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Die Risikobewertung von Chemikalien ist für die öffentliche Gesundheit von entschei-dender Bedeutung, weshalb strenge Testverfahren zu deren toxikologischer Begutach-tung angewandt werden. Die ursprünglich tierbasierten Testverfahren werden aufgrund von neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen und wegen ökonomischer Ineffizienz sowie ethischer Fragwürdigkeit immer mehr durch alternative Methoden ohne Tiermodelle ersetzt. Für den toxikologischen Endpunkt der Augenreizung wurden bereits die ersten alternativen Testsysteme auf der Basis von ex vivo- oder in vitro-Modellen entwickelt. Jedoch ist bis dato kein alternatives Testsystem in der Lage, das gesamte Spektrum der verschiedenen Kategorien der Augenreizungen nach dem global harmonisierten System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) vorherzusagen und damit den tierbasierten Draize-Augenreizungstest vollends zu ersetzen. Gründe hierfür sind fehlende physiologische Merkmale im Modell sowie eine destruktive Analysemethode.
Aufgrund dessen wurden in dieser Studie die Hypothesen getestet, ob ein verbessertes In-vitro-Modell oder eine zerstörungsfreie, hochsensitive Analysemethode die Vorher-sagekraft des Augenreizungstests verbessern können. Dafür wurden zunächst neue Mo-delle aus humanen Hornhaut- und Hautepithelzellen entwickelt. Die Modelle aus pri-mären cornealen Zellen zeigten eine gewebespezifische Expression der Marker Zytokera-tin 3 und 12 sowie Loricrin. In beiden Modellen konnte durch die Verkürzung der Kul-turdauer die Ausbildung einer Hornschicht verhindert werden. Die Modelle wiesen dadurch eine sensiblere Barriere vergleichbar der nativen Cornea auf. Darüber hinaus konnte durch die chemische Quervernetzung mit Polyethylenglykolsuccinimidylglutara-tester ein transparentes, nicht kontrahierendes Stroma-Äquivalent etabliert werden. Der Stroma-Ersatz konnte zur Generierung von Hemi- und Voll-Cornea-Äquivalenten einge-setzt werden und lieferte somit erste Ansatzpunkte für die Rekonstruktion der nativen Hornhaut.
Parallel dazu konnte ein zerstörungsfreies Analyseverfahren basierend auf der Impe-danzspektroskopie entwickelt werden, das wiederholte Messungen der Gewebeintegri-tät zulässt. Zur verbesserten Messung der Barriere in dreidimensionalen Modelle wurde hierfür ein neuer Parameter, der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) bei der Frequenz von 1000 Hz, der TEER1000 Hz definiert, der eine genauere Aussage über die Integrität der Modelle zulässt. Durch die Kombination der entwickelten cornealen Epithelzellmodelle mit der TEER1000 Hz-Messung konnte die Prädikitivität des Augenrei-zungstests auf 78 - 100 % erhöht werden. Von besonderer Bedeutung ist dabei, dass die nicht destruktive Messung des TEER1000 Hz zum ersten Mal erlaubte, die Persistenz von Irritationen durch wiederholte Messungen in einem in vitro-Modell zu erkennen und somit die GHS-Kategorie 1 von GHS-Kategorie 2 zu unterscheiden. Der wissenschaftli-che Gewinn dieser Forschungsarbeit ist ein neues Testverfahren, das alle GHS-Kategorien in einem einzigen in vitro-Test nachweisen und den Draize-Augenreizungstest gänzlich ersetzen kann.
Trotz hochmoderner Technologien und ausgefeilter therapeutischer und rekonstruktiver chirurgischer Heilungsmethoden beträgt die 5-Jahres Überlebensrate bei der Diagnose PECA der Mundhöhle im Durchschnitt auch im Jahre 2017 nur 55 % und die Heilungsmethoden haben sich in den letzten drei Jahrzehnten kaum verbessert. Umso wichtiger ist es deshalb, die Forschung voranzutreiben und ein aussagekräftiges Tumormodell zu etablieren, das bei der Entwicklung neuer Therapieansätze schnell und sicher gute Ergebnisse liefert.
In dieser Studie soll mit Hilfe des Tissue Engineering (TE) ein in gesunder Mundschleimhaut (MSH) integriertes 3D-Tumormodell generiert werden, welches bestmöglich die Analyse pathologischer Mechanismen im Tumorzentrum, sowie im Randbereich von gesundem und erkranktem Gewebe, und auch die Analyse der Auswirkungen neuartiger Chemotherapeutika auf gesunde und maligne Zellen in direkter Nachbarschaft ermöglicht – ohne Tierversuche. In der Konsequenz könnte ein erheblicher Fortschritt mit höheren Erfolgsaussichten der Therapieansätze erzielt werden.
Es wird ein Tumormodell generiert, in dem auf Basis eines gesunden MSH-Modells Tumorzellen eingebracht werden, um - genauso, wie die Tumorentstehung in vivo von statten gehen würde – Tumorentstehung und Tumorwachstum in der Umgebung von gesunder MSH analysieren zu können. Das Modell basiert dabei auf einer Matrix aus dezellularisierter, porciner, small-intestinal-submucosa (SIS/MUC), die mit primären Fibroblasten, primären Keratinozyten und Tumorzellen der Tumorzelllinie FaDu besiedelt wird. Eine Besonderheit der FaDu-Zellen ist die vorangegangene Transduktion mit dem Lentivirus RFP – um die eingewanderten Zellen von gesunden Zellen unterscheiden zu können. Der Vorgang der Transduktion war gelungen und es konnte eine Fluoreszenz der noch in Zellkulturschalen kultivierten Zellen erzielt werden. Allerdings waren die fluoreszierenden Zellen in den fixierten Schnitten nicht mehr nachweisbar.
Zur Generierung eines Tumormodelles wurden auf Basis eines OMÄ drei unterschiedliche Applikationsformen zur Integration von Tumorzellen getestet. Die Integration von Tumorzellen fand in Form von Spots, Sphäroiden oder Tumorzellgemischen (prim. Keratinozyten/FaDu-Zellen) in zuvor kultivierte gesunde OMÄ statt. Dabei sollte das Applizieren von Spots oder Sphäroiden das Tumorzellwachstum auch in der Umgebung von gesundem Gewebe initiieren. Dies würde die Möglichkeit schaffen, auch in vitro, gesundes neben pathologischem Gewebe und den Übergang dazu genau analysieren zu können.
Es sollen sowohl die optimale Konzentration der Tumorzellen, welche für die Entstehung von Tumoren nötig ist, als auch die geeignetste Applikationsmethode eruiert werden, um optimale Tumormodelle zuverlässig reproduzierbar ansetzen zu können. Die Modelle wurden histologisch und immunhistochemisch analysiert und die Ergebnisse mit ermittelten TEER-Werte in Korrelation gesetzt.
In dieser Arbeit konnte mit der Applikation von Spots oder Sphäroiden kein suffizientes Tumorwachstum in Umgebung von gesunder MSH erzielt werden. Die Zellen lagen ohne Reaktion des angrenzenden Stratum corneums auf der zu stark ausgeprägten Hornschicht der OMÄ auf und es war keine Einwanderung in das darunterliegende Gewebe möglich.
Allerdings ist es gelungen, durch Applikation eines Zellgemisches variierender Mischungsverhältnisse von primären Keratinozyten und Tumorzellen der Zelllinie FaDu ein 3D-Tumorwachstum unterschiedlicher Malignitätsstufen zu initiieren. Je kleiner das Mischungsverhältnis und je höher in der Konsequenz die Anzahl der FaDu-Tumorzellen, desto ausgeprägter waren die morphologischen Anzeichen einer Tumorbildung. Abhängig vom Mischungsverhältnis war dabei die Ausprägung des Tumors. Auch wenn dadurch keine Kombination von gesundem und pathologischem Gewebe in einem Modell mehr imitiert werden konnte, so konnten zumindest nach histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen eindeutige pathologische, maligne Tumormodelle generiert werden. Die Tumormodelle zeigten durchgehend Zell- und Kernpleomorphismen, atypische und vermehrte suprabasale Mitosen, eine Störung der normalen Gewebearchitektur, die Ausbildung von Interzellularbrücken, Einzelzelldyskeratosen und Verhornungsknospen, sowie Stellen der Durchbrechung der Basalmembran und Invasion von Tumorzellen in die darunterliegende Lamina propria. All das sind eindeutige Kennzeichen malignen Wachstums
Auch die Ergebnisse der TEER-Wert Messung stimmten mit den morphologischen Entwicklungen der Modelle überein. So stiegen die TEER-Werte der Kontrollmodelle konsequent an, was für eine deutliche Entwicklung von kontinuierlichem Gewebe spricht und im Gegensatz dazu fielen die TEER-Werte im zeitlichen Verlauf der Tumormodelle, bei denen die Basalmembran und somit die Kontinuität des Gewebes durchbrochen wurde rapide ab, bzw. lagen im konstant niedrigen Bereich.
Der Erfolg der Etablierung dieses zuverlässig rekonstruierbaren 3D, in vitro generierten Tumormodells, das der in vivo Situation eines Plattenepithelkarzinoms sehr nahekommt, bietet der Wissenschaft eine sehr gute Möglichkeit, weitere Studien zum Tumorwachstum durchzuführen. Außerdem kann die Weiterentwicklung und Verbesserung vielversprechender, neuartiger chemotherapeutischer und radiologischer Therapieverfahren erheblich voran¬getrieben und dadurch die Heilungschancen mit geringeren Nebenwirkungen für den Patienten verbessert und eine erhöhte Lebensqualität erzielt werden.