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Rolle der gammadelta T-Zellen in der Immunantwort bei Patienten mit gastrointestinalen Tumoren
(2022)
Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Frage nach der Fähigkeit der selektiven Stimulierung mittels des Phosphorantigens HMBPP und den beiden BTN3 Antikörpern bestätigt werden. Es konnte zudem wie erwartet hierbei ein Unterschied zwischen den beiden Kohorten detektiert werden. Dabei zeigte die Kohorte der Normalspender erwartungsgemäß eine stärkere Aktivierungs- sowie Proliferations-fähigkeit. Normalspender ließen sich signifikant besser mit HMBPP aktivieren und bei bestimmter Konzentration signifikant besser proliferieren, bei BTN3A und sc20.1 konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden, allerdings anhand der Mittelwerte eine deutlich stärkere Aktivierung und Proliferation aufgezeigt werden. Außerdem konnten interessante interindividuelle Unterschiede detektiert werden, die neue Erkenntnisse brachten. Mit Hilfe der untersuchten Oberflächenmoleküle CD45RA und CD27 und der Einteilung der gammadelta T-Zellen in unterschiedliche Subgruppen konnten so mögliche Erklärungen für die Unterschiede zwischen den Kohorten aufgezeigt werden. Normalspender zeigten signifikant höhere Anteile an naiven gammadelta T-Zellen und nicht signifikant höhere Anteile an central memory T-Zellen, demnach eine deutliche Verschiebung in Richtung nicht differenzierter Subsets, wohingegen die Tumorkohorte signifikant höhere effector memory T-Zellen aufwiesen und somit eine deutliche Verschiebung in Richtung differenzierter Subsets. Dadurch kann erklärt werden, weshalb Normalspender besser aktiviert werden und besser proliferieren können. Auch die Einteilung in unterschiedliche Profile 1-6 anhand CD28, CD27 und CD16 lieferte Gründe für den Unterschied zwischen den Kohorten, wobei Normalspender der Gruppe 1 und 2, Tumorpatienten der Gruppe 3 und 4 angehörten. Durch Ermittlung weiterer signifikanter Änderungen einiger exprimierter Oberflächenmoleküle CD39, CD161 und PD1 wurde mit Hilfe der vorliegenden Arbeit bekräftigt, dass einige Faktoren betrachtet werden müssen, die die Proliferation und Aktivierung der gammadelta T-Zellen positiv und negativ beeinflussen können. Es konnte jedoch auch erneut verdeutlicht werden, wie komplex und weitgreifend der Aktivierungsmechanismus, die damit verbundene Expansion und die Auslösung der einzelnen Effektorfunktionen ist.
Die Einführung der Tyrosinkinaseinhibitoren (TKIs) stellt einen Meilenstein der Hämatoonkologie im 21. Jahrhundert dar. Im Kontext der chronisch myeloischen Leukämie (CML) konnte das BCR-Abl-Fusionstranskript als pathognomonisches Korrelat identifiziert werden. Dessen pharmakologische Hemmung über bestimmte TKIs korrelierte nicht nur mit hervorragenden Remissionsraten, sondern auch mit einer deutlich besseren Verträglichkeit.
Dasatinib verfügt als Zweitgenerations-TKI neben einer hohen Bindungsaffinität zum BCR-Abl-Fusionstranskript als Multi-TKI auch über weitere Zielstrukturen, zu welchen u.a. die Kinasen der Src-Familie (SFKs) gehören. Diese übernehmen bei verschiedenen Immunzellen wichtige regulatorische Funktionen. Bei einem Teil der CML-Patienten kann die TKI-Therapie unterbrochen werden und es findet sich eine anhaltende Remission. Hierfür wurden immunmodulatorische Effekte der TKIs angenommen. Für Dasatinib konnten in vitro und in vivo immunmodulatorische Effekte, u.a. auf T- und NK-Zellen nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten mögliche immunmodulatorische Effekte auf dendritische Zellen monozytärer Abstammung (moDZ) in vitro untersucht werden.
Die Generierung von moDZs erfolgte mittels Zugabe von IL-4 und GM-CSF aus Monozyten gesunder Blutspender. Dasatinib wurde in klinisch relevanten Konzentrationen (10-50 nM) ab Beginn der DZ-Generierung zugegeben, für ausgewählte Experimente auch kurz vor Reifung mit LPS. Dabei wurde der Einfluss von Dasatinib auf die Generierung von moDZs sowie wichtige Funktionen unreifer (Endozytose) und reifer DZs (Expression von zellulären und humoralen Effektorfunktionen) analysiert.
Dasatinib bewirkte in einer Konzentration von 50 nM eine verminderte Generierung von moDZs aus Monozyten. Phänotypisch zeigte sich dabei eine verminderte Expression des DZ-typischen Markers CD1a bei einer persistierenden Expression des monozytären Markers CD14. Parallel fand sich auch eine Population CD1a/CD14-koexprimierender Zellen. Daneben konnte auch eine Apoptosesteigerung unter Dasatinib nachgewiesen werden. In Bezug auf die Makropinozytose FITC-konjugierter Dextranpartikel wurde keine relevante Modulation beschrieben. Nach Reifung mit LPS bewirkte Dasatinib 50 nM eine verminderte Expression der costimulatorischen Oberflächenmarker CD80 und CD86, sowie eine verminderte Sekretion von IL-12.
Zusammenfassend zeigen unter Dasatinib generierte moDZs Eigenschaften, welche auch bei regulatorischen DZs beschrieben wurden. Eine Behandlung mit Dasatinib könnte folglich Immunantworten negativ modulieren.
T-Lymphozyten des Empfängers können über den direkten oder indirekten Weg der Allo-Antigenerkennung Spender-MHC-Moleküle (Allo-Antigene) erkennen. Hieraufhin werden diese aktiviert und können anschließend eine Transplantatabstoßung auslösen. In der Klinik wird die Transplantatabstoßung durch den Einsatz von Immunsuppressiva verhindert. Ein großer Nachteil ist, dass sich die Immunsuppression auf sämtliche T-Lymphozyten gleichsam auswirkt - unabhängig von ihrer Spezifität. Somit sind nicht nur T-Lymphozyten betroffen, die Allo-Antigene erkennen, sondern auch solche, die für die Abwehr von Infektionen notwendig sind bzw. die Entstehung von Malignomen verhindern. Dies korreliert mit klinischen Beobachtungen, wonach organtransplantierte Patienten ein höheres Risiko aufweisen, an schweren Infektionen oder Neoplasien zu erkranken. Wünschenswert wäre somit eine selektive Suppression ausschließlich der an der Abstoßung beteiligten T-Lymphozyten. In dieser Arbeit wurde die biologische Funktion von zwei synthetischen Allopeptid-Antigenen, RT1.B2 und RT1.D2, untersucht. Die Peptide, die mit bestimmten Sequenzen von MHC-Klasse II-Molekülen des Spenders identisch sind, aktivieren über den indirekten Weg der Allo-Antigenerkennung alloreaktive T-Lymphozyten des Empfängers. RT1.D2 erwies sich dabei als das immunogenere Peptid. Wurden die Empfänger vor Transplantation mit diesen Peptiden immunisiert, so verkürzte sich die Transplantatfunktionszeit um 2 Tage. Nicht-immunisierte Empfängertiere wiesen eine Transplantatfunktionszeit von 5,3 +/- 0,5 Tage auf, nach Immunisierung mit RT1.B2 bzw. RT1.D2 verringerte sich die Transplantatfunktionszeit auf 3,5 bzw. 3,3 Tage. Die Verkürzung der Transplantatfunktionszeit durch Immunisierung mit Allopeptiden wurde auch nach einer kurzfristigen Immunsuppression mit CsA beobachtet. Im Gegensatz dazu führte eine Verlängerung der Immunsuppression auf 30 Tage nach Transplantation zu einer Verlängerung der Transplantatfunktionszeit, wenn zuvor mit dem Allopeptid RT1.B2 immunisiert wurde. Das Konzept dieser Arbeit war, die prä- und intraoperative Applikation von Allopeptiden, die nachweislich an der Transplantatabstoßung durch Induktion alloreaktiver T-Lymphozyten beteiligt sind, mit einer niedrig-dosierten Immunsuppression zu kombinieren, die alleine nicht in der Lage ist, die spät-akute Abstoßung des Dünndarmtransplantates zu verhindern, um somit gezielt die alloreaktiven T-Lymphozyten zu eliminieren. Dies gelang nach Applikation des weniger immunogenen Allopeptides RT1.B2 in Kombination mit niedrig dosiertem CsA: Nahezu die Hälfte der so behandelten Tiere wies nach Dünndarmtransplantation eine Transplantatlangzeitfunktion auf. Histologische Untersuchungen der Transplantate zeigten keine bzw. allenfalls leichte Veränderungen im Sinne einer chronischen Transplantatabstoßung. Auf zellulärer Ebene konnten in derartig behandelten Tieren mittels indirektem Proliferationsassay an Tag 40 nach Transplantation keine RT1.B2-reaktiven T-Lymphozyten mehr nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass die Kombination aus Immunisierung mit dem Peptid RT1.B2 und einer niedrig dosierten Immunsuppression zu einer selektiven Immunsuppression führt, bei der die RT1.B2-spezifischen T-Lymphozyten inhibiert bzw. depletiert werden.
Natalizumab ist ein monoklonaler gegen alpha 4-Integrine (CD49d) gerichteter Antikörper, der zur Therapie der schubförmigen Multiplen Sklerose zugelassen ist. Sein Hauptwirkmechanismus beruht auf einer Blockade von VLA-4 (CD49d/CD29) auf Leukozyten, deren Extravasation an der Blut-Hirn-Schranke hierdurch gehemmt wird. Gemäß seiner Konzeption sollte Natalizumab neben seiner blockierenden Eigenschaft keinen weiteren Einfluss auf seine Zielzellen ausüben. Der hohen therapeutischen Effektivität stehen jedoch Begleiterscheinungen gegenüber, die auf direkte oder indirekte immunmodulatorische Kapazitäten von Natalizumab hindeuten. In verschiedenen Studien konnten VLA-4, sowohl durch Antikörper- als auch durch Liganden-vermittelte Aktivierung, Eigenschaften als kostimulatorisches Molekül humaner T-Zellen zugewiesen werden. Ob der Antikörper Natalizumab auf VLA-4 rein blockierend wirkt oder ob er (ko-)stimulatorische Signale in T-Zellen induziert, ist bis heute unbekannt. Vor diesem Hintergrund wurden RNA-Expressionsanalysen von humanen CD4+ T Zellen mittels Microarrays durchgeführt. Tatsächlich konnte eine erhöhte Expression der Gene IL2 und IFNG sowie der Th17-Effektorzytokine IL17A, IL17F und IL21 durch Anwesenheit von Natalizumab festgestellt werden. Ebenfalls wurde eine gesteigerte Genexpression der Transkriptionsfaktoren FOXP3, TBX21 und RORC beobachtet. Die erhöhte Genexpression von IL2, FOXP3, TBX21 und RORC wurde mittels qRT-PCR validiert. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden verschiedene Effektorzytokine durchflusszytometrisch untersucht. Hierbei zeigten neben IL2 die Interleukine IL17 und IFNγ eine erhöhte Syntheserate unter dem Einfluss des therapeutischen Antikörpers. Die Allgemeingültigkeit des kostimulatorischen Effekts wurde anhand der Fähigkeit von Natalizumab verschiedene T-Zellstimuli zu verstärken verdeutlicht. Die Ergebnisse belegen eine direkte Korrelation zwischen der Anwesenheit von Natalizumab und der Ausbildung proinflammatorischer IL2+, IL17+ und IFNγ+CD4+ T-Zellen in vitro und deuten u.a. auf eine verstärkte Polarisierung naïver CD4+ T-Zellen in Richtung Th1- und Th17-Zellen hin. Übereinstimmend mit direkten immunmodulatorischen Eigenschaften über Bindung und Aktivierung von VLA-4 resultierte die Anwesenheit von Natalizumab nicht nur bei Jurkat-Zellen sondern auch in primären humanen CD4+ T-Zellen in einer erhöhten ERK-Phosphorylierung. Weiterhin konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Gabe des Therapeutikums und der CD49d-Reduktion auf humanen CD4+ Effektorzellen bzw. CD4+ Gedächtnis-T-Zellen in vitro hergestellt werden. Dieses Resultat erhärtet den Verdacht, dass es sich bei dem Verlust an VLA-4 auf verschiedenen Leukozytenpopulationen, der bereits in mehreren Studien in vivo beobachtet werden konnte, um eine direkte Auswirkung von Natalizumab handelt. Die in vitro an isolierten T-Zellen von gesunden Spendern gewonnenen Resultate konnten anhand von Zellen aus MS-Patienten reproduziert werden. Bereits 24h nach Natalizumab-Erstgabe wurde sowohl eine deutliche Reduktion an CD49d als auch eine erhöhte IL2-, IL17-, IFNγ- und IL12/IL23p40-Sekretion nachgewiesen. Das unterstreicht die klinische Relevanz dieser Ergebnisse und lässt vermuten, dass Natalizumab neben der Hemmung der Leukozyten-Transmigration ins ZNS Signal-gebende Eigenschaften besitzt, die zu ungewünschten Nebenwirkungen führen können.
Analyse der Expression und möglicher signalinduzierender Eigenschaften des CD1d-Moleküls der Ratte
(2010)
Wie MHC Klasse I und II-Moleküle präsentieren CD1d-Moleküle dem TCR Antigene, allerdings Lipide und Glykolipide und nicht Proteinfragmente. Die Entdeckung der massiven TH1- und TH2-Zytokinproduktion von Typ I-NKT-Zellen nach CD1d-vermittelter Erkennung von α-Galactosylceramid, einem aus dem Meeresschwamm gewonnenen Glykosphingolipid, weckte großes Interesse an ihrem immunregulatorischen Potential und ihrem möglichen Nutzen für neue Immun- und Tumortherapien. Um die Funktion und die Bedeutung von CD1d besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Expressionslevel der lymphatischen Gewebe der Ratte und der Maus untersucht. Hierfür wurden die neu generierten monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 verwendet, die die CD1d-Moleküle von Ratte und Maus binden und so den direkten Vergleich beider Spezies ermöglichen. Sowohl die isolierten Zellen des Thymus und der Milz als auch des Lymphknotens waren in der LEW- und F344-Ratte sowie in der BALB/c-Maus schwach bis stark CD1d positiv. In der LEW-Ratte und in der F344-Ratte wiesen jeweils ca. 18% der Milzzellen eine vergleichsweise erhöhte CD1d-Expression auf. Dabei handelte es sich in erster Linie um Marginalzonen-B-Zellen. Bestimmte Subpopulationen der Dendritischen Zellen und vermutlich Makrophagen stellten die restlichen CD1d stark positiven Populationen dar. Nur ca. 2% der isolierten Zellen der Lymphknoten der LEW-Ratte waren stark CD1d positiv, wohingegen der LEW-Thymus gemäß dem noch geringeren Anteil an APC kaum Zellen mit erhöhter CD1d-Expression enthielt. In der BALB/c-Maus war der Anteil CD1d stark positiver Milzzellen mit 4% deutlich geringer als in der LEW- oder F344-Milz. Abgesehen von MZ-B-Zellen konnten in der Maus kaum Populationen mit starker CD1d-Expression in den verschiedenen Färbungen festgestellt werden. Demnach stellt CD1d sowohl in der Ratte als auch in der Maus einen guten Marker für MZ-B-Zellen dar. Demgegenüber zeigten vereinzelt kleine Populationen der Milz, des Lymphknotens und des Thymus beider Spezies eine verminderte oder gar keine CD1d-Expression. Zur Analyse möglicher signalinduzierender Eigenschaften der verschiedenen Anti- CD1d-Antikörper wurden ihre Effekte auf rCD1d+ Transduktanten und primäre Zellen untersucht. 58/4 konnte im Gegensatz zu 232 spezifisch über Bindung an Ratten- CD1d Zelltod und Aggregatbildung in Tumor-B-Zellen des Menschen und der Maus, aber nicht in Tumor-T-Zellen, induzieren. Der zytoplasmatische Schwanz der CD1d-Moleküle scheint an der Aggregatbildung beteiligt zu sein. Die Bindung von 58/4 oder 232 führte in überlebenden rCD1d+ Raji-Zellen zu einer ähnlich starken Internalisierung der CD1d-Moleküle. Während nach 5-stündiger Inkubation mit 232 und erneuter CD1d-Färbung wieder die vorherige CD1d- Expression festgestellt wurde, konnte nach Inkubation mit 58/4 eine bleibende Herunterregulierung beobachtet werden. Folglich bewirkte 58/4 ein anderes bzw. stärkeres Signal in den Zellen als 232. Diese Beobachtungen stützen die Signaltransduktion als mögliche weitere Funktion der CD1d-Moleküle neben der Antigenpräsentation und definieren die monoklonalen Antikörper 232 und 58/4 als nützliche Werkzeuge für weitere Studien zur Analyse der molekularen Mechanismen der CD1d-vermittelten Signaltransduktion. Das Verständnis solcher Mechanismen bildet wiederum die Grundlage für die Entwicklung neuer Therapien z. B. zur Eliminierung CD1d exprimierender Tumore.
Das NKG2D (Natural Killer Group 2 Member D)-Protein, ist ein aktivierender Rezeptor, der es NK- und CD8+ T-Zellen ermöglicht, infizierte oder transformierte körpereigene Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Eine Fehlregulation dieses Rezeptors auf Immunzellen scheint jedoch auch zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen wie Typ I Diabetes, Zöliakie und RA zu führen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein humaner Antikörper gegen hNKG2D für einen möglichen therapeutischen Einsatz bei Autoimmunerkrankungen generiert. Basierend auf den Sequenzen von schwerer (VH) und leichter Kette (VL) der murinen monoklonalen Antikörper 6H7 und 6E5A7, welche hNKG2D spezifisch binden und die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor blockieren, wurden scFv-Phagenbibliotheken hergestellt. Diese wurden anschließend zur Selektion im Phagen-Display eingesetzt. Der Humanisierungsprozess erfolgte hierbei mit Hilfe des Guided Selection-Verfahrens. Dazu wurde in einem ersten Phagen-Display-Durchgang die VH-Domäne des parentalen scFv mit einem humanen VL-Repertoire kombiniert. Die beiden daraus resultierenden humanen VL-Ketten wurden im darauf folgenden Schritt mit einem Repertoire an humanen VH-Domänen verknüpft. Da hierbei kein humaner rekombinanter scFv mit hNKG2D-Bindungsaktivität identifiziert werden konnte, musste eine schrittweise Humanisierung der Framework-Regionen (FR) der VH unter Beibehaltung der murinen CDR-Bereiche erfolgen. Diese führte zur Generierung des humanen scFv E1VLV71KVH, welcher neben den murinen CDR-Regionen lediglich noch drei Aminosäuren murinen Ursprungs im FR-Bereich besaß. Dessen biologische Aktivität wurde nach Konvertierung in das IgG1/lambda-Format in verschiedenen in vitro-Systemen analysiert. Anhand der Ergebnisse aus diesen Versuchen konnte ein deutlicher Verlust der Affinität und inhibitorischen Aktivität nach der Humanisierung festgestellt werden. Die dadurch erforderliche Affinitätsmaturierung des E1VLV71KVH Antikörpers mittels sequentieller Randomisierung des CDR3-Bereichs von E1VL und V71KVH resultierte in fünf unterschiedlichen, hoch-affinen Anti-hNKG2D scFv. Zwei dieser generierten Konstrukte, B1VLB6VH und E4VLG10VH, wurden nach ihrer Herstellung als vollständige IgG1/lambda-Antikörper in vitro hinsichtlich ihrer Aktivierungs- und Neutralisierungsaktivität, sowie ihrer Stabilität und Internalisierung durch NK-Zellen untersucht. Beide Antikörper wiesen nach der Affinitätsmaturierung mit einem IC50 von ca. 3,4x 10-2 µg/ml ein wesentlich höheres Inhibitionspotential als der murine Ursprungsantikörper (ca. 3,3 µg/ml) auf und zeigten gegenüber Hitzeeinwirkung und Serumproteasen eine hohe Stabilität. Mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Untersuchungen konnten Internalisierungsvorgänge der Antikörper in die NK-Zelle beobachtet werden. Für ein besseres Verständnis NKG2D-abhängiger Regulationsvorgänge und die Identifizierung NKG2D-spezifischer Zielgene wurde das Genexpressionsprofil von humanen NK-Zellen nach Interaktion mit dem NKG2D-Liganden ULBP-1Fc mittels Microarray untersucht. Infolge einer anschließenden Validierung der Ergebnisse auf RNA- und Proteinebene konnten mittels RT-qPCR, FACS, ELISA und CBA NKG2D-spezifische Biomarker wie CRTAM, TNFalpha, IFNgamma und GM-CSF etabliert werden. Ergänzend zu 51Cr-Freisetzungs-Experimenten in zwei unterschiedlichen in vitro Zellkultursystemen ermöglichten diese Biomarker eine umfassende Charakterisierung neutralisierender und aktivierender Eigenschaften der beiden Antikörper B1VLB6VH und E4VLG10VH. Anhand dieser Experimente konnte festgestellt werden, dass die humanen Anti-hNKG2D Antikörper eine ambivalente Funktionalität aufweisen. In Lösung sind sie in der Lage, NKG2D-induzierte CRTAM-Expression, Zellyse und Zytokinfreisetzung zu inhibieren. Nach Kreuzvernetzung des NKG2D-Rezeptors über an Platten immobilisierte Anti-hNKG2D Antikörper hingegen lassen sich aktivierende Eigenschaften wie Zellyse und Zytokinsekretion durch NK Zellen beobachten. Aufgrund ihrer ambivalenten Aktivität scheint ein therapeutischer Einsatz der beiden Antikörper bei humanen Autoimmunerkrankungen zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden somit die Voraussetzungen geschaffen, um einen humanen, hoch affinen hNKG2D neutralisierenden Antikörper in einem letzten Schritt in ein besser geeignetes Antikörper-Format (scFv, Fab oder F(ab)2) zu konvertieren.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind starke Suppressoren des Immunsystems. Für die immunsupressive Wirkung werden lösliche Faktoren propagiert. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob neben den bekannten Sekretionsfaktoren stromaler Stammzellen wie RANK/RANKL/OPG, TNFα, IFNγ und verschiedene Interleukine, andere Sekretionsfaktoren eine immunmodulatorische Wirkung auf monozytäre Zellen haben. Als Sekretionsprodukt wurde hCyr61 untersucht, das im Überstand von mit TNFα behandelten humanen fetalen Osteoblasten (hFOB) nachgewiesen worden war. Das zur CCN-Familie gehörende Protein hCyr61 ist an der Angiogenese beteiligt, wird im Kallus während der Frakturheilung vermehrt exprimiert und hat, wie zwischenzeitlich nachgewiesen wurde, einen deutlichen Effekt auf die Differenzierung endothelialer Vorläuferzellen aus monozytären Zellen. In den hier beschriebenen Experimenten wurden sowohl monozytäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC), als auch THP1-Zellen auf die Veränderung der CD14-, 80-, 83- und 86- Expression unter Stimulation mit und ohne Il-4, GM-CSF und hCyr61 untersucht. Die Expressionsänderung wurde mittels konventioneller PCR, real-time PCR und FACS-Analyse untersucht. In allen drei Nachweismethoden zeigte sich ein Verlust typisch monozytärer Marker wie CD14 unter Stimulation mit hCyr61. Der Verlust an CD14 scheint bei PBMC deutlicher als bei THP1-Zellen, was möglicherweise durch die oben beschriebene endotheliale Differenzierung erklärt wird. THP1-Zellen befinden sich bereits in einer höheren Differenzierungsstufe, sodass sie ihr monozytäres Commitment nicht vollständig verlieren.
Flavonoide sind weitverbreitete sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe. Ihr Beitrag zur Prävention von chronischen Erkrankungen wird zu großen Teilen auf immunmodulatorische und neuroprotektive Effekte zurückgeführt. Eine Voraussetzung für die Nutzung dieser Eigenschaften der Flavonoide stellt die Erfassung cytotoxischer Effekte dar. Mit Ausnahme von Xanthohumol und Quercetin ist für alle im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten Flavonoide, Hispidulin, Baicalein, Scutellarein, Hesperetin, Chrysin, Apigenin, Naringenin, Catechin, Pelargonidinchlorid und EMD 21388, sowohl in T-Zellen (Jurkat) als auch in neuronalen (SK-N-SH)-Zellen nach 24-stündiger Inkubation eine geringgradige Cytotoxizität festzuhalten. Für Xanthohumol bzw. Quercetin wird ein halbmaximaler Verlust der Zellvitalität je nach Modell in Konzentrationen von 33-45 µM bzw. 118-208 µM erreicht. Der weiterführenden Charakterisierung (zVAD, DNA-Laddering) ist zu entnehmen, dass die zellulären Veränderungen substanzabhängig differieren und sowohl nekrotische Mechanismen (Xanthohumol) als auch apoptotische Vorgänge (Quercetin) einschließen. Eine erhöhte Lipidperoxidation im oberen Dosisbereich lässt darüber hinaus auf eine Beteiligung von oxidativem Stress an den von Xanthohumol-induzierten nekrotischen Prozessen schließen. Eine positive Einflussnahme auf die Zellvitalität durch Antioxidantien wie GSH und NAC lässt des Weiteren vermuten, dass die erfassten Flavonoid-induzierten Prozesse jeweils sensitiv zum Redoxzustand der Zelle sind. Während die Effekte von Xanthohumol auch in anderen Zellmodellen (HL-60) nachweisbar bleiben, verhält sich Quercetin nicht durchgehend vitalitätsmindernd. Unterschiede zwischen den Testsubstanzen bestehen auch hinsichtlich antioxidativer Effekte. Das Eliminieren freier Radikale zählt zu den wichtigsten Mechanismen, die bei Flavonoid-vermittelter Neuroprotektion eine Rolle spielen. Insgesamt sind alle diesbezüglich untersuchten Substanzen als starke Superoxidanionen-Radikalfänger einzustufen. Im Co-Inkubationsversuch zeigt Scutellarein den stärksten Effekt, gefolgt von Quercetin, Hispidulin und Xanthohumol. Im Prä-Inkubations-Versuchsmodell liegen in der Reihenfolge ihrer Effektstärken Xanthohumol vor Quercetin, Hispidulin und schließlich Scutellarein. Die modellabhängigen Konstanten können, unter Beteiligung einer passiven Diffusion der hydrophoben Flavonoidaglykone, auf eine substanzgebundene Membranpermeabilität zurückzuführen sein. Das antioxidative Potential der Flavonoide resultiert u.a. aus einer komplexen Einflußnahme auf die Genexpression in der Zelle. In der vorliegenden Arbeit sind anhand von cDNA-Arrays für mehrere Vertreter übereinstimmend Wechselwirkungen mit Genen der zellulären Abwehr dargestellt. Demnach führen Scutellarein, Hispidulin, Quercetin und Xanthohumol zu einer deutlich reduzierten Expressionsstärke von STK4, CHD4, ARHGDIB, IL16, ISG20, PFN1 und SOD2. Unter den Flavonoid-induzierten Veränderungen ragen die Effekte auf ADAR1 heraus, dessen Genexpression von Scutellarein bis auf ein 0,1-faches der Referenzwerte reduziert wird. Gleichsinnige Auswirkungen von Scutellarein auf die Expression von ADAR1-Protein in Western Blots unterstreichen diese Interaktion und legen nahe, dass ADAR-vermittelte enzymatische Deaminierungen durch Flavonoide moduliert werden können. Diese Beobachtung wird ergänzt durch den nachgewiesenen Effekt von Flavonoiden auf die Expression einer Reihe weiterer Gene (ADAR2, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3F und APOBEC3G), die analoge posttranskriptionale Mechanismen steuern und gleichermaßen in Immunabwehr und Neuroprotektion eingebunden sind. Zu den wichtigsten Substraten von ADAR zählen Glutamatrezeptoren. Erwartungsgemäß ist nach der Einwirkung von Scutellarein auf humane Zellen, die Glutamatrezeptoren exprimieren, ein Rückgang der Deaminierung im Bereich der Glutamatrezeptoruntereinheit GluR 2 zu verzeichnen (Q/R-Position). Dem entspricht in elektrophysiologischen Modellen eine gesteigerte Ca2+-Permeabilität der jeweiligen Ionenkanäle und eine veränderte neuronale Exzitabilität. Hieraus ergibt sich ein breites Spektrum zusätzlicher Optionen für die Induktion von gesundheitsrelevanten Flavonoidfunktionen in der Zelle. So spielt die Modulation von Deaminierungen zugleich eine entscheidende Rolle im Vermehrungszyklus viraler Erreger. Die Annahme einer möglichen antiviralen Qualität von Scutellarein wird durch ein HBV-Infektionsmodell anhand drei Parameter der Virusreplikation (Virus-DNA-Konzentration, HBs- bzw. HBe-Antigenproduktion) bestätigt. Offen bleibt auch nach ausführlicher Prüfung, ob der deutliche antivirale Effekt als das Produkt von Flavonoid-induzierten Veränderungen der Deaminierungsraten oder als Folge eines Effekts auf die virale Polymerase zu interpretieren ist. Die hier dargestellten Wirkmechanismen leisten einen Beitrag zum Verständnis der Bedeutung von Flavonoiden für neue Anwendungen in Neuroprotektion und Immunabwehr.
Immunzellen mit hemmenden bzw. regulatorischen Eigenschaften erscheinen sehr attraktiv, um ungewollte Immunantworten, wie sie z.B. nach Transplan¬tationen auftreten, selektiv zu hemmen. In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, dass sich mit GM-CSF und IL-4 immunregulatorische Dendritische Zellen (IL-4 DC) aus hämatopoetischen Vorläuferzellen des Knochenmarks der Lewis-Ratte generieren lassen. In der vorliegenden Arbeit wurden Makrophagen aus Knochenmarkvorläuferzellen mit M-CSF und IL-4 (IL-4 Makrophagen) generiert und mit den IL-4 DC hinsichtlich ihres Phänotyps und ihrer immunologischen Eigenschaften verglichen. M-CSF Makrophagen, die nur mit M-CSF generiert wurden, dienten hierbei als Kontrolle. Im Gegensatz zu reifen DC (mDC), die aus der Milz isoliert wurden, sind weder M-CSF Makrophagen noch IL-4 Makrophagen bzw. IL-4 DC in der Lage, naive T Lymphozyten in vitro zu aktivieren. Zudem wurde eine Zellzahl-abhängige Hemmung der mDC induzierten T Zell-Aktivierung beobachtet. So hemmten IL-4 Makrophagen die mDC-induzierte T-Zellproliferation nahezu vollständig (bis zu 96%), wenn sie in einem Zellverhältnis von 1:1 (IL-4 Makrophagen:mDC) als Kompetitorzellen eingesetzt wurden. Ähnliche Effekte waren auch für M-CSF Makrophagen und IL-4 DC zu beobachten. Zwar ist nicht geklärt, wie die Zellen diesen hemmenden Effekt vermitteln, doch lassen die Daten der vorliegenden Arbeit sowohl einen durch Oberflächenmoleküle als auch lösliche Mediatoren vermittelten Mechanismus für möglich erscheinen. Durchflusszytometrische Analysen, ergänzt durch Immunhistochemie und Real time PCR, zeigten für IL-4 Makrophagen und M-CSF Makrophagen einen Phänotyp, der gegenüber IL-4 DC, eine geringere Expression von CD80 und CD86 auf der Zelloberfläche aufwies. Die IL-4 DC wiesen ihrerseits eine geringe Expression von CD80 und CD86 in Vergleich zu mDC auf, wie in vorangegangenen Arbeiten gezeigt wurde. Alle drei Subpopulationen waren positiv für MHC I und CD40, während IL-4 Makrophagen und IL-4 DC zusätzlich positiv für MHC II waren. T Lymphozyten in Kokultur mit IL-4 Makrophagen bzw. mit M-CSF Makrophagen oder IL-4 DC wiesen nur eine geringe Proliferation auf, wenn sie anschließend mit mDC restimuliert wurden. Diese Daten deuten darauf hin, dass IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC naive T-Lymphozyten dauerhaft in ihrer Restimulierung hemmen. Dieser anergische Zustand ist möglicherweise auf die unzureichende Kostimulation zurückzuführen. Zudem wurde bei den mit IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC kokultivierten T Lymphozyten eine geringfügig erhöhte Rate an apoptotischen Zellen gemessen als bei T Lymphozyten, die zuvor alleine oder mit mDC kultiviert wurden. Auch von IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC sezernierte lösliche Faktoren können eine Rolle bei der Hemmung der T-Zellaktivierung spielen. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC, hemmten die mDC-induzierte T-Zellaktivierung mit einer Suppressionsrate von 81-85%. Mit einer nahezu vollständigen Hemmung der T-Zellaktivierung war der Effekt von Überständen aus 48-stündigen Kulturen sogar noch stärker. Wie anhand von ELISA und real time PCR gezeigt wurde, exprimierten IL-4 Makrophagen, M-CSF Makrophagen und IL-4 DC das immuninhibitorische Zytokin TGF-Beta, das für die beobachtete Hemmung der T-Zellproliferation verantwortlich sein könnte. Die Ergebnisse zeigen somit, dass die aus Knochenmarkvorläuferzellen generierten IL-4 Makrophagen und M-CSF Makrophagen die Aktivierung naiver T-Lymphozyten hemmen. Diese Eigenschaft teilen sie sich mit IL-4 DC trotz deutlicher Unterschiede bei den Phänotypen dieser Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass die aus hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks hergestellten Dendritische Zellen und Makrophagen die Aktivierung naiver T-Lymphozyten effektiv hemmen. Der Mechanismus, wie dieser hemmende Effekt vermittelt wird, ist zurzeit noch unbekannt und sollte in weiteren Arbeiten analysiert werden. Von grundlegender Bedeutung wäre der erfolgreiche Nachweis, dass diese Zellen ungewollte Immunantworten antigen¬spezifisch hemmen.
Die allergenspezifische Immuntherapie ist derzeit die einzige kausale Behandlungsmöglichkeit von Soforttypallergien. Trotzdem ist weiterhin unklar, welcher Parameter für den Behandlungserfolg einer spezifischen Immuntherapie (SIT) pathogenetisch bedeutsam ist. Zusammenfassend zeigte sich, dass für eine pulmonale Soforttypallergie in einem Asthmamodell in der Maus erfolgreich eine SIT etabliert werden konnte, die in einer Reihe von Parametern mit einer SIT im Menschen vergleichbar ist. Dies ist das erste Modell einer pulmonalen Soforttypallergie in der Maus, an dem neben den Wirkprinzipien der SIT auch neue Therapiestrategien untersucht werden können. Eine Behandlung mit SIT in Kombination mit einem immunmodulatorisch wirksamen IL-4/IL-13 Antagonisten zeigte jedoch keinen zusätzlichen therapeutischen Nutzen, welches die scheinbar untergeordnete Rolle der Zytokine IL-4 und IL-13 bei etablierten Allergien untermauert.