an der Doppelstrangläsionsreparatur wurde die Auswirkung von MMC-induzierten DNA-Schäden un-tersucht. Diese führten innerhalb der Subkomplexe zu gegensätzlichen Änderungen der Interaktionsinten-sität. Während die Substanz im DX2-Komplex zum Sinken der Interaktionsstärke führte, erhöhte sich diese im BC-Komplex. Die in der Literatur beschriebene und charakterisierte RAD51C-FANCN-Interation war im M2H-Test nicht darstellbar. Möglicherweise würde diese jedoch durch die Anwesenheit eines drit-ten Proteins gefördert werden. Zusätzlich wurde ein RAD51C-Protein, welches die Patientenmutation R258H enthielt, überprüft. Es zeigte nur in der M3H-Analyse, mit pMRAD51D und nativem RAD51B, nach Behandlung mit MMC eine reduzierte Interaktionsstärke im Vergleich zum Wildtyp. Dies unter-streicht einmal mehr die als hypomorph beschriebene Mutation des Proteins.
Das dritte Projekt, die angestrebte Strukturaufklärung des RAD51C-Proteins erwies sich als schwierig. Eine für eine Kristallisation ausreichende Proteinmenge konnte, weder im E. coli-System noch in Insektenzellen oder in Co-Expression mit seinem Interaktionspartner XRCC3, isoliert und aufgereinigt werden. Elektro-phoretische Mobility Shift Assays des CX3-Proteinkomplexes mit DNA-Strukturen (ssDNA, Open Fork, 3‘-/ 5‘-Überhang-Struktur), zeigten eine Bevorzugung des 3‘-Überhang-DNA-Substrates. Diese Art der Analyse könnte in weiterführenden Analysen zur Abschätzung der Auswirkung von Patientenmutationen herangezogen werden. bb
Der vWF ist ein sehr großes Protein, das im Plasma als Multimer vorliegt und an der Blutgerinnung beteiligt ist. Der Größe entsprechend handelt es sich um ein Protein, das zahlreiche Funktionen bei diesem Prozess übernimmt. Genauso vielfältig können sich auch unterschiedliche Defekte des vWF auf die Hämostase auswirken. Die genetische Analyse der zu Grunde liegenden Defekte kann bei der Diagnose der von-Willebrand-Erkrankung aber auch bei der Therapie zusätzliche Informationen liefern. Ziel dieser Arbeit war es, die Mutationen im vWF-Gen zweier Patienten auf cDNA-Ebene nachzuweisen und diese in Zusammenhang mit ihrem klinischen Erscheinungsbild und den Laborparametern zu stellen. Zu diesem Zweck wurde Thrombozyten-RNA der Patienten isoliert, durch RT-PCR in cDNA umgeschrieben und sequenziert. Bei Patient 1, der eine milde Klinik aufweist, fanden sich die nicht-gekoppelten Mutationen p.R760C und p.R854Q, die bereits von Casonato und Mitarbeitern 2007 beschriebenen wurden. Im Gegensatz zu den dort festgestellten quantitativen und funktionellen Veränderungen des vWF resultiert bei unserem Patienten ein rein quantitativer Defekt. Eine de novo Mutation könnte bei Patient 1 Ursache eines somatischen Mosaiks und damit des milden Phänotyps sein. Bei Patientin 2 fand sich ein Basenaustausch von Adenin nach Thymin an der Transkript-Position 3437 (c.3437A>G). Im Gegensatz zu dem von Goodeve et al. 2007 beschriebenen Patienten mit der von-Willebrand-Erkrankung vom Typ 1, der genau diese Mutation zeigte 51, konnte bei unserer Patientin keine weitere Mutation im vWF-Gen festgestellt werden. Diese Mutation alleine führt jedoch auch zu der von-Willebrand-Erkrankung vom Typ 1, die sich in einer Verringerung der vWF-Menge, also einem quantitativen Defekt, äußert. Die Etablierung der RNA-Isolation und cDNA-Synthese aus Plättchen konnte darüber hinaus eingesetzt werden, um spezifische Transkripte in Plättchen nachzuweisen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass für die massenspektrometrisch in Plättchen nachgewiesene Metalloendopeptidase Nardilysin auch das Transkript detektiert werden kann. Durch RT-PCR konnte belegt werden, dass die mRNA der beiden Isoformen NRD1-001 und NRD1-002 in Thrombozyten vorkommt.
Seit der Entdeckung des ersten Gens für den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schlüssel-Enzym für die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zusätzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anfällt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen führen zu einem signifikanten Effekt auf die benötigte Coumarin-Dosis und die Stabilität der Hämostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1“ (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit völlig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellulären Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein können. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke Ähnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivität, wobei die Affinitäten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich höher sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen führt in beiden Proteinen zu einem fast vollständigen Verlust der Aktivität. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 – wie VKORC1 – in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine ähnliche Struktur, die gleiche zelluläre Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivität hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen könnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out Mäusen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem für Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als Köder 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferhäufigkeit und funktioneller Überlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpräzipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation näher untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke Überschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies könnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, führt aber auch zu neuen Hypothesen bezüglich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1“ (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals Würzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein“ (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP führen zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die Ähnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch überhöhte Dosierung von Coumarinen während der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpräzipitationsexperimenten nicht bestätigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bedürfen weiterführender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen wäre auch eine kritische Betrachtung der übrigen 85 primären Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll.
Zusammenfassung: Hintergrund: Mit einer Lebenszeitprävalenz von 1 % und einem Ersterkrankungsalter in der frühen Adoleszenzperiode verursachen Schizophrenien (SCZ) und bipolare Störungen (BPD) großes individuelles Leid. Die genetische Komponente beider Erkrankungen liegt mit einer Heritabilität von bis zu 80 % im Vergleich zum Anteil von Umweltfaktoren sehr hoch. Aufgrund seiner Lage auf dem Locus 12q22-24, einem Hot spot für SCZ und BPD, stellt DYNLL1 ein interessantes positionales Kandidatengen dar. Das Protein, eine 8 kD schwere leichte Dyneinkette ist ein multifunktionales Protein. Durch seine Funktion als Inhibitor von NOS-I, seiner Beteiligung am postsynaptischen NMDA-Proteinkomplex, einer möglichen Interaktion mit NUDEL/DISC1, seiner Ähnlichkeit zu KIF2 und nicht zuletzt wegen der Interaktion mit KIBRA stellt DYNLL1 auch aufgrund seiner Funktion ein relevantes funktionelles Kandidatengen für beide Erkrankungen dar. Methoden: In einer Fall-Kontrollstudie wurden daher sechs Single nucleotid polymorphismen (SNPs) und deren entsprechenden Haplotypen bei 284 Kontrollen, 246 Patienten, die an einer SCZ und 90 Patienten, die an einer BPD litten analysiert, um eine Assoziation dieses Gens mit den entsprechenden Phänotypen zu untersuchen. Ergebnisse: Es zeigte sich eine Assoziation des Markers rs787828 mit SCZ, darüber hinaus eine signifikante Assoziation eines Haplotyps (TTATAG), letztere allerdings nur mit einer Frequenz von 1%. Bei der bipolaren Störung waren dagegen sowohl zwei Polymorphismen (rs1167705 und rs580016), als auch ein Haplotyp (TTGTAG) signifikant mit der Erkrankung assoziiert. Aufgrund der kleineren Stichprobengröße ist es jedoch wichtig, diesen Befund nochmals zu replizieren, um falsch positive Befunde auszuschließen. Zusammenfassung: Sowohl SNPs als auch Haplotypen im DYNLL1 Gen zeigten Assoziationen mit Schizophrenie und der bipolaren Störung, was die These unterstützt, dass DYNLL1 ein relevantes Kandidatengen für beide Erkrankungen ist. Um die Bedeutung von DYNLL1 in der Pathophysiologie der SCZ und der bipolaren Störung weiter aufzuklären, müssen die assoziierten Varianten bezüglich möglicher Auswirkungen auf Genexpression, Proteinfunktion und physiologische Parametern hin weiter untersucht werden.
Die primäre Gonarthrose ist ein komplexer, multifaktoriell bedingter Krankheitsprozess mit genetischer Komponente und gilt aufgrund ihrer epidemiologischen und sozioökonomischen Bedeutung als Volkskrankheit. Die Gene bzw. Proteine der Wnt- Familie spielen eine wichtige Rolle in der komplexen Regulation der Morphogenese, der Zelldifferenzierung , -proliferation und der Homöostase von Knochen und Knorpel. LRP 1 und LRP 5 fungieren als Co-rezeptoren des Wnt- Signalweges. In der vorliegenden Untersuchung wurden der A217V Polymorphismus des LRP 1 Gens und der A1330V Polymorphismus des LRP 5 Gens auf eine signifikante Assoziation mit dem Auftreten primärer Gonarthrose in einem arthroskopisch definierten Patientenkollektiv untersucht. Ziel der Studie war es, klar definierte Kollektive mit möglichst extremen Zuständen gegenüberzustellen und eine hochspezifische und hochsensitive Diagnostik zu verwenden. Junge, bereits in frühen Jahren an Gonarthrose erkrankte Patienten (<45 Jahre, Gruppe 1, n= 100) wurden älteren Patienten (>55 Jahre, Gruppe 3, n= 103), die nicht an Gonarthrose erkrankt waren, gegenübergestellt. Als weitere Gruppe dienten Patienten, welche eine endoprothetische Versorgung bei fortgeschrittener Gonarthrose erhielten (>55 Jahre, Gruppe 2, n= 86). Die Diagnose der primären Gonarthrose wurde anhand anamnestischer Daten sowie arthroskopischer bzw. direkt visuell erhobender Befunde im Rahmen der Arthrotomie bei Prothesenimplantation gestellt. Der Arthroseausschluss (Gruppe 3) erfolgte ebenfalls arthroskopisch. Methodisch wurden der WOMAC- Score, die Restriktions- Fragment- Längen- Polymorphismus (RFLP) Analyse sowie die Gensequenzierung angewendet. Die Allelverteilung der untersuchten Polymorphismen von LRP 1 und LRP 5 konnte zwischen den beiden gegenübergestellten Gruppen 1 und 3 keinen signifikanten Unterschied aufweisen. Für den LRP 5 A1330V Polymorphismus ergab sich ein signifikanter Unterschied (p< 0,05) zwischen den Gruppen 2 und 3. Dies kann als Hinweis auf eine mögliche arthrosefördernde oder auch protektive Funktion dieses Polymorphismus gewertet werden. Im Vergleich der Extremkollektive (Gruppe 1 vs. Gruppe 3) deutet sich lediglich ein Trend an (p= 0,067), so dass eine Assoziation des A1330V Polymorphismus des LRP 5 Gens mit primärer Gonarthrose erst durch weitere Untersuchungen mit höherer Fallzahl eindeutig bestätigt bzw. widerlegt werden kann.
In dieser Arbeit wurde die systematische Suche nach krankheitsassoziierten Genen bei periodischer Katatonie fortgeführt. Für diese Erkrankung war die klinische Abgrenzbarkeit und die familiäre Häufung signifikant und ließ aufgrund der vertikalen Transmission und dem Auftreten über mehrere Generationen und hinweg auf einen Hauptgeneffekt schließen. Nach der Durchführung von Kopplungs-Analysen kristallisierten sich zwei koppelnde Regionen auf den Chromosomen 15 und 22 heraus. Mittels Haplotypanalyse konnte der Genort auf Chromosom 22q13 auf einen knapp 5 Mbp großen Bereich eingeschränkt werden. Im kodierenden Bereich des MLC1-Genes segregierte im mit periodischer Katatonie assoziierten Haplotyp eine Variante (p.Leu309Met). Da Mutationen im MLC1-Gen bereits im Zusammenhang mit Megalenzephaler Leukoenzephalopathie beschrieben worden waren, wurden in dieser Arbeit zunächst fünf Patienten mit dieser Erkrankung auf Mutationen in kodierenden Bereichen von MLC1 systematisch untersucht. Daran schloss sich eine Analyse dieses Gens bei 140 Patienten mit periodischer Katatonie an. Ein Zusammenhang zwischen Mutationen in MLC1 und dem Auftreten von Megalenzephaler Leukoenzephalopathie wurde untermauert, wohingegen die Ergebnisse eindeutig gegen eine Assoziation mit periodischer Katatonie sprachen. Ein weiteres im Gehirn exprimiertes Kandidatengen (KIAA0767/DIP) wurde in dieser Arbeit untersucht. Dabei wurden sechs SNPs im exonnahen intronischen Bereich entdeckt sowie eine Variante im Exonbereich (p.Glu156Asn). Dies ist eine seltene Normvariante, eine Assoziation zur periodischen Katatonie wurde in einer Fall-Kontroll-Studie ausgeschlossen. Insgesamt wurde durch die systematische Mutationsanalyse die Kandidatenregion auf Chromosom 22q13.3 weiter eingeengt. Gegen einen Zusammenhang zwischen MLC1 und periodischer Katatonie sprechen die vorgestellten validen Ergebnisse.
Die X-gebundene Myotubuläre Myopathie (XLMTM) ist eine sehr seltene und schwere angeborene Muskelschwäche, die durch Mutationen im MTM 1 Gen verursacht wird. In der histopathologischen Untersuchung ist auffällig, dass die Muskelfasern fetalen Myotuben ähneln. Das Gen MTM 1 wurde auf Xq28 lokalisiert und kodiert für das Protein Myotubularin. Die Myotubularine stellen eine große Familie eukaryotischer Lipid-Phosphatasen und Anti-Phosphatasen dar. Da der direkte Nachweis von Myotubularin in Muskelbiopsien von Patienten aufgrund der sehr niedrigen Expression nicht gelingt, weder durch immunhistochemische Methoden noch im Western-Blot oder durch einen spezifischen Enzymtest, steht ein funktioneller Test für die gefundenen Genmutationen nicht unmittelbar zur Verfügung. In der Arbeit sollte versucht werden, zunächst Wildtyp-Myotubularin im bakteriel-len System zu exprimieren, im Western-Blot nachzuweisen und die Phosphatase-Enzymaktivität in vitro zu messen. Als Substrat für Myotubularin wurde p-Nitrophenolphosphat verwendet. In der Durchfüh-rung des experimentellen Teils zeigten sich verschiedene Probleme, aus denen sich jedoch interessante Schlüsse ziehen liessen. Zum ei-nen konnte der Verdacht bekräftigt werden, dass Myotubularin keine Dual-spezifische Phosphatase ist, wie zunächst angenommen wurde. Problematisch war auch, dass der E.coli M15 Bakterienstamm an-scheindend selbst so viele eigene Phosphatasen produzierte, die das Substrat p-Nitrophenolphosphat dephosphorylierten. Diese Hintergrundgrundaktivität störte die eigentliche Aktivitätsmessung des Myotubularins und machte diese kaum verwertbar. Ebenso zeigte sich, dass das Myotubularin in dem untersuchten bakteriellen System nicht in größeren Mengen exprimiert wurde. Letzendlich ergab dies die Schlussfolgerung, dass zukünftige Untersuchungen berücksichtigen sollten, dass eukaryontische Expressionssysteme sich offensichtlich besser für die Mitglieder der Genfamilie der Myotubularine eigenen und dass Myotubularine Lipidphopshatasen sind mit in vivo sehr spe-zifischen Substraten (Phopshatidyl-Inositolphosphate). Jedes artifizielle Substrat sollte diese natürlichen Strukturen möglichst nachahmen.
Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-Stämmen zu treffen, fällt häufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen Stämmen gefunden werden können. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren“ auf. Dazu gehören verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten lässt daher Rückschlüsse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen ökologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizelluläre Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Phänotyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsfähigkeit gegenüber anderen kommensalen E. coli erhöht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabhängig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen möglichen übergeordneten Regulator dieses Phänotyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht dafür bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. Während die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberflächenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colansäure, LPS) einen veränderten Phänotyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten Fällen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abhängig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine für die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die Stämme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel führte zur Aufhebung des zytopathischen Phänotyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abgetötete Bakterien oder Kulturüberstände zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Domänen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher Stärke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erhöhte Transkription oder Promotoraktivität einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabhängigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabhängigkeit konnte durch die Induktion bzw. Überexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schlüsselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem möglichen Regulator clbR nicht überwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivität einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zurückgeführt, welches über CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die natürliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis für einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und könnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen.