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Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an die verschiedensten Wirtsnischen unterstützen. Eine für die Pathogenität von C. albicans wichtige Eigenschaft ist die Bildung sekretorischer Aspartylproteasen (SAPs), die durch eine große Familie homologer Gene codiert werden. Es wird angenommen, dass die individuellen Proteasen während der Infektion verschiedene Aufgaben erfüllen bzw. optimal an unterschiedliche Wirtsnischen angepaßt sind. Jedoch ist der Beitrag der einzelnen SAP-Gene zur Pathogenese noch weitgehend unverstanden. Da die wirtsinduzierte Aktivierung dieser Virulenzgene während bestimmter Infektionsstadien Hinweise auf ihre spezifische pathogenetische Bedeutung liefern könnte, wurde in dieser Arbeit eine Methode für C. albicans entwickelt, mit der die Induktion eines Gens während der Infektion nachgewiesen werden kann. Die Methode beruht auf einer genetischen Rekombination als Reporter einer Genexpression, was bedeutet, dass nach Induktion des zu untersuchenden Gens eine site-spezifische Rekombinase spezifisch einen Mykophenolsäure-Resistenzmarker aus dem Genom der Zelle entfernt. Da diese Deletion ein irreversibles Ereignis darstellt, das auf die jeweiligen Nachkommen vererbt wird, kann selbst eine vorübergehende Genaktivierung während eines bestimmten Infektionsstadiums bzw. in einem bestimmten Organ in einzelnen Zellen nach deren Reisolierung aus infiziertem Gewebe durch Ausplattieren auf geeignetem Indikatormedium nachgewiesen werden. Durch Analyse der Expression des SAP2-Gens wurde bestätigt, dass mit diesem Reportersystem eine biologisch signifikante Genaktivierung in C. albicans nachgewiesen werden kann. SAP2 wird in C. albicans in vitro in einem Medium induziert, das Rinderserumalbumin als alleinige Stickstoffquelle enthält, ist in anderen gängigen Labormedien jedoch reprimiert. Diese in vivo-Expressionstechnologie (IVET) wurde verwendet, um die Expression von sechs verschiedenen SAP-Genen von C. albicans, SAP1-SAP6, in unterschiedlichen Tiermodellen zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Proteasegene abhängig von der Art der Infektion, d.h. lokal begrenzte Schleimhautinfektion bzw. Systeminfektion, und auch vom Infektionsstadium differentiell reguliert werden. Dabei wurden sogar die äußerst homologen Gene SAP4-SAP6, die aufgrund von in vitro erzielten Ergebnissen als hyphenspezifische Gene galten, in vivo unterschiedlich reguliert. SAP5 und SAP6, aber nicht die anderen SAP-Gene, wurden in einem Maus-Ösophagus-Schleimhautmodell signifikant aktiviert, als die C. albicans-Hyphen in das Epithel invadierten. Eine stadienspezifische Expression der SAP-Gene wurde in einem Maus-Peritonitis-Modell beobachtet. Kurz nach Inokulation der C. albicans-Hefezellen in die Bauchhöhle der Tiere, zu einem Zeitpunkt, als noch keine Ausbildung von Hyphen zu beobachten war, wurde SAP5, aber nicht SAP6 oder eines der anderen analysierten SAP-Gene in einem signifikanten Anteil der infizierenden Zellen aktiviert. Demzufolge scheint SAP5 für die Gewebeinvasion während der Schleimhautinfektion und auch für die ersten Schritte während einer disseminierenden Infektion von Bedeutung zu sein. Durch die intravenöse Infektion der Maus, bei der frühe Infektionsschritte umgangen werden, wurde gezeigt, dass SAP5 und SAP6, aber auch SAP4, während der späteren Stadien einer disseminierenden Infektion weiterhin aktiviert werden. Dagegen wurde eine Induktion des SAP2-Gens vorwiegend im Spätstadium einer systemischen Infektion beobachtet, nachdem die Pilzzellen innere Organe befallen hatten. Daher fördert SAP2 vermutlich weniger die Invasion von Geweben, dafür aber die Vermehrung der Pilze nach Organbefall, möglicherweise durch die Bereitstellung von Nährstoffen. Dabei wurde gezeigt, dass die in vivo-Regulation von SAP2 durch bestimmte Repeatstrukturen innerhalb der Promotorregion dieses Gens beeinflußt wird. Während des Verlaufs einer systemischen Infektion wurden sogar die zwei SAP2-Allele des hier untersuchten C. albicans-Modellstammes CAI4, die sich in dieser Repeatregion unterscheiden, differentiell reguliert. Das SAP2-2-Allel wurde nämlich bereits deutlich früher induziert als das Allel SAP2-1. Eine Expression von SAP1 und SAP3 konnte im Gegensatz zu den anderen SAP-Genen nur in wenigen der infizierenden Zellen nachgewiesen werden, so dass diesen Genen ein Beitrag zur Pathogenität in den hier untersuchten Infektionsmodellen nicht beigemessen werden kann. Im Verlauf einer Infektion setzt C. albicans vermutlich viele verschiedene Virulenzfaktoren gleichzeitig für eine bestmögliche Anpassung an die jeweilige Wirtsnische ein. Ob in Abhängigkeit entsprechender Wirtssignale dabei unterschiedliche Eigenschaften der Pilzzelle koordiniert reguliert werden, ist kaum erforscht, erscheint jedoch für ein besseres Verständnis der Erreger-Wirts-Auseinandersetzung von besonderem Interesse. An der Kontrolle der Hyphenbildung von C. albicans sind wenigstens zwei Signaltransduktionskaskaden beteiligt, eine MAP-Kinase-Kaskade und ein cAMP-abhängiger Signalweg, die in den Transkriptionsregulatoren CPH1 bzw. EFG1 enden. Nachdem dimorphes Wachstum für die Infektion von Bedeutung ist und die Expression der Gene SAP4-SAP6 in vitro mit der Hyphenwachstumsphase verbunden ist, wurde eine mögliche Abhängigkeit hyphenassoziierter SAP-Aktivierung von diesen Regulatoren durch die Analyse der SAP5-Expression in entsprechenden Mutanten analysiert. Sowohl in cph1- als auch in efg1-Einzelmutanten wurde eine reduzierte Aktivierung des SAP5-Gens in vivo beobachtet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl CPH1 als auch EFG1 zur SAP5-Aktivierung während der Infektion beitragen. Da cph1-Mutanten im infizierten Gewebe wie der Wildtyp-Stamm Hyphen ausbildeten, war die Hyphenbildung allein offensichtlich nicht für eine volle SAP5-Aktivierung in vivo ausreichend. Andererseits war die SAP5-Induktion in vivo nicht von der Hyphenwachstumsphase abhängig, da eine verminderte, aber dennoch signifikante SAP5-Expression auch in den efg1-Mutanten zu beobachten war, die in den infizierten Tieren nur in der Hefephase wuchsen. In Zellen, in denen beide Regulatoren fehlten, konnte eine Induktion von SAP5 kaum nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass diese Signalwege in C. albicans für die Kontrolle verschiedener zellulärer Programme während der Infektion wichtig sind und die Expression von unterschiedlichen Virulenzgenen koordinieren. Durch die in vivo-Analyse der Virulenzgenexpression in C. albicans konnten Einblicke in regulatorische Anpassungsmechanismen dieses Mikroorganismus an verschiedene Wirtsnischen gewonnen werden. Einzelne Mitglieder einer Virulenzgenfamilie dieses Pilzes werden während der Infektion differentiell und in Abhängigkeit vom Infektionsstadium reguliert und tragen daher vermutlich sehr spezifisch zur Pathogenese bei. Unterschiedliche Virulenzmerkmale können zudem während der Infektion koordiniert reguliert werden und dadurch gemeinsam die Anpassungsfähigkeit von C. albicans an den Wirt unterstützen. Die erzielten Erkenntnisse sollten letztlich dazu beitragen, die Pathogenität dieses wichtigen opportunistisch humanpathogenen Erregers besser verstehen zu können.
Obwohl inzwischen über 200 verschiedene Serogruppen von V. cholerae bekannt sind, wurden Ausbrüche der Cholera hauptsächlich von Stämmen der unbekapselten Serogruppe O1 und der bekapselten Serogruppe O139 verursacht. Die Komponenten des Lipopolysaccharids (LPS) von O1 und O139, sowie die Kapsel von O139 tragen zur Kolonisierung im Gastrointestinaltrakt bei. Um die Funktion des LPS und der Kapsel als Virulenzfaktor näher zu untersuchen, wurden Adhäsionsstudien mit definierten LPS- und/ oder Kapsel-Mutanten beider pathogener Serogruppen durchgeführt. Dazu wurde die Mukus-produzierende humane Darmzelllinie HT-29-Rev MTX verwendet. Im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp (Wt) konnte für eine O Antigen-Mutante von O1 eine Reduktion um 85%, für eine O Antigen/ Kapsel-Mutante von O139 eine Reduktion um 70% in der Adhäsionsrate festgestellt werden. Ein Beitrag von ToxR regulierten Genprodukten ist ebenfalls möglich. Weiterhin wurden mit WavJ und WavD zwei Genprodukte der Kernoligosaccharid -Biosynthese charakterisiert, welche bislang nur in dem wa*-Genclustertyp 1 der klinischen Isolate nachgewiesen worden sind. Es konnte gezeigt werden, dass beide Genprodukte an der Biosynthese des Kern OS beteiligt sind, wobei WavJ mit hoher Wahrscheinlichkeit die Heptosyl-IV-Transferase darstellt. Die wavDJ-Doppelmutanten beider Serogruppen wiesen eine erhöhte Sensitivität gegenüber Novobiocin auf. Dagegen konnte eine Attenuation der Mutanten im Mausmodell nur für die Serogruppe O139 demonstriert werden. Ein Schlüsselenzym der LPS-Biosynthese stellt die Oberflächenpolymer:Lipid A-Kern OS-Ligase (WaaL), kurz O Antigen-Ligase genannt, dar. In dieser Arbeit wurden die in der Primärstruktur stark unterschiedlichen Ligasen aus einem pathogenen (P27459) und apathogenen (V194) V. cholerae Isolat strukturell und funktionell analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität beider Ligasen von der Anwesenheit eines N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Kernoligosaccharid abhängig ist. Dieser Zucker wird durch das Genprodukt WavL transferiert, welchem in dieser Arbeit die Aktivität einer N-Acetylglucosaminyltransferase zugeordnet werden konnte. Das Gen wavL wurde in allen zur Verfügung stehenden V. cholerae Isolaten nachgewiesen und stellt wahrscheinlich eine generelle Voraussetzung des Kern OS für eine O Antigen-Anheftung dar. Im Gegensatz dazu, diskriminiert die An- bzw. Abwesenheit einer Galaktose (Gal) im Kern OS die Spezifität der Ligasen von V. cholerae P27459 bzw. V194. Dabei ist die Aktivität der Galaktosyltransferase WavM, essentiell für die Aktivität der Gal-abhängigen Ligase von V194. Die Gal-unabhängige Ligase von P27459 wird hingegen durch die Anwesenheit von Gal im Kern OS inhibiert. Hybridfusionen der beiden Ligasen deuten an, dass die Erkennungsdomäne für Gal in der C-terminalen Hälfte lokalisiert ist. Erstmals wurde die Topologie einer Ligase durch PhoA- und LacZ-Fusionen analysiert. Die Suche nach konservierten Aminosäuren (AS) in verschiedenen Ligasen führte zur Identifizierung der Motive R(X3)L und H(X10)G in zwei periplasmatischen Schleife. Ein Austausch des R oder des H in diesen Motiven führte zum Verlust der Ligase-Aktiviät von WaaL aus V. cholerae und S. enterica. Damit geben diese Motive einen ersten Hinweis auf das aktive Zentrum des Enzyms. Desweiteren wurde nach möglichen O Antigen-Transportern bei V. cholerae gesucht, welche bislang noch nicht identifiziert worden waren. Über die Anpassungen von V. cholerae an aquatische Ökosysteme, insbesondere hinsichtlich der wechselnden Osmolarität, ist nahezu nichts bekannt. Durch ein in dieser Arbeit konstruiertes und etabliertes Transposonsystem konnten 3600 Mutanten erzeugt und auf Wachstumsdefekte unter hypertonischen Bedingungen untersucht werden. Eine dieser osmosensitiven Mutanten wies eine Insertion in dem Locus VCA0565 auf, welcher für eine putative Sensor-Histidinkinase kodiert. Mit dem Regulator, kodiert durch VCA0566, stellt VCA0565 das putative Zwei-Komponentensystem OsmRK dar. Transkriptomanalysen von osmR/ K-Mutanten lieferten keine Erklärung des Wachstumsdefekts unter hypertonischen Bedingungen, zeigten aber eine Vernetzung der durch OsmR/ K regulierten Gene mit dem ToxR-Regulon auf. Analysen der Außenmembran demonstrierten, dass eine Mutation von osmR/ K zu einer Repression von OmpU unter hohen Salzkonzentrationen führt. Vergleichende Experimente mit weiteren Mutanten deuteten an, dass es in osmR/ K- und toxS-Mutanten unter erhöhten Salzkonzentrationen zur Degradation von ToxR kommt. Während die Deregulation von OmpU in osmR/ K-Mutanten nur unter Salzstress zu beobachten war, führte in der toxS-Mutante auch ein Membranstress durch Zugabe von Protamin zu einer Repression von OmpU. Die zu OsmR/ K nah verwandten putativen Zwei-Komponentensysteme EnvZ/ OmpR und VCA0257/ VCA0256 hatten unter keiner der getesteten Bedingungen einen Einfluss auf die Proteine der AM. Weiterhin wurde eine C-terminale Degradation von HutA unter hypertonischen Bedingungen aufgedeckt.
Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, ist ein Gram-negatives, fakultativ pathogenes Bakterium. In dieser Arbeit konnte die V. cholerae Oberflächenstruktur identifiziert werden, an die der temperente V.cholerae-Phage K139 adsorbiert. Phagenbindungs-Studien mit gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) ergaben, daß das O-Antigen der Serogruppe O1 den Phagenrezeptor darstellt. Zusätzlich wurden phagenresistente Mutanten des transluzenten O1 El Tor Inaba Stammes P27459 nach Inkubation mit einem lytischen K139-Derivat isoliert. Analysen des LPS-Laufverhaltens in Polyacrylamid-Gelen (PAA) zeigten, daß viele der Spontanmutanten defekte LPS-Moleküle synthetisierten, die entweder im O-Antigen, im Kernoligosaccharid oder in beidem betroffen waren.Phagenresistente Mutanten mit offensichtlich unverändertem LPS bildeten entweder transluzente oder opake Kolonien. Weiterhin wurden ausgewählte spontan phagenresistente Stämme genetisch analysiert. O-Antigen Mutanten wurden in Southernblot-Analysen mit spezifischen, gegen das bereits gut charakterisierte O-Antigen-Biosynthese-Gencluster (rfb) gerichtete Sonden untersucht. Zwei der O-Antigen negativen Stämme waren durch Insertion des IS-Elementes IS1004 in das rfb-Gencluster entstanden. Spontan phagenresistente Mutanten mit verändertem Kernoligosaccharid ohne O-Antigen (R-LPS-Mutanten) sind wahrscheinlich im Kernoligosaccharid-Biosynthese-Gencluster (waa) mutiert, das in der V. cholerae Datenbank identifiziert wurde. waaF, das für die Heptosyl-II-Transferase kodiert, wurde durch genetische Manipulation inaktiviert und zeigte im PAA-Gel das gleiche Migrationsverhalten wie zwei spontan phagenresistente Mutanten. In den Spontanmutanten konnte jedoch im Gegensatz zu der konstruierten Mutante durch ein WaaF-exprimierendes Plasmid lediglich das Kernoligosaccharid, nicht aber das O-Antigen wiederhergestellt werden. Weitere genetische Analysen ergaben, daß eine der Spontanmutanten 546 bp deletiert hatte, die Teile von waaF und waaL betrafen, letzteres kodiert dabei vermutlich für die O-Antigen-Ligase. Spontanmutanten mit intaktem O-Antigen aber verändertem Kernoligosaccharid konnten als galU-Mutanten charakterisiert werden, die auch im Galaktosekatabolismus beeinträchtigt waren. Zusätzlich wurden zwei weitere gal-Gene, galE und galK, durch genetische Manipulation inaktiviert. Diese Mutanten konnten ebenfalls keine Galaktose mehr verstoffwechseln, synthetisierten aber ein intaktes LPS. In Gegenwart hoher Galaktosekonzentrationen wurde in galU- und galE- Mutanten aufgrund der Defekte im Gal-Stoffwechsel Lyse beobachtet. Zusätzlich wurde die Rolle von galU und galE in der Biofilmbildung untersucht. Da der transluzente Wildtyp (Wt) im Gegensatz zu Opakvarianten keinen Biofilm bilden konnte, wurden galE und galU auch in einer Opakvariante inaktiviert. galU- und galE-Mutationen erzeugten in der Opakvariante wieder eine transluzente Koloniemorphologie und einen biofilm-negativen Phänotyp an abiotischen Oberflächen. Diese Daten deuten an, daß die Synthese von UDP-Galaktose ausgehend von UDP-Glukose für die Synthese des Exopolysaccharides (VPS) notwendig ist. Virulenzstudien in neugeborenen Mäusen ergaben, daß O-Antigen negative Stämme sowie galU-Mutanten sehr viel schlechter und R-LPS-Mutanten nicht mehr im Dünndarm kolonisieren konnten. Da galE und galEK-Mutanten ebenso gut wie der Wt kolonisierten, konnte ausgeschlossen werden, daß toxische Galaktose-Effekte für den Kolonisierungsdefekt der galU-Mutante verantwortlich waren. Zusätzlich wurde die Überlebensfähigkeit der LPS-Mutanten in Gegenwart von verschiedenen Substanzen, die nachweislich im menschlichen Dünndarm vorkommen, unter „in vitro“ Bedingungen untersucht. R-LPS und galU-Mutanten waren im Vergleich mit dem Wt sensitiver gegenüber schwachen organischen Säuren, Defensinen, dem Komplementsystem und Gallensäuren. O-Antigen negative Stämme waren dagegen weiterhin resistent gegenüber Gallensäuren und schwachen organischen Säuren aber sensitiv gegen die Komponenten des angeborenen Immunsystems. Bisher wurde für keine der LPS-Mutanten eine größere Beeinträchtigung weiterer Virulenzfaktoren, wie z.B. Motilität, Synthese der Pili TCP oder Choleratoxin-Produktion festgestellt. Auch die Zusammensetzung der Proteine in der äußeren Membran war offensichtlich nicht beeinträchtigt, allerdings wurde beobachtet, daß aus galU Mutanten in geringem Maße und aus R-LPS Mutanten in verstärktem Maße periplasmatische Proteine in den Überstand diffundieren können. Diese Ergebnisse deuten an, daß nicht nur das O-Antigen, wie bereits bekannt, sondern auch eine spezifische Kernoligosaccharid-Struktur für eine effektive Kolonisierung von V. cholerae essentiell ist. Der Grund dafür ist höchstwahrscheinlich in der Ausbildung einer stabilen äußeren Membran zu suchen, die die Persistenz in Gegenwart bakteriozider Substanzen des Dünndarms ermöglicht.
Das RpoS-Protein aus Vibrio cholerae : Funktionsanalyse und Charakterisierung der Proteolyse-Kaskade
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Konservierung bekannter RpoS-assoziierter Funktionen für das V. cholerae Homolog untersucht. Dabei ergab die phänotypische Analyse der rpoS-Deletionsmutante, dass analog zu der Bedeutung als Regulator des Stationärphasen-Wachstums in E. coli, definierte Zelldichte-abhängige Eigenschaften in V. cholerae gleichermaßen der Kontrolle von RpoS unterliegen. In weiterführenden Experimenten konnte daraufhin die Konservierung der entsprechenden Promotorstrukturen über die funktionelle Komplementierung rpoS-abhängiger Gene durch das jeweils speziesfremde Protein aufgedeckt werden. Dahingegen konnte die Bedeutung von RpoS bei der Ausprägung der generellen Stress-Resistenz u. a. in E. coli für das V. cholerae Homolog über den gewählten experimentellen Ansatz nicht belegt werden. So wurden in Survival-Assays für keine der getesteten Stress-Bedingungen signifikante Unterschiede zwischen rpoS-Mutante und Wildtyp ermittelt. Die in E. coli gezeigte intrazelluläre Anreicherung des Sigmafaktors unter diversen Stress-Situationen konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Hinsichtlich der potentiellen Stellung von RpoS als globaler Regulator für Virulenz-assoziierte Gene, unterstützen und ergänzen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die gegenwärtige Theorie, wonach RpoS das Ablösen der V. cholerae Zellen vom Darm-Epithel fördert. Die postulierte Bedeutung des alternativen Sigmafaktors in der letzten Phase der Pathogenese wurde über die RpoS-abhängige Sekretion der Mukin-degradierenden Protease HapA und die hier unabhängig nachgewiesene Transkriptionskontrolle von Chemotaxis-Genen bestätigt. In E. coli gilt als entscheidender Parameter für die dargelegten RpoS-Funktionen die intrazelluläre Konzentration des Masterregulators. Deshalb war ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit die Regulation des RpoS-Levels in V. cholerae. Neben der Identifizierung von Bedingungen, welche die RpoS-Expression beeinflussen, wurde vorrangig der Mechanismus der Proteolyse analysiert. Dabei wurden als RpoS-degradierende Komponenten in V. cholerae die Homologe des Proteolyse-Targetingfaktors RssB und des Protease-Komplexes ClpXP identifiziert. Die weitere Untersuchung der RpoS-Proteolyse ergab außerdem, dass bestimmte Stress-Signale den Abbau stark verzögern. Interessanterweise resultierten die gleichen Signale jedoch nicht in der Akkumulation von RpoS. Als weiterer Unterschied zu der bekannten Proteolysekaskade in E. coli zeigte sich, dass das V. cholerae Homolog der RssB-aktivierenden Kinase ArcB (FexB) an der RpoS-Proteolyse nicht beteiligt ist. Indessen deuten die Ergebnisse weiterführender Experimente auf den Einfluss der Kinasen CheA-1 und CheA-3 des V. cholerae Chemotaxis-Systems auf die RpoS-Degradation. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein zu E. coli abweichendes Modell der RpoS-Proteolyse postuliert, in welchem die aktiven CheA-Kinasen den Targetingfaktor RssB phosphorylieren und somit den Abbau einleiten. Die Beteiligung von MCP-Rezeptoren an der Kontrolle der intrazellulären RpoS-Konzentration und damit an der Transkription der Chemotaxisgene selbst, beschreibt erstmalig ein Regulationssystem, wonach innerhalb der Chemotaxis-Kaskade die Rezeptoraktivität wahrscheinlich über einen positiven „Feedback-Loop“ mit der eigenen Gen-Expression gekoppelt ist. Darüber hinaus deutete sich die Beteiligung der ATP-abhängigen Protease Lon an der RpoS-Proteolyse-Kaskade in V. cholerae an. Die Inaktivierung der in E. coli unter Hitzeschock-Bedingungen induzierten Protease resultierte in einem extrem beschleunigten RpoS-Abbau. Ein letztes Teilprojekt dieser Arbeit adressierte die Regulationsmechanismen der V. cholerae Osmostress-Adaptation. Während in E. coli der alternative Sigmafaktor dabei eine zentrale Rolle spielt, konnte die Beteiligung des V. cholerae RpoS an der Osmostress-Regulation jedoch nicht aufgedeckt werden. Dafür ergab die Funktionsanalyse eines neu definierten Osmostress-Sensors (OsmRK) die Kontrolle von ompU durch dieses Zwei-Komponentensystems unter hypertonen Bedingungen. Dieses Ergebnis überraschte, da bislang nur der Virulenzfaktor ToxR als Regulator für das Außenmembranporin beschrieben wurde. Die nachgewiesene ompU-Transkriptionskontrolle durch zwei Regulatoren führte zu der Hypothese eines unbekannten regulativen Netzwerkes, welchem mindestens 52 weitere Gene zugeordnet werden konnten. Insgesamt ist festzuhalten, dass die in dieser Arbeit durchgeführte molekulare Charakterisierung der RpoS-Proteolyse in V. cholerae Beweise für eine mögliche Verbindung zwischen der Transkriptionskontrolle für Motilitäts- und Chemotaxisgene mit der Chemotaxis-Reizwahrnehmung erbrachte. Eine derartige intermolekulare Verknüpfung wurde bislang für keinen anderen Organismus beschrieben und stellt somit eine neue Variante der Signaltransduktion innerhalb der Virulenz-assoziierten Genregulation dar.
Die Morphogenese von Viruspartikeln und deren Freisetzung aus infizierten Zellen sind späte Schritte im viralen Lebenszyklus. Matrix-Proteine (M) negativsträngiger RNA-Viren und Retroviren, bei denen es sich um periphere Membran-assoziierte Proteine handelt, spielen für diese Prozesse eine besonders wichtige Rolle. Im Verlauf der Masernvirus (MV)-Infektion interagiert das M-Protein mit dem viralen Nukleoproteinkomplex im Innern der Viruspartikel einerseits und mit den viralen Glykoproteinen auf der Oberfläche andererseits. Die Bedeutung des MV M-Proteins für die Partikelproduktion und sein intrazellulärer Transport wurden bislang wenig untersucht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das MV M-Protein in höhermolekularen Komplexe oligomerisiert und transient mono-ubiquitiniert vorliegt. Beide biochemischen Eigenschaften des M-Proteins sind wahrscheinlich für die Partikelentstehung von Bedeutung, wie durch Studien an M-Protein-Orthologen anderer Viren bereits belegt wurde. Das MV M-Protein assoziierte mit Membranen und speziellen Membranmikrodomänen, sogenannten Detergenz-resistenten Membranfraktionen (DRMs), und vermittelte nach transienter Expression in Fibroblasten die Produktion Virus-ähnlicher Partikel (virus-like particles, VLPs). Es ist beschrieben, dass umhüllte Viren präferenziell aus DRMs freigesetzt werden. Die Koexpression des MV-Glykoproteins F erhöhte den Anteil mit DRM-assoziierten M-Proteins um ein Vierfaches, steigerte jedoch, wie auch das H-Protein, die Effizienz der VLP-Freisetzung nicht. Überraschenderweise waren beide jedoch selbst in der Lage VLPs zu induzieren. Die Effizienz der VLP-Produktion war gering und entsprach der der Viruspartikelfreisetzung. Dendritische Zellen (DCs) sind für MV semipermissiv. Obwohl alle viralen Proteine synthetisiert werden, wird kein infektiöses Virus freigesetzt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Lokalisation der M-, H- und N-Proteine dramatisch von der in der produktiv infizierbaren Fibroblastenzelllinie HeLa abweicht. Während in infizierten HeLa-Zellen das M-Protein mit Lamp-1-positiven späten Endosomen kolokalisierte, akkumulierten in DCs alle untersuchten viralen Proteine in einem spät endosomalen Kompartiment, das das Tetraspanin CD81, aber nicht Lamp-1, enthielt und möglicherweise an der MHC-Klasse-II-abhängigen Antigenpräsentation beteiligt ist.
Masernvirus (MV) ist ein negativ-strängiges RNA-Virus, das im Menschen und im Nagermodell zu akuten und subakuten Enzephalitiden führen kann. Es wurde beschrieben, dass bestimmte Antikörperescape-Mutanten des MV neurovirulent, andere nicht neurovirulent sind (Liebert et al., 1994). Mit Hilfe von rekombinanten Masernviren, konnte ich diejenigen Aminosäuren charakterisieren, die einerseits für die Bindung monoklonaler, neutralisierender anti-MV-H-Antikörper (K29, K71, Nc32 und L77) und andererseits für die Neurovirulenz verantwortlich sind. Bei den rekombinanten MV wurde das von Duprex et al. (1999) als Neurovirulenz vermittelnd beschriebene H-Gen des nagerhirnadaptierten neurovirulenten CAM/RB-Stammes in das Grundgerüst des nicht neurovirulenten Edtag (molekularer Klon des Vakzinestammes Edm) kloniert. Über gerichtete Mutagenese wurden die jeweiligen Mutationen in dieses CAM/RB H-Gen eingefügt. Mittels der FACS-Analyse konnten die Aminosäureänderungen identifiziert werden, die für die Bindung der jeweiligen Antikörper verantwortlich sind. Sie befinden sich nach einem Strukturmodell der H-Proteine (Langedijk et al., 1997) im Membran-distalen Teil, den so genannten Propellern. Im Einzelnen sind folgende Aminosäureänderungen im Hämagglutinin-Protein für den Escape verantwortlich: L77 – 377 Arg -> Gln und 378 Met -> Lys; Nc32 – 388 Gly -> Ser; K71 – 492 Glu -> Lys und 550 Ser -> Pro; K29 – 535 Glu -> Gly. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die beiden Aminosäureveränderungen an den Positionen 195 und 200 gemeinsam für die Neurovirulenz verantwortlich sind und nicht assoziiert sind mit den Mutationen für den Antikörperescape. Der Aminosäureaustausch an Position 200 bei neurovirulenten Viren führt zum Verlust einer benutzten Glykosylierungsstelle. Diese Mutation ist jedoch nicht alleine für das unterschiedliche Neurovirulenzverhalten der Viren verantwortlich, sondern es muss gleichzeitig der Austausch an Position 195 vorhanden sein, der eine positive Ladung im H-Molekül entfernt. Diese beiden Mutationen sind nach dem Strukturmodell nach Langedijk im Stamm2-Bereich angesiedelt. Sind im H-Protein an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Gly und Ser vorhanden, so findet im Gehirn neugeborener Lewis-Ratten eine verstärkte Virusvermehrung und Ausbreitung statt, die die akute Enzephalitis mit Expression typischer proinflammatorischer Zytokine zur Folge hat. Werden an Stelle 195 und 200 die Aminosäuren Arg und Asn exprimiert, so ist der Verlauf der Infektion inapparent. In dieser Arbeit wurde auch ein Zellkultursystem gemischter Hirnzellen neugeborener Lewis-Ratten etabliert, das die Unterschiede der Virusausbreitung in vivo reflektiert und mit dem weitere Untersuchungen zum Mechanismus der Neurovirulenz durchgeführt werden könnten. Anhand der durchgeführten Untersuchungen mit Ratten des CD46 transgenen Lewis-Modells konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit des Rezeptors CD46 das Virulenzverhalten der getesteten Viren nicht beeinflusst. Weder mit dem Vakzinestamm Edm noch mit einem nicht an Nager adaptierten Wildtypstamm, konnte nach intracerebraler Injektion eine akute Enzephalitis induziert werden. Die Untersuchungen zeigen, dass die Neurovirulenz des an Nager-adaptierte MV-Stammes CAM/RB essentiell von den Aminosäuren Gly und Ser an Position 195 und 200 im H-Protein abhängt und nicht durch die transgene Expression zellulärer Rezeptoren für MV vermittelt werden kann.
Die PrfA-Aktivität im L. monocytogenes Stamm EGD sowie dessen prfA Deletionsmutante mit dem prfA- bzw. prfA*-Gen unter Kontrolle des prfA-Promotors auf dem High-Copy Plasmid pERL3 wurde nach Wachstum in BHI, LB (Luria-Bertani Medium) und definiertem MM untersucht. Die Medien waren versetzt mit 50 mM der PTS-Kohlenstoffquellen Glucose, Mannose oder Cellobiose oder mit der Nicht-PTS-Kohlenstoffquelle Glycerin. Mit dem Wildtyp EGD konnte in BHI und LB mit allen genannten Kohlenstoffquellen nur eine geringe PrfA-Aktivität beobachtet werden. In MM dagegen war die PrfA-Aktivität in Anwesenheit von Glycerin stark erhöht und mit Cellobiose als einziger Kohlenstoffquelle stark reprimiert. Mit dem PrfA*-überexprimierenden Stamm wurden unter allen Bedingungen hohe PrfA-Aktivität gefunden. EGDΔprfApPrfA zeigte dagegen trotz gleicher PrfA-Menge wie EGDΔprfApPrfA* nur in BHI eine hohe PrfA-Aktivität. Die Zugabe des Amberlites XAD4 in LB erhöht die reduzierte PrfA-Aktivität in EGDΔprfApPrfA und in MM verstärkt XAD4-Zugabe die PrfA-Aktivität des Wildtyps. Eine ptsH-Mutante ist in LB und MM unabhängig von der Zugabe einer der vier Kohlenstoffquellen nicht in der Lage zu wachsen (Stoll et al., 2008), was darauf hin deutet, dass die Aufnahme der verwendeten Kohlenstoffquelle und auch der Glycerinstoffwechsel von einem intakten PTS-Weg abhängig sind. In BHI stehen dagegen offensichtlich noch PTS-unabhängige Kohlenstoffquellen zur Verfügung, da die ptsH-Mutante in BHI noch wachsen kann. Dies unterstützt auch die Beobachtung, dass die Generationszeiten von L. monocytogenes in LB und vor allem MM im Vergleich zu BHI wesentlich länger sind. Expressionsdaten der PTS-Gene wurden von allen drei Stämmen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen erstellt. Die Daten deuten darauf hin, dass die PrfA-Aktivität mit der Expressionsstärke und dem Phosphorylierungsstatus bestimmter PTS-Permeasen zusammenhängt. PTS-Permeasen bestehen immer aus mindestens drei Domänen, der Membran überspannenden Zucker transportierenden Domäne EIIC (und EIID im Falle von Mannose spezifischen PTS) und den zwei im Zytosol löslichen Komponenten EIIA und EIIB. EIIA wird direkt von HPr-His-P phosphoryliert, welches sein Phosphat von dem von PEP phosphorylierten EI empfängt. Das PTS spielt neben der Zuckeraufnahme eine Rolle in vielen regulatorischen Vorgängen in der Bakterienzelle, unter anderem in der Pathogenese (Barabote and Saier, 2005; Deutscher et al., 2006; Postma et al., 1993). Listerien codieren für alle sieben bekannten PTS-Familien, 86 Gene codieren für 29 komplette und einige unvollständige PTS. Trotz der großen Anzahl an PTS-Genen besitzt L. monocytogenes kein vollständiges PtsG, welches homolog zu E. coli oder B. subtilis ist, sondern nur ein EIIAGlc. Um die an der Glucoseaufnahme involvierten PTS-Permeasen zu identifizieren und einen möglichen Zusammenhang zwischen diesen PTS-Permeasen und der PrfA-Aktivität zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit systematisch PTS-Permeasen deletiert, welche für putative Beta-Glucosid-PTS (PTSGlc), Mannose-PTS (PTSMan) und Cellobiose-PTS (PTSLac) codieren. Diese Deletionsmutanten wurden bezüglich ihres Wachstumes in Gegenwart der entsprechenden PTS-Zucker und die PrfA-Aktivität untersucht. Deletionen von in L. monocytogenes EGD-e nur schwach exprimierten PTSGlc haben keinen Einfluss auf das Wachstum in MM mit 10 mM Glucose oder Cellobiose. Von den vier exprimierten PTSMan sind zumindest zwei eindeutig in der Lage, Glucose zu transportieren, und die Deletion dieser PTS-Permeasen, codiert von lmo0096-0098 und lmo0781-0784, erhöht sehr deutlich die Expression des im Wildtyp wenig exprimierten Gens für die PTS-Permease PTSGlc(lmo0027). Für den Cellobiose-Transport scheint von den sechs vollständigen PTSLac-Permeasen vor allem PTSLac(lmo2683-2685) und nach Deletion dieses Operons, ebenfalls die PTSGlc(lmo0027)-Permease wichtig zu sein. Obwohl die multiple Deletion dieser für die Glucose/Mannose- bzw. Cellobiose-Aufnahme in L. monocytogenes wichtigen PTS-Permeasen das Wachstum in definiertem MM drastisch reduziert, haben diese Deletionen offensichtlich keine Auswirkung auf das intrazelluläre Wachstum, da die Infektionsrate so effizient ist wie die des Wildtyps. Auf PrfA hat die schrittweise Deletion der Glucose/Mannose-spezifischen PTS-Permeasen nach Wachstum in MM mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle eine aktivierende Wirkung, jedoch keine Auswirkung nach Wachstum in Cellobiose-haltigem MM. Umgekehrt verhält es sich mit den PTSLac-Deletionsmutanten. In vitro Transkriptionsstudien mit (teilweise phosphoryliert) aufgereinigten Lmo0096 (EIIABMan) und Lmo1017 (EIIAGlc) -Proteinen deuten auf eine direkte Interaktion zwischen PrfA und bestimmten EII-Proteinen hin. Dies konnte für Lmo0096 auch in Immunpräzipitationsassays gezeigt werden. Eine Überexpression von Lmo0096 führte zudem zu einer sehr deutlichen Reduktion der PrfA-Aktivität nach Wachstum in MM mit Glucose.
In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen können im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, nämlich die Überlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im Überschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit überwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellulär gewachsene Bakterien über Bindung an paramagnetische Partikel („Beads“) und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gewählt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel  Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy – CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur für die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate für die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien während der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. Für einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen“ Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begründet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen Fällen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellulären Veränderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten übereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazelluläre posttranskriptionelle Mechanismen begründet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen.
Die Bedeutung von Mykosen hat wegen der wachsenden Zahl immunsupprimierter Patienten in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. Diese erkranken häufig an oberflächlichen sowie lebensbedrohlichen systemischen Infektionen mit dem opportunistisch humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, da der Keim, der oftmals als harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten im Gastrointestinaltrakt gesunder Menschen vorkommt, vom geschwächten Immunsystem nicht mehr in Schach gehalten werden kann. In dieser Arbeit sollten bestimmte Gene von C. albicans, die in anderen Organismen als essentiell für deren Lebensfähigkeit bzw. Virulenz beschrieben wurden, als potentielle Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antimykotika charakterisiert werden. Das CMP1-Gen kodiert für die katalytische Untereinheit der konservierten Calcium/Calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin, die in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und in anderen Organismen verschiedene physiologische Prozesse reguliert und essentiell für die Virulenz des pathogenen Hefepilzes Cryptococcus neoformans ist. Um die Bedeutung von Calcineurin für das Überleben und die Virulenz von C. albicans zu untersuchen, wurden homozygote cmp1 knock-out-Mutanten sowohl in einem auxotrophen C. albicans-Laborstamm als auch, mit Hilfe eines neuen dominanten Selektionsmarkers, in einem prototrophen Wildstamm hergestellt. Die Mutanten erwiesen sich als hypersensitiv gegenüber Natrium, Calcium, Mangan und Lithium sowie gegenüber alkalischem pH-Wert. Darüber hinaus konnten die mutierten Zellen Membranstreß, der durch SDS- oder Fluconazol-Zugabe verursacht wurde, nicht tolerieren und waren unter diesen Bedingungen stark in ihrem Wachstum gehemmt. Andere wichtige Virulenzeigenschaften wie die Toleranz gegenüber Wirts-Körpertemperatur und die Fähigkeit zur Hyphenbildung zeigten sich durch die CMP1-Deletion in vitro nicht beeinträchtigt. Dennoch machte die Anwendung eines murinen Modells einer systemischen Candidose in vivo deutlich, daß die Mutanten sehr stark in ihrer Virulenz attenuiert waren. Der Virulenzdefekt war vermutlich zumindest zum Teil dadurch bedingt, daß die Calcineurin-defizienten Zellen im Gegensatz zum Wildtyp in humanem Serum nicht wachsen konnten und deshalb möglicherweise schlechter über die Blutbahn disseminieren konnten. Außer Calcineurin wurden in Kooperation mit einem Industriepartner drei weitere Gene, YML127, YPR143, und YML93, die in S. cerevisiae als essentiell beschrieben wurden und die keine signifikanten Homologien zu Vertebraten-Genen aufwiesen, in der C. albicans-Genomsequenz identifiziert und auf ihre Eignung als potentielle Targets hin untersucht. Die Funktion dieser Gene war zu Beginn dieser Arbeit unbekannt; vor kurzem wurde jedoch gezeigt, daß sie in S. cerevisiae eine Rolle beim Chromatin-Remodeling bzw. bei der rRNA-Prozessierung haben. Nachdem sich alle Gene auch in C. albicans als essentiell herausgestellt hatten, wurden konditional letale Mutanten hergestellt, in denen die Gene durch induzierbare Deletion mit Hilfe der site-spezifischen Rekombinase FLP aus dem Genom entfernt wurden. Dadurch wurde eine Population von Nullmutanten erhalten, in denen der terminale Phänotyp der Gendeletion analysiert werden konnte. Die funktionelle Analyse des YML127 (RSC9) Gens wies darauf hin, daß es in C. albicans eine ähnliche Funktion hat wie in der Bäckerhefe, in der das Rsc9-Protein ein Bestandteil des RSC-Protein-Komplexes ist, der die Struktur des Chromatins in Abhängigkeit von Zellzyklus und Umweltbedingungen umorganisiert und damit die Aktivität von Genen steuert. Mit Hilfe eines HA-Epitop markierten YML127-Gens konnte das Genprodukt im Zellkern von C. albicans lokalisiert werden. Die C. albicans yml127-Nullmutanten produzierten verlängerte, mehrfach knospende Zellen, was einen Verlust der Koordination zwischen Mitose und Zytokinese vermuten ließ. Die beiden Gene YPR143 und YML93 (UTP14) scheinen wie ihre homologen Vertreter in S. cerevisiae an der Prozessierung der ribosomalen RNA beteiligt zu sein. Heterozygote Mutanten wiesen eine Haploinsuffizienz auf, die sich in einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber Hemmstoffen der rRNA-Synthese und der Ribosomenaktivität zeigte, und in den induzierten Nullmutanten akkumulierten Vorstufen der reifen rRNAs. In beiden Fällen führte die Gendeletion zu Anomalien im Zellzyklus; die ypr143-Mutanten wiesen eine vergrößerte unförmige Zellmorphologie auf, und die yml93-Mutanten bildeten große, rundliche Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben nicht nur wichtige Einblicke in die Funktion der untersuchten Gene in essentiellen zellulären Prozessen, sondern zeigen auch deren Bedeutung für die Virulenz bzw. für das Überleben des humanpathogenen Hefepilzes C. albicans. Die entsprechenden Genprodukte sollten sich deshalb prinzipiell als Angriffspunkte für die Entwicklung neuer antimykotischer Medikamente eignen.
Unter den sechs Arten der Gattung Listeria finden sich nur zwei pathogene Spezies. L. monocytogenes ist pathogen für Mensch und Tier, L. ivanovii nur tierpathogen. Beide Arten besitzen ein Virulenzgencluster, das auch als Pathogenitätsinsel LIPI-1 bezeichnet wird. Pathogenitätsinseln (PAIs) sind bei gram-negativen Bakterien weit verbreitet, wurden bei gram-positiven Pathogenen bisher jedoch nur selten beschrieben. In L. ivanovii wurde nun ein weiterer Virulenz-assoziierter, instabiler Chromosomenabschnitt entdeckt, der in einem Teilbereich Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel besitzt. Ausgehend von einem spontanen, aber reproduzierbaren Deletionsereignis eines großen Genomabschnitts, der einige schon bekannte Virulenz-assoziierte Gene umfasst (i-inlE, i-inlF, smcL), wurden in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern an der "Universidad Complutense de Madrid", insbesondere mit G. Domínguez-Bernal die komplette deletierte Region sowie flankierende Genombereiche genauer analysiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten rechts von dem bereits charakterisierten Gen smcL 13 neue Open Reading Frames (ORFs) bzw. Gene (ydeI, rnaH, norA) von L. ivanovii identifiziert werden, die größtenteils in der Deletionsmutante L. ivanovii GD-3 deletiert waren. Für die meisten Open Reading Frames konnten Homologien zu ORFs in den Genomsequenzen von L. monocytogenes und der apathogenen Art L. innocua gefunden werden. Eigene experimentelle Analysen zeigten zudem, dass diese ORFs in ähnlicher Anordnung auch in den apathogenen Arten L. seeligeri und L. welshimeri vorhanden sind, was wahrscheinlich macht, dass sie nicht an der Virulenz von Listerien beteiligt sind. G. Domínguez-Bernal fand im links von smcL liegenden Bereich eine Reihe neuer Internalingene, die alle spezifisch für L. ivanovii sind. Für die Gene i-inlE, i-inlF und smcL ist bereits bekannt, dass diese Virulenz-assoziiert sind. Dies führte zur Definition einer neuen, LIPI-2 genannten Pathogenitätsinsel in L. ivanovii, die außer smcL und i-inlFE alle neu gefundenen Internalingene umfasst. In dieser Arbeit durchgeführte Untersuchungen der LIPI-2 flankierenden Bereiche zeigten, dass diese in L. monocytogenes und auch den apathogenen Arten L. innocua, L. seeligeri und L. welshimeri bemerkenswert konserviert sind. Durch Transkriptionsuntersuchungen mittels RT-PCR wurde die Expression der neu identifizierten Gene analysiert. Hierbei wurden verschiedene Kulturbedingungen untersucht sowie die Transkription nach Infektion mehrerer Zelllinien bestimmt. Bei der Sequenzanalyse wurde für fast alle Internalingene eine PrfA-Box identifiziert und es bestätigte sich in dieser Arbeit, dass die meisten der Internalingene PrfA-abhängig exprimiert werden. Allerdings wiesen die einzelnen Gene kein einheitliches Transkriptionsprofil unter verschiedenen in vitro-Bedingungen auf. Eine Analyse der Genexpression nach Infektion verschiedener Zelllinien zeigte schließlich, dass die Internalingene während einer Infektion differentiell transkribiert werden und möglicherweise am Infektionsgeschehen beteiligt sind. Das Expressionsmuster der zu LIPI-2 benachbarten Open Reading Frames bestätigte, dass diese Gene PrfA-unabhängig und unter verschiedenen Bedingungen konstitutiv exprimiert werden. Das Expressionsmuster dieser Gene läßt den Schluss zu, dass sie vermutlich nicht zur Virulenz von L. ivanovii beitragen. Die Untersuchung der Virulenzclustergene in LIPI-1 schließlich zeigte eine deutliche PrfA-Abhängigkeit der Genexpression. Es konnte bestätigt werden, dass deren Transkription unter PrfA-induzierenden Bedingungen verstärkt wird. Zudem fand sich auch nach Infektion eine deutliche Expression dieser Gene.