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Neisseria meningitidis (Meningokokken) stellen einen häufigen Erreger von bakterieller Meningitis und generalisierter Sepsis bei Kleinkindern und Jugendlichen dar. Diese Bakterienspezies ist sehr kompetent für horizontalen DNA-Austausch durch Transformation, was zur einer sehr heterogenen Populationsstruktur führt. Innerhalb der Population gibt es wenige klonale Linien, die für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich sind, aber bei gesunden Trägern relativ selten gefunden werden. In den Achtziger Jahren trat ein hypervirulenter Klon in Kanada auf und war dort für die Mehrzahl der Erkrankungen verantwortlich. Dieser Klon wird als Elektrophoretischen Typ 15 (ET-15) bezeichnet und führt zu besonders schweren Erkrankungsverläufen, und einer hohen Letalität. In den Neunziger Jahren breitete sich dieser Klon in der Tschechischen Republik aus und trat 1998 im bayerischen Landkreis Rottal/Inn bei einem Ausbruch in Erscheinung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verbreitung von ET-15-Meningokokken unter 8000 Kindergartenkindern, Schülern und Bundeswehrsoldaten in elf Landkreisen und kreisfreien Städten sowie in sechs Bundeswehrkasernen untersucht. Die allgemeine Trägerrate an Meningokokken betrug 10,3%. Bei vier Probanden aus zwei Orten wurden ET-15-Meningokoken isoliert, was einer Trägerrate von 0,05% entspricht. Im Landkreis Rottal/ Inn wurden keine ET-15-Meningokokken gefunden. Während des Beobachtungszeitraumes ereigneten sich in Bayern vier Erkrankungsfälle durch diesen Bakterienklon. Der anschließende Vergleich der chromosomalen DNA mittels Pulsfeldgelelektrophorese nach SpeI-Verdau legte nahe, dass es sich bei den Trägerstämmen nicht um vier identische Klone handelte. Ebenso war kein gemeinsames Bandenmuster zwischen den vier Trägerisolaten und den vier Erkrankungsstämmen zu erkennen. Parallel dazu wurden die Träger- und Erkrankungsstämme mit identischen Referenzstämmen aus der Tschechischen Republik und aus Rottal/Inn verglichen, wobei sich auch hier kein gemeinsames DNA-Muster zeigte. Bei den Träger- als auch bei den Erkrankungsisolaten aus dem Untersuchungszeitraum in Bayern handelt es sich um neue Varianten des ET-15-Klones, die in Folge klonaler Expansion entstanden sein könnten. Die Inzidenz des ET-15-Trägertums in Bayern im Beobachtungszeitraum ist als niedrig einzuschätzen.
Neisseria meningitidis, ein pathogenes Bakterium, das schwere Fälle von Sepsis und Meningitis verursacht, interagiert während der Infektion mit verschiedenen Oberflächen des Wirtes. Die schnellstmögliche Anpassung an die spezifischen Milieubedingungen im Wirtsorganismus ist daher ein essentieller Schritt in der Pathogenese. Durch Verwendung von DNA-Mikroarrays, die auf gespotteten Oligonukleotiden basieren, wurde das Transkriptionsprofil von N. meningitidis während der Infektion von Epithel- und Endothelzellen analysiert. Zur Analyse wurde die isogene kapseldefiziente siaD-Mutante des N. meningitidis Stammes MC58 verwendet. 72 Gene konnten nach Kontakt mit Epithelzellen und 48 Gene nach Kontakt mit Endothelzellen als differential reguliert identifiziert werden. Darunter auch eine große Anzahl von Virulenzgenen. Während ein Teil der detektierten Gene in beiden Systemen als differentiell reguliert galt, gab es doch eine Anzahl von ORF´s, die nur für ein Zellkulturmodell spezifisch reguliert waren (59 spezifische Gene für HEp-2 und 35 spezifische Gene für HBMEC). Für einige ausgewählte Gene wurde die im Mikroarray detektierte Regulierung durch Quantitative RT-PCR nochmals bestätigt. Die Funktion von den als induziert identifizierten Genen rfaF, hem und NMB1843 wurde im Anschluß durch die Konstruktion von Mutanten näher untersucht. Das rfaF-Gen, eine in der LPS Biosynthese involvierte Heptosyl-II-transferase, wurde in beiden Zellkultursystemen als differentiell reguliert identifiziert. Die Deletion des Gens führte speziell für den bekapselten Stamm MC58 zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasion nach Infektion von Epithelzellen. Untersuchungen des Infektionspotential für HBMEC Zellen ergaben keine signifikant veränderte Adhärenz und Invasion. Bei zusätzlicher Deletion von rfaF in einem opc negativen Stamm konnte eine Abnahme der bakteriellen Aufnahme im Zellkulturmodell HBMEC beobachtet werden. Dagegen zeigten die opc, rfaF negativen Mutanten nach Kontakt mit HEp-2 Zellen keine verminderte Invasion. Weiterhin führte die Deletion des rfaF-Gens zu einer verstärkten Sensibilität gegenüber humanen Serum. Diese Daten deuten daraufhin, dass die LPS-Struktur eine Rolle in der bakteriellen Zellinteraktion spielt, speziell wenn eine für die Adhäsion wichtige Komponente nicht mehr exprimiert wird. Der ORF NMB1843, der für einen Transkriptionsregulator aus der MarR-Familie kodiert, ebenso wie das Hämolysin Gen konnten nur nach Kontakt mit HBMEC Zellen als differentiell reguliert identifiziert werden. In Infektionsstudien zeigten die hem-Mutanten keine veränderte Adhärenz und Invasion. Weiterhin war die Zytotoxizität der Mutanten nicht eingeschränkt. Ob der ORF NMB1646 daher als Hämolysin fungiert bleibt zu klären. Durchgeführte Mikroarraystudien mit den NMB1843-Mutanten, führten zur Identifizierung einiger ORF´s, die möglicherweise unter der Kontrolle dieses Regulators stehen. Dazu gehören die Virulenz assoziierten Gene sodC, iga und nadA sowie das für ein Hämolysin kodierende Gen NMB1779. Die Untersuchung des Expressionsprofils mittels SDS-PAGE Analyse führte zur Identifizierung einer Proteinbande bei 210 kDa, die spezifisch für die NMB1843 negativen Stämme ist. Dieses Protein wurde als nadA identifiziert. NadA induziert im Tiermodell bakterizide Antikörper und gilt daher als möglicher Impfstoffkandidat. Die in dieser Arbeit vorgelegten Daten liefern neue Einblicke in die Pathogenitätsmechanismen von N. meningitidis und belegen die Bedeutung der transkriptionellen Genregulation in den einzelnen Stadien der Meningokokkeninfektion.
Neisseria meningitidis ist eine der führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität sowohl bei Kindern als auch bei Erwachsenen. Die Typisierung ist die Grundlage für die epidemiologische Überwachung der Erkrankung durch Meningokokken. Die Endonuklease NmeDI ist spezifisch für die klonalen Linien des ST-8 und ST-11 Komplex Meninkokken, die mit Erkrankungen der Serogruppe C assoziiert sind. Deshalb wurde für die rasche Identifizierung von Stämmen dieser Linien ein monoklonaler Antikörper entwickelt. Der Antikörper erkennt spezifisch die ST-8 und ST-11 Komplex Meningokokken in Western-Blot und Dot-Blot. Er wird mitlerweile routinemäßig im Nationalen Referenzzentrum für Meningokokken zur Identifizierung der Linien ohne zusätzliche Anwendung der Multilokus Sequenz Typisierung (MLST) eingesetzt.
Im Rahmen der von November 1999 bis März 2000 durchgeführten bayerischen Meningokokkenträgerstudie wurden in zahlreichen Kindergärten und Schulen der bayerischen Gemeinden Ansbach, Augsburg, Erlangen, Griesbach, Ingolstadt, München, Pfarrkirchen, Sonthofen und Weiden insgesamt 287 Neisseria lactamica-Stämme isoliert. 26 ausgewählte, aus den benachbarten Städten Augsburg, Ingolstadt und München stammende Isolate wurden einer Multi-Lokus-Sequenztypisierung (MLST) zur Untersuchung ihrer genetischen Diversität unterzogen. Dabei wurden sowohl Sequenzen der 3 Stoffwechselgene argF, recA und rho, als auch Sequenzen des 16S rRNA-Gens analysiert. Für das 16S rRNA-Gen fanden sich zehn, für argF fünf, für recA acht und für rho neun differente Allele. Auf Basis der vier analysierten Gene konnten 17 verschiedene Genotypen definiert werden, von denen zwölf nur einmal, fünf hingegen mehrmals vorkamen. Es ist anzunehmen, dass durch Sequenzierung der vier in dieser Studie verwendeten Gene bereits eine ausreichende Diskriminierung von Neisseria lactamica erfolgte, da Versuche eine weiterführende Diskriminierung durch Sequenzierung des porB-Gens zu erreichen, keine wesentlichen zusätzlichen Informationen erbrachten. Durch visuelle Inspektion der Sequenzen konnte bei allen vier Genloci das Überwiegen von Rekombinationsereignissen gegenüber Punktmutationen bestätigt werden, so dass für die Spezies Neisseria lactamica horizontaler Gentransfer anzunehmen ist. Da nur ein einziger Genotyp in zwei verschiedenen Städten beobachtet wurde, zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass eine klonale Ausbreitung von Neisseria lactamica nur dann nachweisbar ist, wenn eine epidemiologische Verknüpfung zwischen Trägern besteht.
128 Meningokokkenstämme unterschiedlicher klonaler Linien und Serogruppen aus verschiedenen Ländern wurden im Rahmen eines Screenings auf die Präsenz von Plasmiden untersucht. Aus 66% der Stämme konnten Plasmide isoliert werden. Diese waren innerhalb der verschiedenen klonalen Linien spezifisch verteilt. Das 1,986 kb große Plasmid pJS-A (EMBL Accession Number AJ238491) fand sich ausschließlich in Serogruppe A Stämmen der Subgruppe VI. Das 7,245 kb große Plasmid pJS-B (EMBL Accession Number AJ277475) wurde in 91% der untersuchten ET-37 Stämme und in 67% der nahe verwandten Cluster A4 Stämme gefunden. Es ist ein hochspezifischer Marker für diese klonalen Linien. Aus Vertretern des ET-5 Komplexes konnten keine Plasmide isoliert werden. Die Plasmide pJS-A und pJS-B wurden vollständig sequenziert. Beide zeichnen sich durch einen für Meningokokken untypisch hohen AT-Gehalt aus (pJS-A: 55,4%, pJS-B: 57,9%). Auf pJS-A befinden sich zwei, auf pJS-B acht offene Leseraster. Der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ergab für beide Plasmide keine signifikanten Homologien zu Datenbankeinträgen. Für pJS-B wurde an Position 20 bis 307 eine 93%ige Identität mit einer für das Genom des Gonokokkenstammes MS11-A beschriebenen Region festgestellt, welche die beiden Inverted Repeats IR1 und IR2 enthält und dem Gen pivNG benachbart ist, das für eine Rekombinase kodiert. Bei der Repeat-Region des Gonokokkenstammes MS11-A handelt es sich nach Carrick et al. möglicherweise um eine Rekombinationsstelle. Es konnte gezeigt werden, dass pJS-B über seine homologe Repeat-Region chromosomal integriert. Ob es jedoch als wirkliches Plasmid eigenständig replizieren kann, bleibt zweifelhaft. pJS-A und pJS-B stellen Beispiele für die spezifische und stabile Verteilung von DNA-Elementen in einer Bakterienpopulation dar, die sich grundsätzlich durch genetische Vielfalt und regen Austausch von DNA auszeichnet. pJS-B ist eines von vielen DNA-Elementen, die für den ET-37 Komplex und den Cluster A4 spezifisch sind. Dies unterstützt das Konzept der genetischen Isolierung dieser hypervirulenten Linien.